一种裙带菜孢子叶粘液的分离方法与流程

本发明涉及天然产物分离技术领域，具体涉及一种裙带菜孢子叶粘液的分离方法。

背景技术：

裙带菜孢子叶是海洋大型褐藻裙带菜的繁殖器官，位于裙带菜梗的基部，似木耳状，俗称“耳朵”。由于裙带菜孢子叶富含珍贵的海洋生物活性物质褐藻糖胶和褐藻胶等，而且活性物质品质优异，所以，裙带菜孢子叶成为提取褐藻糖胶和褐藻胶的重要原料。

褐藻糖胶(fucoidan)，也称作岩藻聚糖硫酸酯，具有显著的抑抗肿瘤功效，同时还具有抗凝血、降血脂、抗病毒、增强机体免疫机能等多种生物学活性，是当前海洋功能性食品和药物研究的热点，褐藻糖胶粉剂和含褐藻糖胶的饮品已经在国内外市场销售。而褐藻胶作为一种水溶性天然高分子化合物，可以用作增稠剂、分散剂、乳化剂、稳定剂、粘结剂、成膜剂、凝胶剂和离子交换剂，广泛应用于工农业生产的各方面。

酶解法是从裙带菜孢子叶提取褐藻糖胶和褐藻胶的主要方法，利用纤维素酶、果胶酶等制成复合酶制剂，分解裙带菜孢子叶中纤维素等束缚褐藻糖胶和褐藻胶释放的物质，然后分离收集纯化褐藻糖胶和褐藻胶。操作步骤包括将裙带菜孢子叶粉碎、浸泡、酶解、分离纯化等，过程中要将孢子叶全部处理。酶的用量是根据孢子叶干基或鲜品或冻鲜品重量按比例添加。由于酶制剂价格高昂，占褐藻糖胶和褐藻胶提取成本很大比例，所以节约酶制剂用量可以大幅度降低生产成本。

褐藻糖胶与褐藻胶等生物活性物质是以小滴状存在于裙带菜孢子叶粘液基质中。如果先将孢子叶粘液分离出来，再从粘液中提取褐藻糖胶等生物活性物质，酶制剂用量就会很少，甚至根本不用酶制剂，从而有效降低褐藻糖胶等活性物质的提取成本。所以，研究裙带菜孢子叶粘液的分离方法，对褐藻糖胶等生物活性物质的生产和研究具有重要实际意义。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种裙带菜孢子叶粘液的分离方法。采用本发明的方法可以使裙带菜孢子叶粘液从裙带菜孢子叶内部分泌出来并从孢子叶表面分离出来，从而可以利用裙带菜孢子叶粘液提取褐藻糖胶等，解决了直接从裙带菜孢子叶中提取褐藻糖胶、褐藻胶等生物活性物质所存在的酶用量大、成本高的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种裙带菜孢子叶粘液的分离方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜或冰鲜解冻后的裙带菜孢子叶放入淡水中清洗；

(2)将清洗后的裙带菜孢子叶取出，阴干0.5-3h后，放入粘液分离液中浸泡20-60min；浸泡结束后采用盐酸溶液调节粘液分离液的ph至5.0-6.5，取出裙带菜孢子叶，获得裙带菜孢子叶粘液；

所述粘液分离液由氢氧化钠溶液和碳酸钠溶液混合而成。

优选的，步骤(1)中，所述清洗具体为：搅拌清洗3-5分钟。淡水需没过孢子叶。

通过淡水清洗，可以有效去除裙带菜孢子叶表面沉积物、节肢动物等附着物，同时刺激孢子叶释放粘液。

优选的，步骤(2)中，所述阴干0.5-3h，阴干时光照强度不超过500lux。

通过对清洗后的裙带菜孢子液进行阴干处理，可以使裙带菜的孢子叶粘液从内部释放到孢子叶表面。阴干时间和阴干时的光照强度会影响孢子叶粘液从内部释放到孢子叶表面的释放效果，经试验考察，以阴干时间为0.5-3h，光照强度不超过500lux为宜。

优选的，步骤(2)中，所述粘液分离液由氢氧化钠溶液和碳酸钠溶液按体积比1:1混合而成。

优选的，步骤(2)中，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.02-0.10mol/l；所述碳酸钠溶液的浓度为0.01-0.05mol/l。

优选的，步骤(2)中，所述粘液分离液的用量为步骤(1)中新鲜或冰鲜解冻后的裙带菜孢子叶重量的3-6倍。

优选的，步骤(2)中，裙带菜孢子叶在粘液分离液中浸泡的过程中，每5min搅动一次。

粘液分离液是实现将裙带菜孢子叶粘液从裙带菜孢子叶上分离出来的关键，本发明优选氢氧化钠溶液和碳酸钠溶液的组合作为粘液分离液，并对氢氧化钠溶液和碳酸钠溶液的浓度进行了优化考察，最终得到了最优的粘液分离液组成，实现了将裙带菜孢子叶粘液从裙带菜孢子叶上的有效分离。

优选的，步骤(2)中，所述盐酸溶液浓度为1m。

将浸泡裙带菜孢子叶后的粘液分离液用盐酸溶液调节ph至5.0-6.5，一方面，加入盐酸后，孢子叶表面产生大量气泡，适当搅动，粘液就可以从孢子叶表面分离，达到很好的分离效果；另一方面，盐酸可以中和naoh与na2co3的碱性，保证粘液中活性成分的稳定。

本发明的第二方面，提供上述分离方法在褐藻糖胶和褐藻胶等活性物质生产中的用途。

本发明的第三方面，提供一种褐藻糖胶和褐藻胶的提取方法，包括以下步骤：

将上述分离方法获得的裙带菜孢子叶粘液，在90℃条件下抽提2-4h，降至室温后，第一次离心，分离得到第一上清液，向第一上清液中加入无水乙醇或95％乙醇至乙醇浓度为20％；第二次离心，得到第二上清液和沉淀，所述沉淀即为褐藻胶；

向第二上清液中加入无水乙醇或95％乙醇，所述无水乙醇或95％乙醇加入的量为第二上清液体积的2倍，第三次离心，收集沉淀，即提取得到褐藻糖胶。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过淡水清洗、阴干和在碱液中浸泡的方法，先使裙带菜孢子叶粘液从内部释放到孢子叶表面；再通过特定碱液和盐酸将裙带菜孢子叶粘液从裙带菜孢子叶上分离出来，从而可以利用裙带菜孢子叶粘液提取褐藻糖胶，避免了从裙带菜孢子叶中提取褐藻糖胶和褐藻胶时酶用量大、成本高的问题。

(2)本发明采用naoh与na2co3复配后的混合液作为粘液分离液处理裙带菜孢子叶，能够有效的将裙带菜孢子叶粘液分离出来，naoh与na2co3的用量都较小，可以避免藻体发绿、表面起绒状突起、粘液不易分离的情况；同时盐酸中和naoh与na2co3的碱性，保证粘液中活性成分稳定，而且中和过程中形成的气泡有利于粘液从孢子叶表面分离。

附图说明

图1：新鲜裙带菜孢子叶与较高浓度naoh处理的孢子叶颜色形态比较；其中，a为新鲜裙带菜孢子叶，外表光滑，呈黑褐色；b为用0.125mnaoh处理孢子叶，呈绿色，外表密布绒状突起，粘液不易脱落。

图2：单独使用naoh和综合使用naoh、na2co3处理新鲜裙带菜孢子叶的效果对比。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语说明：

本发明中的“淡水”是指含盐量小于0.5g/l的水。

正如背景技术所介绍的，褐藻糖胶和褐藻胶作为裙带菜孢子叶的活性成分，具有广泛的应用。目前对于褐藻糖胶和褐藻胶的提取，多采用酶解法处理裙带菜孢子叶，但存在酶用量多、提取成本高等问题。

基于此，本发明创造性的提出了先使裙带菜孢子叶粘液从孢子叶内部释放出来并从孢子叶表面分离出来，再利用裙带菜孢子叶粘液提取褐藻糖胶和褐藻胶的方案，有效解决了直接从裙带菜孢子叶中提取褐藻糖胶和褐藻胶所存在的酶用量大、成本高的问题。

本发明的思路创新性强，目前还未见有从裙带菜孢子叶中分离裙带菜孢子叶粘液的方法的相关报道。因此，本发明的技术方案具有很高的原创性。

由于现有技术中缺少可以借鉴的方案，因此，本发明首先从大量的试剂中筛选具有分离裙带菜孢子叶粘液的试剂，结果发现：氢氧化钠、磷酸三钠、碳酸钠等碱液有分离裙带菜孢子叶粘液的效果。但是，如果单纯利用naoh溶液处理裙带菜孢子叶分离裙带菜孢子叶粘液，naoh溶液的浓度不容易把握，浓度低时，粘液不容易从藻体表面分离脱落；naoh溶液浓度高时，藻体变绿，藻体表面形成毛茸茸的绒状突起(见图1，b)，粘液仍然不容易从藻体表面分离。若单纯用na2co3溶液处理裙带菜孢子叶分离孢子叶粘液，存在与单纯用naoh同样的问题，而且na2co3用量太大。磷酸钠也具有分离裙带菜孢子叶粘液的作用，但效果更差一些。

本发明进一步考察了不同试剂的组合对裙带菜孢子叶粘液的分离效果，结果发现：使用naoh与na2co3复合液处理裙带菜孢子叶，可达到很好的粘液分离效果。

naoh与na2co3组成的粘液分离液中，naoh与na2co3的浓度，对于裙带菜孢子叶粘液的分离效果有较大影响，其中：使用0.025mnaoh和0.01mna2co3按体积比1:1组成的粘液分离液(处理1)，处理裙带菜孢子叶效果最好，处理后孢子叶颜色浅黄褐色，半透明，叶片粘液基本脱落，浸泡液深黄色；使用0.02mnaoh和0.01mna2co3按体积比1:1组成的混合液进行浸泡处理(处理2)，处理后的孢子叶呈黄褐色，叶片上仍有粘液，浸泡液黄色；单独使用0.025mnaoh处理(处理3)，叶片呈黑褐色，但颜色较浅，叶片表面仍有大量粘液，浸泡液呈较深的黑褐色，分离粘液效果差于处理1；单独使用0.02mnaoh处理(处理4)，叶片呈黑褐色，颜色较处理3深一些，叶片表面残余粘液更多，浸泡液黄褐色(图2)。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

实施例1：

取收割期中期采集的新鲜裙带菜孢子叶500g，放入20l塑料桶中，向塑料桶中加入淡水10l，搅动清洗3分钟；

取出孢子叶，在20lux光照强度下控水阴干60分钟，粘液从孢子叶内部释放到孢子叶表面；

配制0.025mnaoh溶液1l，0.01mna2co3溶液1l，倒入10l聚乙烯桶中混匀，得到粘液分离液；

将阴干1h后的孢子叶在粘液分离液中浸泡30min，藻体不可露出液面，每5min搅动一次。

浸泡结束后，用1m的盐酸溶液调节粘液分离液的ph至6.0；搅动5min后从粘液分离液中捞出裙带菜孢子叶。

处理后的孢子叶呈半透明状，黄褐色；捞出裙带菜孢子叶后的浸泡液呈现黄褐色，裙带菜孢子叶粘液留在浸泡液中，与孢子叶分离，即获得裙带菜孢子叶粘液。

实施例2：

取收割期后期采集的新鲜裙带菜孢子叶1000g，放入20l塑料桶中，加入淡水10l，搅拌清洗4分钟；

取出孢子叶，控水阴干60分钟，粘液从孢子叶内部释放到孢子叶表面；

配制0.05mnaoh溶液2l，0.05mna2co3溶液2l，倒入10l聚乙烯桶中混匀，得到粘液分离液；

将阴干1h后的孢子叶浸入粘液分离液中浸泡60min，藻体不可露出液面，每5min搅动一次。

浸泡结束后，用1m的盐酸溶液调节粘液分离液的ph至6.0；搅动5min后从粘液分离液中捞出裙带菜孢子叶，裙带菜孢子叶粘液留在浸泡液中，与孢子叶分离，即获得裙带菜孢子叶粘液。

试验例：

将实施例1制备的裙带菜孢子叶粘液平均分成2份，其中一份用酶制剂提取褐藻胶和岩藻聚糖硫酸酯。

提取方法：加入纤维素酶、果胶酶的复合酶(复合酶中纤维素酶和果胶酶的重量比为1:1，复合酶的加入量为孢子叶鲜重的0.3％)，在ph6.0条件下酶解60min，然后90℃条件下用淡水抽提3h，降至室温后，离心得上清液；在上清液中加入无水乙醇至乙醇的体积浓度为20％，离心收集沉淀，所得沉淀为褐藻胶。

向离心后的上清液中进一步添加2倍的无水乙醇(此处的2倍是相对于加入无水乙醇前的上清液总体积)，离心收集沉淀，即提取得到岩藻聚糖硫酸酯。

另一份不加酶制剂，直接提取褐藻胶和岩藻聚糖硫酸酯。提取方法中除了不加入纤维素酶、果胶酶的复合酶外，其余步骤与酶制剂提取方法相同。

检测上述两种方法所提取的褐藻胶和岩藻聚糖硫酸酯的含量，具体检测方法如下：

1.褐藻胶(褐藻酸钠)含量测定—硫酸咔唑法

褐藻胶(褐藻酸钠)标准溶液的配制：0.1g褐藻酸钠溶解后用双蒸水定容至100ml，得到0.1％的标准液。配置80％的硫酸溶液，配置咔唑溶液。按照硫酸-咔唑法，以褐藻酸钠为标准品，采用分光光度法计算出标准曲线。

在冰水浴中，分别取80％浓硫酸9ml置于12个25ml的比色管中，再分别加入褐藻酸钠标准液0、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55ml，并加入双蒸水补齐至10ml摇匀，至室温后放入沸水浴中30分钟拿出。冷却5分钟后，分别加入0.5ml的咔唑溶液混匀，再在沸水浴中加热10分钟。拿出各比色管置于室温40分钟后，在530nm下用1cm的比色皿测出吸光度记为a值。以褐藻酸钠标准液的浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标作标准曲线。

称取1g样品加40ml双蒸水，65℃水浴锅加热2h，离心取上清液，稀释100倍。按照上述步骤，测其吸光度。利用标准曲线即可计算得出样品中的褐藻胶(褐藻酸钠)含量。

2.对于岩藻聚糖硫酸酯，主要是测量岩藻聚糖硫酸酯中多糖和硫酸基团含量，具体方法如下：

2.1用苯酚—硫酸法测定多糖含量：

标准曲线的制作：准确称取标准葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度。分别吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6及1.8ml，各以双蒸水补至2ml，然后加入6％(w/v)苯酚1ml及浓硫酸5.0ml，静止10min,摇匀，室温放置20min后，于490nm处测量吸光度,以2.0ml双蒸水按同样显色操作为空白，得标准曲线。

样品含量测定：取样品10mg，用双蒸水定容到100ml。吸取样品0.1ml，按上述步骤操作，测吸光度，以标准曲线计算样品糖含量。

2.2硫酸基团测定：用盐酸水解—硫酸钡重量法测定硫酸基团含量

标准曲线的制作：分别吸取0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml的0.05％k2so4(w/v)溶液于比色管中，加双蒸水使总体积为5ml，依次加入1ml体积比为1:1的盐酸，5ml70％(w/v)山梨醇溶液和5ml20％(w/v)氯化钡溶液，混合均匀放置10min，以0mlk2so4溶液样品为空白，在470nm波长处测量吸光度，以so4^2－含量为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线，对比计算出样品的硫酸基团含量。

计算c(％)＝(e2×c1×v1×v)/(e1×v2×w)×100

式中，c为样品中so4^2-百分含量(％)；

c1为标准硫酸钾溶液的浓度(mg/ml)；

e1为标准硫酸钾溶液的消光度；

e2为样品溶液的消光度；

v1为标准硫酸钾溶液的取量(ml)；

v2为样品溶液的取量(ml)；

v为样品溶液的总体积(ml)；

w为样品的干重(mg)。

样品含量测定：称取0.02g样品，放入25ml的比色管中，加入1:1比例的盐酸，待样品溶胀过夜后封管，放入105℃的烘箱恒温烘5小时，取出，冷却至室温开管。用1g左右的活性炭混匀脱色，用滤纸过滤，水洗，合并滤液和洗涤液用1：1比例的nh4oh中和至ph为6～7，移入50ml容量瓶中稀释至刻度，作为样品稀释液备用。取1ml样液按标准曲线绘制过程测定样品中的硫酸基团含量。

加酶处理和未加酶处理两种方法所提取的褐藻胶和岩藻聚糖硫酸酯两种多糖的得率如表1所示。

表1：裙带菜孢子叶褐藻胶和岩藻聚糖硫酸酯两种多糖得率

表中，褐藻胶得率(湿基)(％)＝a×b/n×100；

其中：a:褐藻胶沉淀重量(g)；

b:褐藻胶(褐藻酸钠)含量(％)；

n:孢子叶粘液对应的孢子叶鲜重(g)。

岩藻聚糖硫酸酯得率(湿基)(％)＝m/n×100；

其中：m：获得的岩藻聚糖硫酸酯沉淀重量(g)；

n:孢子叶粘液对应的孢子叶鲜重(g)。

由上述结果可以看出，采用本发明的方法制备的裙带菜孢子叶粘液，其可以作为褐藻胶和岩藻聚糖硫酸酯提取的原料；另外，以裙带菜孢子叶粘液为原料提取褐藻胶和岩藻聚糖硫酸酯，在提取过程中不加酶即可达到与加酶处理相近甚至更优的提取效果，有效解决了直接从裙带菜孢子叶中提取褐藻糖胶、褐藻胶等生物活性物质所存在的酶用量大、成本高的问题。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。