一种用于蔬菜尾菜青贮发酵的植物乳杆菌C20及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种植物乳杆菌菌株，具体为一种用于蔬菜尾菜青贮发酵的植物乳杆菌c20及其应用。

背景技术：

尾菜是指蔬菜采收后，经修整、分级、预冷、包装等商品化处理后，为提高其商品性而剥离的蔬菜伤、病、残叶。尾菜的无序排放和大量堆积，造成严重的资源浪费和环境污染。青贮是解决这一环境问题、合理利用尾菜资源的有效手段，如何尾菜提高青贮品质也成为了目前热门的研究课题。

植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)是乳酸菌的一种，也是青贮过程中的优势菌群。大量研究表明，植物乳杆菌能否在青贮过程中大量繁殖，是影响青贮饲料营养品质的关键。在青贮环境中植物乳杆菌大量繁殖，产生乳酸，降低ph，抑制其它腐败微生物的活动，使饲料的纤维含量下降3％～6％，粗蛋白含量提高0.5％～2％，从而延长饲料保藏期，提高饲料适口性和消化率，改善饲料品质。植物乳杆菌菌株本身的产酸能力、耐酸能力、耐高温能力和抑菌能力等发酵特性的强弱是菌株能否大量繁殖成为优势菌群、发挥作用的决定性因素。因此，从尾菜中分离筛选到具有良好发酵特性的植物乳杆菌制成青贮饲料添加剂对尾菜青贮饲料营养品质的提升具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株分离自莴笋尾菜的植物乳杆菌，其具有产酸、耐酸、耐高温和抗菌特性，旨在提高蔬菜尾菜青贮饲料的营养品质，为蔬菜尾菜资源的合理利用找到更优方法，解决目前青贮乳酸菌添加剂菌种功能单一、品性退化的现状。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明提供的一种具有良好的发酵特性的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)c20，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2019年12月2日；保藏编号为cctccno：m2019985。

本发明植物乳杆菌c20的16srrna序列如seqidno.1所示。

本发明从莴笋尾菜分离得到的植物乳杆菌c20，菌落形状呈圆形突起，表面光滑，边缘整齐，乳白色，不透明，革兰氏染色阳性，接触酶试验阴性，明胶液化试验阳性，兼性厌氧。

本发明的另一目的在于提供一种所述植物乳杆菌c20的分离方法，所述分离方法为收集废弃的莴笋尾菜，厌氧发酵15天后进行植物乳杆菌的分离。

本发明的另一目的在于提供一种所述植物乳杆菌c20的鉴定方法，所述鉴定方法包括：对植物乳杆菌的产酸特性、耐酸特性、耐高温特性和抑菌特性进行测定分析。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述植物乳杆菌c20制备的发酵液，所述制备方法包括：将植物乳杆菌c20活化后接种于mrs液体培养基中，37℃，120r/min的恒温摇床中培养，培养48h后，作为种子液以体积比1:1加入mrs液体培养基，30℃，120r/min的恒温摇床中培养48h使其活菌数达到1×10⁸cfu/ml，取出备用。

本发明的另一目的在于提供所述的植物乳杆菌c20或其发酵液在蔬菜尾菜青贮发酵中的应用。

进一步的，所述的应用包括如下步骤：

(1)青贮原料及添加剂的准备

青贮原料包括莴笋尾菜、水稻秸秆和麸皮，添加剂为糖蜜。将收集到的莴笋尾菜和晒干的水稻秸秆切成2cm的小段，糖蜜按体积比1:2比例加水稀释，然后将莴笋尾菜、水稻秸秆和麸皮按质量比100:15:15混合均匀，糖蜜按照与水稻秸秆体积质量比1:1的量添加混合均匀。

(2)菌株发酵液的添加

将体积比1:20比例稀释的c20菌株的发酵液采用喷洒的方式均匀喷施于青贮原料表面，每100g喷施5ml，再次混匀。

(3)真空包装发酵

将经上述处理的青贮原料装入包装袋中，用真空包装机抽真空后封口贮藏于避光的28℃环境中，青贮时间60天。

本发明的有益效果为：

本发明提供的植物乳杆菌c20具有良好的产酸、耐酸、耐高温和抗菌能力。该菌株发酵液作为青贮添加剂，提升了饲料的感官品质，提高了饲料的乳酸含量，降低了饲料的ph值，降低了乙酸、丙酸和丁酸含量，使青贮饲料不易腐败变质，提高饲料稳定性；提高饲料中可溶性碳水化合物、粗蛋白和粗脂肪的含量，降低氨态氮含量，有效防止了饲料中蛋白质的降解及营养物质的流失；降低了饲料中中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量，改善饲料的适口性。在提升青贮饲料营养品质、提高饲料适口性和消化率等方面具有很好的应用价值。

附图说明

图1是本发明基于植物乳杆菌c2016srrna基因的系统发育树图谱；

图2是添加与未添加本发明菌株c20的青贮饲料；其中ck为未接种c20的青贮饲料，lab为接种c20的青贮饲料。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1植物乳杆菌c20的分离与鉴定

1.1蔬菜尾菜选择

本实施例蔬菜尾菜分别采自甘孜州(康定、道孚、泸定和丹巴)，成都平原地区(包括郫县、彭州、新津、都江堰和邛崃)和凉山州地区(攀枝花、西昌和冕宁)等相关城市收集当地蔬菜基地和农贸市场的莴笋尾菜叶片。随机选取未腐败变质的白菜青菜尾菜叶片，装入灭菌密封塑料袋，贴上标签，于冰盒中及时带回实验室，4℃保存。

1.2蔬菜尾菜中乳酸菌的分离

将收集的尾菜用自来水清洗去除其上的泥土及农药残留等物质，之后取部分样品将其切割至2-3cm并晾干至含水量为60％左右，置于塑料袋中，并用真空包装机抽至真空、封口，厌氧发酵15-20天。

称取10g发酵好的尾菜样品，加入到装有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，震荡30min后，吸取菌液进行10倍梯度稀释，得到10^-3、10^-4、10^-5和10^-6四个稀释度，从每个稀释度中吸取1ml菌液至无菌的平板中，每个稀释度重复三次。将冷却至60℃的mrs(含2％caco3)培养基倒入平板中，混匀，在厌氧环境中37℃培养48h，挑取有溶钙圈的菌落，在mrs平板上反复划线分离，直到得到纯菌株。将纯化的菌株保存于50％的甘油中和半固体mrs培养基中，用于后续实验。从尾菜样品中共分离得到64株乳酸菌(表1)。

表1分离得到64株乳酸菌

1.3植物乳杆菌c20的鉴定

其中，从尾菜样品分离得到的植物乳杆菌c20，菌落形状呈圆形突起，表面光滑，边缘整齐，乳白色，不透明，革兰氏染色阳性，接触酶试验阴性，明胶液化试验阳性，兼性厌氧。琼脂糖凝胶电泳结果显示，该菌株16srrna基因扩增片段大小约为1500bp，测得的序列如seqidno.1所示。

系统发育分析显示菌株c20与ncbi已收录的植物乳杆菌和同源性均为100％(图1)，基于该菌的理化性质和16srrna基因系统发育树，可以确定该菌为植物乳杆菌。

基于以上特征，将菌株c20鉴定为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)。该菌株已于2019年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)(地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内)，保藏号为cctccno：m2019985。

实施例2乳酸菌产酸特性的测定

将已分离菌株在mrs液体培养基中活化后，取10μl接入5mlmrs液体培养基中，37℃条件下培养24h，以未接菌的培养基作为对照，用ph计测定并记录ph。根据前后ph值变化，判断各乳酸菌菌株产酸特性的强弱，具体结果见表2。

表2蔬菜尾菜乳酸菌的产酸特性

结果显示，分离到的64株乳酸菌中有31株在37℃培养24h后使mrs培养基的ph值由6.4降到了4.0以下(未接乳酸菌的空白对照mrs培养基24h后ph为6.4)，δph>2.4。c20的δph为3.0，产酸能力较强。

实施例3乳酸菌耐酸特性的测定

用1mol/l的盐酸分别将mrs液体培养基ph调为3.0和2.5。将活化后的菌液10μl分别接入5mlph3.0和ph2.5的mrs液体培养基中，置于37℃恒温箱培养24h后，测定od600值，记录下生长良好的菌株编号，由此判断分离菌株在ph3.0和ph2.5条件下的活性，所有菌株的耐酸特性见表3。

表3蔬菜尾菜乳酸菌的耐酸特性

注：“+”代表能正常生长；“-”表示不能正常生长。

结果显示，64株乳酸菌中在培养基ph3.0条件下能成功生长的菌株有36株，其中c20能够正常生长，耐酸能力较强。

实施例4蔬菜尾菜乳酸菌耐高温特性的测定

将活化后的菌液10μl接种在mrs固体培养基上，在45℃条件下培养24h，观察各菌株生长情况，选出耐45℃高温的菌株。筛选的菌株按以上操作方法，在50℃条件下培养24h，根据其生长情况筛选出耐50℃高温的菌株，具体结果如表4。

表4蔬菜尾菜乳酸菌的耐高温特性

注：“+”代表能正常生长；“-”表示不能正常生长。

结果显示，经过45℃条件的筛选培养48h后，在64株乳酸菌中有10株成功生长，表现出对高温一定的耐受能力，而对50℃温度耐受的菌株则只有5株，其中c20能耐受50℃高温。

实施例5蔬菜尾菜乳酸菌抗菌特性的测定

本试验以大肠杆菌为指示菌，通过平板扩散法，以抑菌圈直径评价各菌株抗菌特性的强弱，结果见表5。结果表明，分离到的64株乳酸菌有14株产生的抑菌圈直径在12.00mm以上，抑菌效果较强，其中c20的抑菌圈直径为13.84mm，抗菌能力很强。

表5蔬菜尾菜乳酸菌的抗菌特性

注：“-”表示未产生抑菌圈。

综合各项发酵品质指标，菌株c20产酸能力、耐酸能力、耐高温能力与抗菌能力均较强，故选择菌株c20用于制备青贮添加剂用于后续青贮发酵试验。

实施例6植物乳杆菌c20在蔬菜尾菜青贮发酵中的应用

1.1植物乳杆菌发酵液的制作

将筛选得到的植物乳杆菌c20活化后接种于mrs液体培养基中，37℃，120r/min的恒温摇床中培养，培养48h后，作为种子液以1:1比例加入mrs液体培养基，30℃，120r/min的恒温摇床中培养48h使其活菌数达到1×10⁸cfu/ml，取出备用。

1.2发酵液在蔬菜尾菜青贮发酵中的应用

(1)青贮原料及添加剂的准备

青贮原料和添加剂包括莴笋尾菜、水稻秸秆、麸皮和糖蜜。将收集到的莴笋尾菜和晒干的水稻秸秆切成2cm的小段，糖蜜按1:2比例加水稀释，然后将莴笋尾菜、水稻秸秆、麸皮和糖蜜按质量比(糖蜜为质量体积比)100:15:15:15混合均匀。

(2)菌株发酵液的添加

将按1:20比例稀释的c20菌株的发酵液采用喷洒的方式均匀喷施于青贮原料表面，每100g喷施5ml，再次混匀。以不喷施发酵液的作为ck组，喷施发酵液的为lab组。

(3)真空包装发酵

将经上述处理的青贮原料装入包装袋中，用真空包装机抽真空后封口贮藏于避光的28℃环境中，青贮时间60天。

(4)青贮品质分析

青贮结束后，取适当样品对其感官品质、化学成分及营养品质进行分析、评价，具体结果见图2和表6。结果显示，感官品质上，lab组较ck组酸味更浓，且ck组有刺鼻的氨味，而lab组则未出现明显氨味；化学成分上，添加了乳酸菌菌剂的lab组，ph、氨态氮、乙酸、丙酸和丁酸含量较未添加乳酸菌菌剂的ck组有所降低，而乳酸和氨基酸含量则高于ck组；营养品质上，添加乳酸菌菌剂提高了青贮饲料粗蛋白、粗脂肪和可溶性碳水化合物含量，降低了干物质、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维和粗灰分含量。

表6青贮饲料样品感官品质、化学成分及营养品质评价

注：“tn”为全氮含量；“dm”为样品干重；“fm”为样品鲜重。

综上所述，菌株c20发酵液作为尾菜青贮饲料添加剂，可以提升饲料的感官品质，提高饲料的乳酸和氨基酸含量，降低饲料的ph、乙酸、丙酸和丁酸含量，使青贮饲料不易腐败变质，提高饲料稳定性；提高饲料中可溶性碳水化合物、粗蛋白和粗脂肪的含量，降低氨态氮含量，有效防止饲料中蛋白质的降解及营养物质的流失；降低了饲料中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量，改善饲料的适口性。菌株c20在提升蔬菜尾菜青贮饲料营养品质、提高饲料适口性和消化率等方面具有很好的应用价值。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110>四川农业大学四川省烟草公司攀枝花市公司

<120>一种用于蔬菜尾菜青贮发酵的植物乳杆菌c20及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1448

<212>dna

<213>植物乳杆菌c20(lactobacillusplantarumc20)

<400>1

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