2型糖尿病单核苷酸多态性C502A的Sidt2基因检测方法和试剂盒与流程

本发明属于医疗技术检测方法，尤其涉及2型糖尿病单核苷酸多态性c502a的sidt2基因检测方法和试剂盒。

背景技术：

跨膜家族成员sid12(sidt2)已被证实为溶酶体膜蛋白。sidt2基因敲除小鼠糖耐量受损。因此，sidt2基因可能与糖尿病的发生有关。我们调查了2型糖尿病患者的dna序列是否比正常人有snp，如果有，两组2型糖尿病患者与正常对照组之间是否有统计学意义。方法:从全血中提取dna的2型糖尿病患者和正常对照组,使用的模板,三对引物设计根据sidt2的启动子序列,pcr产品送去测序,2型糖尿病患者的三对引物测序结果与正常对照组的结果相比,寻找snp,snp的统计分析结果发现三个多态性位点a1521g,g1816a,c502a。其中a1521g和g1816a的等位基因频率和基因型分布在两组间均无显著性差异。c502a的snp具有统计学意义。sidt2基因多态性的c502a与中国汉族人群2型糖尿病相关，而ca基因型可能增加中国汉族人群2型糖尿病的发病风险，鉴于上述发现，实有必要必要设计2型糖尿病单核苷酸多态性c502a的sidt2基因检测方法和试剂盒。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于：提供2型糖尿病单核苷酸多态性c502a的sidt2基因检测方法和试剂盒，来解决背景技术提出的问题。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：2型糖尿病单核苷酸多态性c502a的sidt2基因检测方法，包括如下步骤：

1.一种引物对，所述引物对是引物809、引物791、引物324所示的核昔酸序列，其特征在于:所述引物对用于检测sidt2基因启动子区c502a位点。

2.一种用于检测sidt2启动子基因序列相关位点的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、提取全基因组dna；

b、根据sidt2启动子基因序列及位点设计引物对,对提取的全基因组dna进行pcr扩增；

c、对pcr产物进行测序，并分析测序结果来判断sidt2启动子基因是否发生突变。

3.一种用于检测sidt2启动子基因序列的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括基因组

dna抽提试剂盒、pcr反应试剂盒、和控温装置。

4.所述试剂盒内设有托架,所述托架设有2个凹槽容纳腔,2个凹槽容纳腔内分别放置基因

组dna抽提试剂盒、pcr反应试剂盒。

5.所述凹槽容纳腔的内周向侧壁设有缓冲结构。

6.所述试剂盒内设有控温装置。

本发明的有益效果:本发明首次发现了sidt2基因的启动子区c502a位点是2型糖尿病相关位点，设计特异性的引物，提取人的全血样本中的全基因组dna模板进行pcr扩增，并对扩增产物进行测序,该检测方法设计巧妙、操作较简单、检测结果也可靠准确，根据检测方法设计出的相关试剂盒简便易操作。使用本试剂盒检测c502a位点，从而监控疾病的发生与发展。如果是2型糖尿病易感人群，除了要预防2型糖尿病的外在致病因素，还要按时完善相关临床的检查，比如空腹血糖、餐后血糖等,做到早预防，早发现,早治疗。通过本试剂盒的发明设计，可以更利于检测试验的进行，另外，试剂盒内的控温装置，也有助于确保试剂盒内sidt2基因样本的恒温性。此外，医护人员可将控温机构取出，再将现有技术的y型管与该装置内部左右两侧的安装孔相连接，再通过现有技术抽气泵与y型管的配合使用，可将试剂盒处于真空环境中进行放置，以此防止试剂盒外壁处的细菌滋生，对试剂盒内存放的基因起到保护作用。缓冲结构的设置,便于放置物较好的固定在凹槽容纳腔内，使得其在运输过程中不会轻晃动，从而避免造成凹槽容纳腔内放置物破损情况的发生。

附图说明

图1是2型糖尿病单核苷酸多态性c502a的sidt2基因检测方法的流程图；

图2是sidt2启动子区域设计了三对引物；

图3是本发明试剂盒的内部结构3d剖视图。图中标记为：1、基因抽取试剂盒，2、反应试剂盒，3、控温装置

具体实施方式

下面对照附图，通过对实施例的描述,对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，目的是帮助本领域的技术人员对本发明的构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解，并有助于其实施。

1.基因组dna提取：

从全血中提取基因组dna

1.1取200ul的抗凝全血到1.5ml的eppendorf管中，若样本量少于200ul,则需要加入缓冲液gs补充至200ul，如果样本量多于200ul,需要用细胞裂解液cl进行处理，具体操作步骤如下：在样品中加入1至2.5倍体积的细胞裂解液cl,颠倒混匀，10000rpm离心1分钟,弃上清，留下细胞核沉淀(如果裂解的不彻底，可重复上述步骤一次)，向细胞核沉淀中加200ul的缓冲液gs,振荡至彻底混匀。

1.2加入20ul的蛋白酶k溶液，混匀，再加入200ul的缓冲液gb,立刻充分颠倒混匀。56℃水浴样本10分钟，水浴过程中请每隔3分钟上下轻柔颠倒混匀样本，溶液应变清亮。(如溶液未彻底变清亮，可延长裂解时间至溶液彻底变清亮为止)。

1.3加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀,这时可能会出现絮状的沉淀。

1.4将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13,400xg)离心30秒,倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

1.5向吸附柱中加入500ul缓冲液gd(使用前需要先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13,400xg)离心30秒,倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

1.6向吸附柱中加入700ul漂洗液pw(使用前需先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13,400xg)离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。

1.7向吸附柱中加入500ul漂洗液pw,12000rpm(～13,400xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液。1.8将吸附柱放回收集管中,12000rpm(～13,400xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以便彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

1.9将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液tb,室温放置2-5分钟，再12000rpm(～13,400xg)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。注意:洗脱缓冲液体积不应少于50ul,因为体积过小会影响回收效率。为增加基因组dna的得到率,可将离心得到的溶液再重新加入吸附柱中，室温放置2分钟,12000rpm～13,400xg离心2分钟。洗脱液的ph对于洗脱效率会有很大影响。若用水做洗脱液应保证其ph值在7.0-8.5范围内(可以用naoh将水的ph值调至此范围)，ph值低于7.0会降低洗脱效率；最后得到的dna产物应保存在-20℃,以防止dna降解。

2.基因目的片段扩增：

2.1进行pcr反应：将sidt2启动子分为三对引物，三对引物以扩增长度命名。他们分别被命名为809,791,324。引物采用premierprimer5软件设计。

2.2pcr总反应体系总共25ul，其中2xtaqpcrmastermix12.5ul，上游引物1ul，下游引物1ul,dna模板1ul，剩余体积部分用双蒸馏水补充至25ul。

2.3pcr扩增条件为:95℃预变性5min,95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环，72℃延伸10min。反应产物长度分别为809bp、791bp、324bp。

2.4pcr产物在应用生物系统自动测序仪上直接测序(型号3730,bgi,shanghai,china)；

3.结果分析

将测序导出的abl格式的测序文件导出后，使用clustalx2软件进行分析。通过分析测序结果，我们发现在sidt2启动子区域有3个snps。它们分别是g1816a、a1521g和c502a。g1816a和a1512g的等位基因频率和基因型分布在t2dm患者和健康对照组之间无统计学差异。在c502a的研究中，我们发现在t2dm患者中，有88名患者(88％)具有c/c基因型，11名患者(11％)具有c/a基因型，1名患者(1％)具有a/a基因型。而在健康对照组中，100名健康对照组(100％)有c/c基因型，而没有c/a基因型。提示ca基因型可能增加中国汉族人群患2型糖尿病的风险。根据上述检测结果，可以判断上述受检的sidt2基因异常，受检者较正常人患2型糖尿病的几率明显升高，但是是否已经患有2型糖尿病,还需要进行进一步的2型糖尿病检查，并进行专门的针对性的健康管理。

如图3所示，根据检测方法涉及出相应的试剂盒,试剂盒内包括基因组dna抽提试剂盒1、pcr反应试剂盒2。

作为进一步的改进,该试剂盒内还设有控温装置3,能够使试剂盒在运输过程，或者在取出试剂做实验的过程中保持试剂盒中的试剂一直维持在实验所需要的温度。医护人员可将控温机构取出，再将现有技术的y型管与该装置内部左右两侧的安装孔相连接，再通过现有技术抽气泵与y型管的配合使用，可将试剂盒处于真空环境中进行放置，以此防止试剂盒外壁处的细菌滋生，对试剂盒内存放的基因起到保护作用。

为了便于放置上述反应所需要使用的小试剂盒，并且也便于统一取出或者统一放置于本发明试剂盒内部，所以试剂盒内设有托架，托架设有2个凹槽容纳腔，2个凹槽容纳腔内分别放置所述基因组dna抽提试剂盒1、pcr反应试剂盒2。每一个凹槽容纳腔下面最好还应该设有一个对应的标明放置物名称的标签。

凹槽容纳腔的内周向侧壁设有缓冲结构。缓冲结构优选采用海绵垫，使放置物能够较好的固定在凹槽内，在运输过程中不会轻易晃动，避免试剂盒在移动过程中发生凹槽内放置物破损的情况,并且海绵垫还具有一定的保温效果。

综上所述,本发明的检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，设计的试剂盒使用简便可行,为是否进一步采取有针对性的健康管理以及后续的检测手段提供参考依据。

本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所做出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。