靶向敲除人MC1R基因的sgRNA及其构建的细胞株的制作方法

文档序号:20989710发布日期:2020-06-05 21:34阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于靶向敲除人mc1r基因的sgrna,其包括sgrna1和sgrna2,所述sgrna1和所述sgrna2的核苷酸序列如下:

a、sgrna1:ctgagggcggccacatgccgggg(seqidno:1)

b、sgrna2:agacggagtgtcccaggagtggg(seqidno:2)。

2.一种用于靶向敲除人mc1r基因的grna表达载体,该grna表达载体包括包含权利要求1所述sgrna1的dna序列的grna表达载体和包含权利要求1所述sgrna2的dna序列的grna表达载体。

3.权利要求2所述grna表达载体的构建方法,其包括:分别扩增权利要求1所述sgrna1和所述sgrna2、退火获得各自的双链dna片段,通过dna连接酶将各自的双链dna片段分别连接到质粒载体上获得各自的grna表达载体。

4.一种扩增权利要求1所述sgrna的引物,其引物的序列包括:

扩增sgrna1的引物序列:

crispr-f1:5’-caccgctgagggcggccacatgccgggg-3’(seqidno:3)

crispr-r1:5’-cccccggcatgtggccgccctcagcaaa-3’(seqidno:4);

扩增sgrna2的引物序列:

crispr-f2:5’-caccgagacggagtgtcccaggagtggg-3’(seqidno:5)

crispr-r2:5’-ccccactcctgggacactccgtctcaaa-3’(seqidno:6)。

5.一种用于敲除人mc1r基因的试剂盒,该试剂盒包括权利要求4所述的引物。

6.一种crispr-cas9系统,该crispr-cas9系统包括权利要求2所述grna表达载体和cas9质粒。

7.一种用于构建人mc1r基因敲除的细胞株的试剂盒,该试剂盒包括权利要求1所述sgrna1构建的grna表达载体体外转录的mrna、权利要求1所述sgrna2构建的grna表达载体体外转录的mrna。

8.一种人mc1r基因敲除的细胞株的构建方法,其包括如下步骤:

将权利要求1所述sgrna1构建的grna表达载体体外转录的mrna、权利要求1所述sgrna2构建的grna表达载体体外转录的mrna和cas9质粒体外转录的mrna一并电转入宿主细胞中,然后进行单克隆培养并进行pcr鉴定;

将pcr鉴定正确的阳性克隆进行扩增冻存,完成敲除细胞株的构建;

优选地,所述宿主细胞包括肿瘤细胞株;优选地,所述肿瘤细胞株包括肺癌细胞株;优选地,所述肺癌细胞株包括a549细胞株;

优选地,所述sgrna1、所述sgrna2分别构建的grna表达载体体外转录采用mmessagemmachinetmt7ultratranscriptionkit试剂盒;

优选地,所述cas9质粒体外转录采用megashortscripttmt7transcriptionkit试剂盒;

优选地,在进行电转入宿主细胞中时,所述sgrna1构建的grna表达载体体外转录的mrna和所述sgrna2构建的grna表达载体体外转录的mrna的总质量与cas9质粒转录所得的mrna质量比为1:(1~3);

优选地,所述sgrna1构建的grna表达载体体外转录的mrna和所述sgrna2构建的grna表达载体体外转录的mrna的质量比为1:1。

9.一种人mc1r基因敲除的a549细胞株。

10.权利要求9所述人mc1r基因敲除的a549细胞株作为细胞模型在研究肤色调控机制、相关多肽筛选和相关皮肤疾病中的应用。


技术总结
本发明提供了一种靶向敲除人MC1R基因的sgRNA及其构建的细胞株。该sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2,sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的sgRNA能够精确指导Cas9蛋白靶向切割MC1R基因,采用该sgRNA构建获得的表达载体转录获得的mRNA电转细胞转化率高,极大提高了敲除MC1R基因的成功率,获得的A549细胞株能够稳定低表达黑素生成的相关蛋白,对于研究黑素生成及抑制相关多肽的筛选、以及黑色素生成及皮肤相关疾病治疗等有着十分重要的意义。

技术研发人员:梁强;支旭勃;赵金礼;杨小琳
受保护的技术使用者:陕西慧康生物科技有限责任公司
技术研发日:2020.04.01
技术公布日:2020.06.05
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