1.一种用于靶向敲除人mc1r基因的sgrna,其包括sgrna1和sgrna2,所述sgrna1和所述sgrna2的核苷酸序列如下:
a、sgrna1:ctgagggcggccacatgccgggg(seqidno:1)
b、sgrna2:agacggagtgtcccaggagtggg(seqidno:2)。
2.一种用于靶向敲除人mc1r基因的grna表达载体,该grna表达载体包括包含权利要求1所述sgrna1的dna序列的grna表达载体和包含权利要求1所述sgrna2的dna序列的grna表达载体。
3.权利要求2所述grna表达载体的构建方法,其包括:分别扩增权利要求1所述sgrna1和所述sgrna2、退火获得各自的双链dna片段,通过dna连接酶将各自的双链dna片段分别连接到质粒载体上获得各自的grna表达载体。
4.一种扩增权利要求1所述sgrna的引物,其引物的序列包括:
扩增sgrna1的引物序列:
crispr-f1:5’-caccgctgagggcggccacatgccgggg-3’(seqidno:3)
crispr-r1:5’-cccccggcatgtggccgccctcagcaaa-3’(seqidno:4);
扩增sgrna2的引物序列:
crispr-f2:5’-caccgagacggagtgtcccaggagtggg-3’(seqidno:5)
crispr-r2:5’-ccccactcctgggacactccgtctcaaa-3’(seqidno:6)。
5.一种用于敲除人mc1r基因的试剂盒,该试剂盒包括权利要求4所述的引物。
6.一种crispr-cas9系统,该crispr-cas9系统包括权利要求2所述grna表达载体和cas9质粒。
7.一种用于构建人mc1r基因敲除的细胞株的试剂盒,该试剂盒包括权利要求1所述sgrna1构建的grna表达载体体外转录的mrna、权利要求1所述sgrna2构建的grna表达载体体外转录的mrna。
8.一种人mc1r基因敲除的细胞株的构建方法,其包括如下步骤:
将权利要求1所述sgrna1构建的grna表达载体体外转录的mrna、权利要求1所述sgrna2构建的grna表达载体体外转录的mrna和cas9质粒体外转录的mrna一并电转入宿主细胞中,然后进行单克隆培养并进行pcr鉴定;
将pcr鉴定正确的阳性克隆进行扩增冻存,完成敲除细胞株的构建;
优选地,所述宿主细胞包括肿瘤细胞株;优选地,所述肿瘤细胞株包括肺癌细胞株;优选地,所述肺癌细胞株包括a549细胞株;
优选地,所述sgrna1、所述sgrna2分别构建的grna表达载体体外转录采用mmessagemmachinetmt7ultratranscriptionkit试剂盒;
优选地,所述cas9质粒体外转录采用megashortscripttmt7transcriptionkit试剂盒;
优选地,在进行电转入宿主细胞中时,所述sgrna1构建的grna表达载体体外转录的mrna和所述sgrna2构建的grna表达载体体外转录的mrna的总质量与cas9质粒转录所得的mrna质量比为1:(1~3);
优选地,所述sgrna1构建的grna表达载体体外转录的mrna和所述sgrna2构建的grna表达载体体外转录的mrna的质量比为1:1。
9.一种人mc1r基因敲除的a549细胞株。
10.权利要求9所述人mc1r基因敲除的a549细胞株作为细胞模型在研究肤色调控机制、相关多肽筛选和相关皮肤疾病中的应用。