用于检测2019-nCoV的引物对、探针、试剂盒、检测方法及其应用与流程

本发明属于体外核酸检测领域，具体涉及用于检测2019-ncov的引物对、探针、试剂盒、检测方法及其应用。

背景技术：

冠状病毒(coronavirus，covs)是一种有包膜、非节段的单股正链rna病毒，属于巢病毒目冠状病毒科正冠状病毒亚科。该亚科由α冠状病毒属、β冠状病毒属、γ冠状病毒属和δ冠状病毒属共四个属组成。冠状病毒广泛存在于自然界中，其自然宿主包括人和许多哺乳动物如鼠、猫、犬和蝙蝠等。目前，已经鉴定出六种人类冠状病毒，其中包括α属的hco9ei-j和hcov-nl63,β属的hcov-oc43、hcov-hku1、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(sars-cov)和中东呼吸综合征相关冠状病毒(mers-cov)。最近分离出的新的冠状病毒，世界卫生组织(who)于2020年1月12日正式将其命名为“2019新型冠状病毒”(2019-ncov)。

新型冠状病毒是属于β属的冠状病毒，有包膜，病毒颗粒呈圆形或者椭圆形，直径60-140nm。其基因特征与sars-cov和mers-cov有明显区别。目前研究显示，与蝙蝠sars样冠状病毒(bat-sl-covzc45)同源性达85％以上。2020年2月12日，国际病毒分类委员会宣布该病毒的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)。同日，世界卫生组织宣布由该病毒引起的疾病正式名称为covid-19。

建立该病毒的快速检验方法，对于早期确诊感染人员、早期治疗感染者、早期采取控制手段以控制疫情是具有重要意义的。

传统的检测方法检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制。rt-raa法快速、灵敏、操作以及设备要求简便，对于当前疫情下快速检测新型冠状病毒具有重要作用。反应过程中主要用到四种主要的酶：逆转录酶、单链结合蛋白、重组酶uvsx和dna聚合酶。在反应中，逆转录酶逆转录2019-ncovrna为cdna，重组酶/引物复合体入侵解开目标cdna双链，单链结合蛋白与解开的单链结合，防止单链dna复性，dna聚合酶催化链延伸。由于重组酶常温下解链双链的特性，因此整个反应得以在39℃下进行，又由于不存在传统pcr升降温过程，扩增时间得以缩短至20分钟以内。

技术实现要素：

发明目的：本发明的一个目的是提供一种用于检测2019新型冠状病毒的引物对，所述引物对包括下述1)-3)中的至少一种：

1)序列表中seqidno：1所示核苷酸序列和序列表中seqidno：2所示核苷酸序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中seqidno：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；和在高严谨条件下可与序列表中seqidno：2限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)限定的核苷酸序列对具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列对。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测2019-ncov的探针，其特征在于，所述探针包括下述1)-3)中的至少一种：

1)所述探针的核苷酸序列为：

5’-caacctcaattagagatggaacttacaccagt(荧光报告基团-dt)(四氢呋喃残基f)(荧光淬灭基团-dt)tcagactattgaagtg-3’，本发明将所述探针核苷酸序列5’至3’方向的第33位碱基修饰荧光报告基团、第34位碱基替换为四氢呋喃残基，并且第35位碱基修饰荧光淬灭基团的物质；

2)在高严谨条件下可与1)所述的探针的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)所述的探针的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

优选的，所述荧光报告基团为fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5。

优选的，所述荧光报告基团为fam。

优选的，所述荧光淬灭基团为tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl。

优选的，所述荧光淬灭基团为bhq1。

本发明对不同的荧光报告基因和淬灭基团的组合没有特殊的限定，上述荧光报告基团和猝灭基团进行组合都可以达到相同的效果，本发明对荧光检测的仪器没有特殊的限定，采用本领域技术人员所熟知的相应荧光检测用仪器即可。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测2019-ncov的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括下述1)-2)所述中的至少一种：

1)上述的引物对；

2)上述的探针。

优选的，当所述试剂盒同时包括所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对中的两个引物与所述的探针的摩尔比为4：4：1。

本发明的另一个目的是提供一种2019-ncov的检测方法，其特征在于：所述检测方法不包括疾病的诊断或治疗的方法；所述检测方法包括使用下述1)-3)中的至少一种进行检测：

1)上述的引物对；

2)上述的探针；

3)上述的引物对和上述的探针。

优选的，所述检测方法为：提取待检测样品的rna进行rt-raa反应，所述rt-raa反应的反应温度为39℃；反应时间在20分钟以上；

当所述检测方法同时使用了所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对中的两个引物与所述的探针的摩尔比为4：4：1。

本发明还提供了上述引物对、探针、试剂盒、检测方法在检测2019-ncov中的应用，所述应用不包括涉及疾病的诊断或治疗方法的应用。

本发明还提供了上述引物对、探针、试剂盒、检测方法在制备检测2019新型冠状病毒相关产品中的应用。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

本发明目的是提供一种用于逆转录重组酶介导核酸扩增技术检测2019-ncov的荧光rt-raa引物和荧光探针以及该荧光rt-raa引物和荧光探针在检测2019-ncov中的应用，该荧光rt-raa引物和荧光探针可以快速、定性检测咽拭子样本中的2019新型冠状病毒。

本发明提供的荧光rt-raa引物和荧光探针，应用该荧光rt-raa引物和荧光探针检测2019新型冠状病毒时，不依赖于昂贵的pcr仪器，且检测时间较pcr方法或荧光pcr显著缩短，而灵敏度与荧光pcr相当甚至更高。

在rt-raa反应过程中，2019新型冠状病毒rna首先通过反转录酶合成cdna，再利用重组酶代替pcr高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止dna链复性，再由聚合酶完成链的延伸，以cdna为模板合成目的产物。反应在39℃下进行20分钟。此外，raa技术还能完成多重引物扩增，配合荧光仪，可形成一套raa多重荧光实时检测系统，即利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因，这是其他恒温核酸扩增技术或巢式pcr技术无法相比的。

本发明可以实现单管现场、快速检测2019新型冠状病毒，其它检测技术相比具有以下优点：

1、全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；

2、不依赖于pcr等贵重仪器，甚至能在37-39℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间；

3、本发明提供的荧光rt-raa引物和荧光探针特异性更强、灵敏度更高，完全满足疫情快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。

附图说明

图1为灵敏度实验结果图。

图2为特异性实验结果图。

图3为临床阳性样品检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于检测2019新型冠状病毒的荧光rt-raa引物、探针的设计

针对于2019新型冠状病毒的特异保守区域为靶标区域，设计特异性引物及荧光raa探针，其序列分别是：

正向引物，如序列表中seqidno：1所示核苷酸序列：

5'-gcgaacaattcaacagacactgtagacacagtac-3'

反向引物，如序列表中seqidno：2所示核苷酸序列：

5'-ctaggtgtttccacaatgtaggaccatgagc-3'

寡核苷酸探针，如下所示核苷酸序列：

5’-caacctcaattagagatggaacttacaccagt(fam-dt)(thf)(bhq-dt)tcagactattgaagtg-3’；其中：fam-dt表示携带有荧光素基团fam(6-carboxyfluorescein)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；thf表示四氢呋喃(tetrahydrofuran)连接子；bhq-dt表示携带有荧光淬灭基团bhq(blackholequencher)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

fam和bhq为常见的荧光素基团和荧光淬灭基团，采用其他荧光素基团(hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5)或荧光淬灭基团(tamra、eclipse、bhq2、bhq3或dabcyl)同样可达到本发明的效果。

实施例2、一种用于检测2019新型冠状病毒的荧光rt-raa方法的建立

(一)荧光rt-raa反应

1)样本rna的提取：所述样本rna可以采用德国凯杰生物工程有限公司的viralrna核酸提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。

2)采用实施例1设计的正向引物、反向引物和探针，以及raa反应试剂盒(本实施例具体采用了江苏奇天基因生物科技有限公司的rt-raa核酸扩增试剂盒(荧光法))，以本实施例制备的待检测样本rna为模板，进行扩增反应，其中反应体系如下：

25μlrt-raa反应缓冲液(江苏奇天基因生物科技有限公司rt-raa核酸扩增试剂盒(荧光法)提供)；

实施例1设计的正向引物、反向引物(浓度10μm)各2μl；

0.5μl实施例1设计的探针(浓度10μm)；

5μl制备的待检测样本rna模板；

加13μl双蒸水至47.5μl，混合均匀，然后加入到有干粉(江苏奇天基因生物科技有限公司rt-raa核酸扩增试剂盒(荧光法)提供)的反应管中，再次混匀。各管加入2.5μl280mm醋酸镁溶液并混匀。

(二)荧光检测

将上述反应管放置于raaf-6100荧光基因检测仪(江苏奇天基因生物科技有限公司)，在39℃反应20min，进行荧光检测。

阴性对照：fam通道无扩增曲线，且无tt值；

阳性对照：fam通道有扩增曲线，tt值均≤8min；

上述对阳性对照和阴性对照的要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。

4)样品检测结果判读：

当所检测的样品fam通道均有扩增曲线，质量控制正常时，可判定2019新型冠状病毒阳性；

当所检测的样品fam通道无扩增曲线，且tt值显示为undet或nott，质量控制正常时，可判定新型冠状病毒阴性。

(三)灵敏度实验

该实验验证该检测方法的最低检测限，采用浓度为1.0×106copies/反应、1.0×105copies/反应、1.0×104copies/反应、1.0×103copies/反应、1.0×102copies/反应、101copies/反应、100copies/反应，等的阳性质粒作为检测限参比品，通过该实验表明该检测方法的检测限达到10copies/反应，具体实验结果如图1所示。

图1中106、105、104、103、102、101、100分别表示浓度为1.0×106copies/反应、1.0×105copies/反应、1.0×104copies/反应、1.0×103copies/反应、1.0×102copies/反应、101copies/反应、100copies/反应的阳性质控品扩增曲线，阴为阴性质控品，横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值。图1所示结果表明，该检测方法的检测限达到10copies/反应。

(四)特异性实验

该实验选择与2019新型冠状病毒具有相同感染部位的常见病原体作为特异性参考品。特异性参考品分别为腺病毒、寨卡病毒、乙型流感病毒、基孔肯雅病毒。利用qigen公司的viral病毒rna提取试剂盒提取以上样本中的rna作为模板进行实验。特异性实验结果如图2所示。

图2中横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值。图2所示结果表明，这5种特异性参考品均未有扩增曲线，说明该检测方法的特异性良好。

(五)临床阳性样品检测实验

选择宁波国际旅行卫生保健中心综合实验室保存的3例2019新型冠状病毒阳性样本(sars-cov-2-1、sars-cov-2-2、sars-cov-2-3)对该方法进行检测、验证。具体实验结果如图3所示。

图3中横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值。图3所示结果表明，该检测方法扩增效果优异，具有良好的性能。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心

<120>用于检测2019-ncov的引物对、探针、试剂盒、检测方法及其应用

<141>2020-04-09

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

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