一种纳米结构人工酶信号探针的多通道Fibrin检测方法与流程

本发明涉及医疗检测技术领域，尤其涉及一种纳米结构人工酶信号探针的多通道fibrin检测方法。

背景技术：

肿瘤是威胁人们生命健康的主要疾病之一，并且恶性肿瘤的发病率逐年增加，所以肿瘤细胞的高效筛查、诊断与治疗成为了关键因素，而纤维蛋白的检测对于癌细胞的早期筛查有着重要的意义，通过研究表明，恶性肿瘤细胞间质中含有高浓度纤维网状结构的纤维蛋白，并且能够使得血管的通透性变大，血浆蛋白渗出的间质形成纤维蛋白，从而给癌细胞的生长与转移提供了良好的条件。目前检测纤维蛋白的方法主要是萤光成像、乳胶凝集、酶联免疫法。荧光成像法虽然检测灵敏度高，但由于需要使用自发荧光物质和血红蛋白的吸收从而限制了其在活体细胞中的应用。乳胶凝集法因其具有良好的稳定性和较高的灵敏度是检测纤维蛋白最常用的方法，但是由于特异性较差、操作比较繁琐从而限制了其在临床诊断中的应用。酶联免疫吸附法采用生物酶，使其具有较高的特异选择性，但是采用的生物酶存在价格昂贵、结构复杂、易变性失活且不易保存等缺点，不易于临床上对纤维蛋白进行检测。因此探求更精准、高效灵敏的检测方法仍然是个挑战。电化学免疫生物传感器能够将目标识别元件中的化学变化量转变成与检测物浓度有关的电信号，并通过检测仪进行处理与显示，以便更直观的展示检测结果。辣根过氧化物酶因其具有稳定性好、效率高、可商品化等优点，是目前电化学生物传感器最常用的放大信号酶之一，然而由于它在界面上不可控性以及无序性使得它不容易控制从而导致酶反应效率不高，因此迫切需要一种稳定性好、可控性强的人工酶。

dna四面体纳米结构在2004年首次被开发就引起了人们极大的兴趣，它是利用互补配对原则，将各链自动杂交组合而形成的具有四面体形状的dna三维立体纳米结构，每个dna四面体结构至少是由四条ssdna单链构成，dna四面体相对于单链dna探针具有较好的稳定性及特异性。dna四面体纳米结构与生物传感器相结合，具有响应快、使用方便、成本低等特点。而g-四链体是一段含有g碱基序列的dna，它能够与血红素(hemin)结合，形成类似于hrp酶活性的hemin/g4-dnazyme。本研究构建了基于dna四面体核酸框架和g-四链体的一种新型人工酶(tetrazyme)，将该新型人工酶与纤维蛋白的适配体-归巢肽(creka)化学键共价结合,用于纤维蛋白的高灵敏检测电化学生物传感器的信号放大。相比传统的检测方法，该免疫传感器检测灵敏度高，检测时间短，成本低，既可以对单一样品进行大规模的重复检测，也能够对不同的样品同时进行分组测量，为临床检验提供了一种高效便捷的方法。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种纳米结构人工酶信号探针的多通道fibrin检测方法，引用了电化学免疫传感器中的16通道丝网印刷碳电极，先将fibrin孵育到碳电极上面，然后再将新型的人工酶修饰到fibrin里面进行反应，只需两步就能够对所需的蛋白进行检测，这种传感器与传统的检测方法相比制备时间大大缩减，特异靶向性和稳定性都明显提高，并且降低了实验成本，为纤维蛋白的检测提供了一个简便、高灵敏度、高选择性、廉价的检测方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种纳米结构人工酶信号探针的多通道fibrin检测方法，包括以下步骤：

步骤1、具有类hrp活性的新型人工酶；

步骤2、以免疫电极为工作电极，碳电极为对电极，agcl电极为参比电极，取出电极条，用milli-q水冲洗电极表面，再用氮气吹干残留的水珠；

步骤3、在电极通道上滴入纤维蛋白37℃反应2h，用1×pbs缓冲溶液冲洗，氮气吹干，再取30μl2％的bsa溶液滴在电极表面37℃封闭30min，用1×pbs缓冲溶液冲洗，氮气吹干，再将制备好的信号探针人工酶滴加10μl到电极通道上，37℃孵育2.5h，用1×pbs缓冲溶液冲洗，氮气吹干，将底物tmb滴在吹干后的电极表面；

步骤4、用电化学检测仪器以循环伏安曲线法和稳态时间-电流曲线法进行电化学表征，以检测所制作电极的灵敏度。

进一步地，所述步骤1合成新型人工酶具体步骤为：

步骤1、取100μm的tetra-a-nh2、tetra-b-g4、tetra-c-g4、tetra-d-g4四条单链各2μl和12μl的tmk缓冲液均匀混合，溶液放置pcr仪，95℃加热5min，迅速降温到4℃，持续30s以上，得到终浓度为10μm的dna四面体/g4信号探针；

步骤2、用q水将归巢肽(creka)配制成5mg/ml的溶液，再称取3.1mg(15mm)的edc与8.9mg(80mm)的nhs加入溶液中37℃活化处理30min，取其溶液与dna四面体、hemin(5mm)、tmk(10×)、q水按比例混合，摇床箱中，37℃反应3h，摇床速度300rpm，形成具有类hrp活性的新型人工酶。

进一步地，所述稳态-时间电流曲线法测量的电位为0v，检测时间为100s。

进一步地，所述dna四面体在k⁺的诱导条件下形成稳定的g四链体，再将血红素(hemin)与g四链体相嵌合，形成稳定的g-quadruplex-hemindnazyme。

进一步地，所述dna四面体与归巢肽(creka)通过化学键共价结合形成具有类hrp活性的新型人工酶。

进一步地，所述电化学检测仪器包括梯度pcr仪、16通道电化学生物传感系统。

进一步地，所述免疫电极、碳电极、agcl电极均为16通道丝网印刷碳电极。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种简单的电化学免疫传感器平台与一种新型的dna四面体三维探针合成的人工酶，用于检测纤维蛋白，具有良好的稳定性和较强的穿透性及灵敏度，dna作为一种多功能的生物纳米材料，在纳米结构自组装、生物免疫传感器等领域有着突出的应用，dna四面体三维探针作为人工酶的骨架，给hemin/g4-dnazyme提供一个稳定的化学环境，而构建一种新型人工酶(tetrazyme)。人工酶中仅需要浓度为0.6μm的dna、80μm的creka就可以对纤维蛋白进行高效地检测。结果表面，该新型电化学检测方法能高效便捷的检测纤维蛋白且灵敏度高。另外，传统的电极一般只能够同一个电极检测单一的样品，而本方案中的电极印有16个工作电极，既可以对单一样品进行大规模的重复检测，也能够对不同的样品同时进行多组测量；采用多通道电化学组装技术，不仅能够提高检测的灵敏度还能在电极表面对抗体抗原进行固定。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是在-0.3～0.7v电势范围内，以0.1v/s的速度进行扫描，得出的循环伏安曲线图。

图2是人工酶催化电化学所形成的时间与电流的关系图。

图3是dna浓度对检测性能的优化图。

图4是归巢肽creka浓度检测性能的优化图。

图5是新型人工酶与碳电极上纤维蛋白反应时间的优化图。

图6是新型人工酶合成过程的温度优化图。

图7是以纤维蛋白的浓度为x轴，电流的大小为y轴，分析标准曲线的线性关系图。

图8是将浓度为50nm的fibrin、psa、cea分别滴在不同的电极通道上进行检测实验结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种纳米结构人工酶信号探针的多通道fibrin检测方法，具体为：

1.1仪器和试剂

梯度pcr仪(thermalcyclert100tm，bio-rad)，16通道电化学生物传感系统(浙江纳智汇生物科技有限公司)

归巢肽(creka,上海强耀生物科技有限公司)，3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb，neogen)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酸二亚胺盐酸盐(edc，国药集团化学试剂有限公司)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，氯化血红素(hemin,上海生物生工股份有限公司),纤维蛋白原(fibrinogen,上海生物生工股份有限公司)，凝血酶(thrombin,上海泰坦科技股份有限公司),gelred(上海李记生物科技有限公司)，10×pbs缓冲液(10mmna2hpo4，2mmkh2po4，37mmnacl和2.7mmkcl,ph7.4)，10×tmk缓冲液(20mmtris，50mmmgcl2和50mmkcl，ph8.0)。

1.2新型人工酶的合成

取100μm的tetra-a-nh2、tetra-b-g4、tetra-c-g4、tetra-d-g4四条单链各2μl和12μl的tmk缓冲液均匀混合，溶液放置pcr仪，95℃加热5min，迅速降温到4℃，持续30s以上，得到终浓度为10μm的dna四面体/g4信号探针；

用q水将归巢肽(creka)配制成5mg/ml的溶液，再称取3.1mg(15mm)的edc与8.9mg(80mm)的nhs加入溶液中37℃活化处理30min，取其溶液与dna四面体、hemin(5mm)、tmk(10×)、q水按比例混合，摇床箱中，37℃反应3h，摇床速度300rpm，形成具有类hrp活性的新型人工酶。

1.2实验步骤

实验采用的碳电极为三电极体系：以免疫电极为工作电极，碳电极为对电极，agcl电极为参比电极。取出电极条，用milli-q水冲洗电极表面，再用氮气吹干残留的水珠，以便去除电极表面的杂质与微生物带来的误差，保证了实验的准确性。

在电极通道上滴入纤维蛋白37℃反应2h，用1×pbs缓冲溶液冲洗，氮气吹干，再取30μl2％的bsa溶液滴在电极表面37℃封闭30min，用1×pbs缓冲溶液冲洗，氮气吹干，再将制备好的信号探针人工酶滴加10μl到电极通道上，37℃孵育2.5h，用1×pbs缓冲溶液冲洗，氮气吹干，将底物tmb滴在吹干后的电极表面，再用电化学检测仪器以循环伏安曲线法和稳态时间-电流曲线法进行电化学表征，以检测所制作电极的灵敏度。时间电流法测量的电位为0v，检测时间为100s，测试温度为室温。

1.2工作原理

首先通过物理吸附法将纤维蛋白固定到碳电极表面，以保证蛋白的活性不被破坏，其次将tetra-a-nh2，tetra-b-g4，tetra-c-g4和tetra-d-g4四条链与tmk缓冲液进行均匀混合形成dna四面体，相比dna单链探针，dna四面体是一种三维立体探针，具有更好的稳定性和特异性，dna四面体的三个顶点在k⁺的诱导下形成稳定的g-四聚体，可以与辅酶氯高铁血红素(hemin)结合，形成类似于hrp酶的活性hemin/g4-dnazyme，为了提高hemin/g4-dnazyme的催化活性，将dna四面体作为hemin/g4-dnazyme的骨架，为hemin/g4-dnazyme提供一个稳定的化学环境，而构建一种新型人工酶(tetrazyme)。然后将归巢肽溶液中加入edc与nhs进行羧基的活化30min，再将归巢肽溶液与tetrazyme混合反应2.5h，最后将混合物孵育到纤维蛋白上面，实现对纤维蛋白的高灵敏度检测。

2.结果与讨论

2.1新型人工酶电化学传感器条件优化

循环伏安曲线法(cv)与稳态时间电流法(it)是常见的电化学检测方法，循环伏安曲线法(cv)能够提供碳电极表面氧化还原反应的信息，稳态时间电流法(it)能够明显表征人工酶的催化过程，图1在-0.3～0.7v电势范围内，以0.1v/s的速度进行扫描，得出循环伏安曲线图。从图中可以发现在0.15v位置的还原峰电流值明显变大，并逐渐形成一对非对称性的氧化还原峰。这是由于碳电极表面发生了氧化还原反应，而其中的氧化还原反应源自人工酶催化过氧化氢，从而让催化电流快速的上升，最终形成一个明显变大的电催化峰值。从两组实验数据也能看得出来，浓度为100nm的fibrin产生电流值明显大于blank产生的电流值，从另一方面也说明人工酶与fibrin已经特异性结合。为了突出人工酶催化电化学所形成的时间与电流的关系，利用稳态时间电流-曲线法进行表征，实验在室温下进行测试，测定电压设定为0v，检测时间设定为100s，实验结果如图2所示，随着时间的增大，检测电流也随之增大，但是电流值很快会达到一个饱和值，也进一步说明了构建的电化学传感器能够明显的区分样本与空白对照。

2.2dna浓度对检测性能的优化

由上面2.1结论可知，同时含有dna、creka的新型人工酶对fibrin检测效果最佳，而人工酶中dna的浓度会对丝网印刷电极的性能产生重要的影响，因为dna四面体中的g四链体可以与血红素(hemin)结合产生hemin/g4-dnazyme，在反应过程中起到催化活性，为了研究新型人工酶中dna的含量对实验结果的影响做了如下实验：采用一系列不同浓度的dna四面体合成新型的人工酶再通过电化学进行检测，实验结果如图3所示，随着dna浓度的不断增加，电流值也随之增大直至处于饱和，而当dna浓度过高时会影响到人工酶的催化活性从而导致电流的减小，基于以上原因，对合成新型信号探针人工酶中dna四面体浓度进行考察，从而得到dna四面体浓度为0.6μm时为最佳值。

2.3归巢肽creka浓度检测性能的优化

基于归巢肽creka对纤维蛋白有着很强的特异性识别，可以干扰其他蛋白的影响，实验中将归巢肽creka与dna四面体通过化学键连接，然后再孵育到纤维蛋白上，这样既保证了人工酶的稳定的又使人工酶具有很强的特异性，与2.2一样在制备新型人工酶的过程中，为了保证新型人工酶对fibrin特异性识别的效果最佳，除了dna不同浓度进行试验外，还要对归巢肽creka浓度对实验结果进行了研究。如图4所示，随着归巢肽creka浓度的增加，电流值也随之变化，当归巢肽creka浓度为80μm时，电流值达到最大，但是当归巢肽的浓度过高时，它会与dna进行竞争直接导致dnazyme的减小，从而导致感应电流下降，当浓度为80μm时电流最大。

2.4新型人工酶与碳电极上纤维蛋白反应时间的优化

为了研究新型人工酶与纤维蛋白结合时间对检测结果的影响。对不同时间进行了探究。如图5所示，随着新型人工酶与纤维蛋白结合时间的增加，检测电流先增大后减小，这是因为tetrazyme在于靶蛋白特异性结合时，如果反应时间太短那么tetrazyme标记不充分、分布的范围也会不均匀，产生的电化学信号就会偏低，所以最初反应电流大小随着反应时间的增大而增大，当反应时间为2.5h时，检测电流达到最大，随后电流又开始变小，这是因为反应时间过长的话，tetrazyme与靶向蛋白的结合达到了饱和阶段后造成了非特异性的不良反应，从而检测的电流值会随之降低，综上所述，新型人工酶和碳电极上纤维蛋白的反应最佳时间为2.5h。

2.5新型人工酶合成过程的温度优化

dna四面体作为新型人工酶的骨架，它能够提高人工酶整体的催化活性和稳定性，因此dna四面体的性能对于人工酶有着重要的意义，而随着温度的变化，dna四面体的结构及其一系列生物、化学性质也会产生相应的变化，从而影响人工酶的使用特性，而合成生物功能化新型人工酶的过程中需要控制在合适的温度才能保证dna的性能不被破坏，以保证人工酶的效果达到最佳，因此实验对温度进行了探究，如图6可知，随着反应温度的升高，反应电流也随之增大，当温度达到37℃时，反应电流达到最大，但是当温度过高时，dna四面体的活性将会下降，从而对探针的使用产生严重的影响，因此选择37℃为实验反应的最佳温度。

2.6纤维蛋白的检测限和线性范围

为了研究人工酶对不同浓度纤维蛋白的检测影响，进行了实验探究，首先将纤维蛋白与凝血酶孵育1h形成纤维蛋白，再用标准品稀释液将纤维蛋白稀释成如下不同浓度10、20、30、40、50、60、80、100nm，以纤维蛋白的浓度为x轴，电流的大小为y轴，分析标准曲线的线性关系。由下面图7可知，随着纤维蛋白浓度的提高，反应电流也随之增大，当浓度在10～40nm之间提高时，感应电流增大幅度较大，而当浓度处于50～100nm之间时，电流的增大幅度明显变缓，结果表明，纤维蛋白浓度的对数-电流曲线在此浓度范围内有两个线性检测区间，分别是10～40nm，其线性回归方程为y＝0.01471x-0.01161(r²＝0.99082)，以及50～100nm，其线性回归方程为y＝0.0014x+0.63897(r²＝0.99758)，检测限为9.4nm，s/n≥3。

2.7检测纤维蛋白的特异性

特异性通常是衡量电化学免疫生物传感器可行性的重要指标之一，本课题研究电化学免疫传感器对fibrin、psa、cea、blank同时进行检测，实验将浓度为50nm的fibrin、psa、cea分别滴在不同的电极通道上进行检测，实验结果由图8可知，blank样品检测的信号值较低，而另外两个干扰物质psa、cea虽然得到了一定的信号值，但电流值明显小于fibrin，可见我们构建的电化学tetrazyme生物传感器具有很高的选择性，实验也进一步说明固定在免疫电极表面的人工酶成功捕获了fibrin，由此证明了该电化学免疫传感器具有较好的特异性，可以实现fibrin的特异性检测。

综上所述，本发明开发了一种基于tetrazyme结构的高灵敏度电化学传感器，并用于纤维蛋白的检测。这种电化学传感器采用dna四面体结构作为信号探针，相比dna单链具有更好的稳定性和特异性，在hemin的结合下形成具有类hrp酶活性的hemin/g4-dnazyme，而相比hrp酶其稳定性也得到了很大的改善，再将其与归巢肽通过化学键合成，形成对纤维蛋白具有特异靶向性的信号探针人工酶。在优化条件下，人工酶与碳电极上纤维蛋白的最佳反应时间为2.5h，信号探针人工酶中creka与dna四面体浓度为80μm与0.6μm时电流值最大，电化学传感器能够检测低至9.4nm的纤维蛋白，同时得到两组线性检测曲线，并且能够对目标蛋白进行特异性选择。因此，我们期待这种高灵敏度和选择性的电化学传感器能成为一种有前景的用于纤维蛋白检测的新方法，为肿瘤的筛查提供了广泛的研究前景。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。