一种检测啶虫脒的化学发光传感器及其制备方法与流程

本发明涉及传感器技术领域，特别涉及一种基于dnazyme的dnawalker检测啶虫脒的化学发光传感器，还涉及其制备方法。

背景技术：

啶虫脒作为一种新烟碱类杀虫剂，由于其对常见的有机磷和氨基甲酸酯类农药没有交叉抗性，而广泛应用于农业生产过程中。啶虫脒一旦施用，主要被根系吸收，然后转移到生物体的各种组织中，包括花、叶和果实。从害虫防治的角度来看，与其他杀虫剂相比，啶虫脒具有更好的吸收率和易于使用的优点。然而，出于对人类暴露和生态友好性的考虑，啶虫脒无疑会影响可能与植物生产接触的非靶标生物。由于对杀虫剂的抗药性、对哺乳动物的威胁以及严重的环境污染，许多国家已经禁止使用啶虫脒。因此，在我国，对啶虫脒进行有效的分析是保护人们免受可能的危害，保护生态系统的迫切需要。

目前，用于检测啶虫脒的方法有很多，如高效液相色谱、气相色谱、液相色谱-质谱联用。这些方法具有较高的灵敏度、选择性和可靠性，但需要昂贵的仪器设备、专业的技术人员、操作复杂费时费力。

技术实现要素：

本发明针对现有检测方法中操作复杂费时费力，需要专业的技术人员的缺点，提供了一种灵敏度高、特异性强、成本低、快速的检测啶虫脒的化学发光生物传感器。

本发明还提供了基于dnazyme的dnawalker检测啶虫脒的化学发光生物传感器的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种检测啶虫脒的化学发光生物传感器，包括：金纳米颗粒、hap链、walker链、lock链、目标物；

所述的hap链的碱基序列如seqno.1所示；具体为：5’-sh-tgggtagggcgggttgggcactatraggaagagaaaaacccg-3’；

所述的lock链的碱基序列如seqno.2所示；具体为：5’-aagagactgacaccatattatgaaga-3’；

所述的walker链的碱基序列如seqno.3所示；具体为：5’-sh-(t)35tcttcataaattagtcagtctcttctccgagccggtcgaaatagt-3’；

所述的hap链5’连接有-sh；所述的walker链5’连接有-sh；所述的hap链5’的第25位碱基序列连接有核糖核酸rna腺嘌呤ra。

上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）金纳米颗粒的制备；

（2）将walker链和hap链修饰到金纳米颗粒表面；

（3）标记好的纳米金颗粒的均相反应；

（4）化学发光检测。

所述的步骤（1）金纳米颗粒的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备。

所述的步骤（2）将hap和walker链修饰到金纳米颗粒表面：

①首先将walker链和lock链混合反应，形成锁住的walker链；

②将步骤①锁住的walker链和hap链混合，作为底物探针；

③向纳米金颗粒溶液中加入底物探针，4℃下放置；

④分多次以3μl/min的速度加入pb缓冲液，搅拌，4℃放置；

⑤48h后分多次以2μl/min的速度加入pbs缓冲液，4℃下放置；

⑥24h后，加入灭菌水，离心除去上层清液，再离心除去上层清液。

所述的步骤（3）标好的纳米金颗粒的均相反应：将纳米金颗粒溶液、灭菌水、目标物、k⁺、mn²⁺、缓冲液、血红素以及鲁米诺和过氧化氢加入到灭菌的离心管中并震荡，然后在37℃水浴锅中孵育2h。

所述的步骤（4）化学发光检测：用荧光仪检测鲁米诺的化学发光信号，荧光仪激发波长设置为350nm，发射波长设置为420nm，检测范围设置350nm-550nm，读取荧光信号变化，检测待测目标物。

采用上述制备方法制备的化学发光传感器在检测啶虫脒上的应用。

所述的制备方法，均相内的反应：

均相中发生的反应主要有：walker链与lock链通过碱基互补配对形成双链。当啶虫脒存在的情况下，lock链中的适配体序列会和啶虫脒结合，释放walker链，导致walker链中的dnazyme链被激活，在二价金属离子mn²⁺存在时，walker链与hap链中的dnazyme底物序列特异性结合并在裂解位点ra处裂解，破坏了hap的发夹结构，g-rich序列暴露出来；walker链继续与aunp表面的其它的hap结合并裂解，最终aunp表面暴露出许多g-rich，在添加k⁺和血红素后会形成模拟辣根过氧化物酶活性的g-四联体，然后加入鲁米诺和过氧化氢，会导致鲁米诺发光。

该发明的检测方式是化学发光法检测，利用荧光仪。

在检测之前，首先通过au-s键将封闭的walker链和hap链修饰到金纳米颗粒表面，然后进行均相反应。取一定体积标记好的金纳米颗粒溶液，加入目标物啶虫脒后，lock链中的适配体序列会和啶虫脒结合，释放walker链，导致walker链中的dnazyme链被激活，在二价金属离子mn²⁺存在时，walker链与hap链中的dnazyme底物序列特异性结合并在裂解位点ra处裂解，破坏了hap的发夹结构，g-rich序列暴露出来；walker链继续与aunp表面的其它的hap结合并裂解，最终aunp表面暴露出许多g-rich，实现放大过程。在添加k⁺和血红素后会形成模拟辣根过氧化物酶活性的g-四联体，然后加入鲁米诺和过氧化氢，会导致鲁米诺发光。最后，用荧光仪在激发波长为350nm下，检测420nm处鲁米诺的化学发光。

本发明中一共用到了3条dna链，其序列分别是：

hap：5’-sh-tgggtagggcgggttgggcactatraggaagagaaaaacccg-3’

lock：5’-aagagactgacaccatattatgaaga-3’

walker：5’-sh-(t)35tcttcataaattagtcagtctcttctccgagccggtcgaaatagt-3’

hap的5’末端修饰有-sh，通过au-s键修饰到金纳米颗粒（aunp）表面，其中下划线是g-rich序列；粗体部分是dnazyme的底物序列，ra表示核糖核酸rna腺嘌呤。

lock和walker的曲线部分是互补配对的；lock的斜体部分是目标物的适配体序列；walker的加粗部分是dnazyem的序列，其中斜体部分是dnazyme的催化活性中心。

hap和walker通过au-s键修饰在纳米金颗粒(aunp)表面。lock的适配体部分可与啶虫脒特异性结合，释放walker链，从而导致walker中封闭的dnazyme链被激活，在二价金属离子mn²⁺存在时，walker链与hap特异性结合并在裂解位点ra处裂解，破坏了hap的发夹结构，g-rich序列暴露出来；walker链继续与aunp表面的其它的hap结合并裂解，最终aunp表面暴露出许多g-rich，在添加k⁺和血红素后会形成模拟辣根过氧化物酶活性的g-四联体，然后加入鲁米诺和过氧化氢，会导致鲁米诺发光。

本发明中啶虫脒的检测是在均相溶液中，通过dnawalker技术来实现信号的放大，从而实现啶虫脒的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：walker链与lock链通过碱基互补配对形成双链。当啶虫脒存在的情况下，lock链中的适配体序列会和啶虫脒结合，释放walker链，导致walker链中的dnazyme链被激活，在二价金属离子mn²⁺存在时，walker链与hap链中的dnazyme底物序列特异性结合并在裂解位点ra处裂解，破坏了hap的发夹结构，g-rich序列暴露出来；walker链继续与aunp表面的其它的hap结合并裂解，最终aunp表面暴露出许多g-rich，在添加k⁺和血红素后会形成模拟辣根过氧化物酶活性的g-四联体，然后加入鲁米诺和过氧化氢，会导致鲁米诺发光。

本发明基于核酸适配体与目标物之间的特异性识别能力，激活dnazyme在金纳米颗粒表面杂交裂解反应，得到许多暴露的g-rich序列，在k⁺和血红素存在下形成许多模拟辣根过氧化物酶活性的g-四联体，实现放大作用。加入鲁米诺和过氧化氢，产生鲁米诺的化学发光。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补啶虫脒现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、利用了啶虫脒与核酸适配体的特异型识别的特性进行检测；

2、利用了dnazyme裂解和dnawalker技术，起到了信号放大的作用，提高了检测的灵敏度；

3、该传感器的反应条件温和，反应速度快；

4、检测原理的主要过程均是在均相溶液中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复

杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；

5、制备方法简单，性能稳定，适用于食品、土壤及饮用水中啶虫脒的检测；

6、制备过程的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为该实验的原理图；

图2为实施例1检测结果图；

图3为实施例2检测结果图；

图4为实施例3检测结果图；

图5为实施例4传感器检测啶虫脒的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）金纳米颗粒的制备；

（2）将含-sh的封闭的walker链和hap链修饰到金纳米颗粒表面；

（3）标记好的纳米金颗粒的均相反应；

（4）化学发光检测。

本发明需要合成金纳米颗粒，用于dnawalker的载体。

所述金纳米颗粒的制备方法操作步骤如下：

采用柠檬酸三钠还原法制备，合成之前，所用的玻璃仪器都得提前用王水浸泡24h，并用超纯水冲洗干净。然后，500µl0.04g·ml^-1的haucl4加入到含有200ml超纯水的三口烧瓶中，加热至沸腾。在搅拌条件下，快速加入3ml1%的柠檬酸三钠溶液，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min，撤去热源，慢慢冷却至室温，于4℃保存备用。取70µl金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用uv-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在519nm处的摩尔消光系数8.78×10⁸m^-1cm^-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nm。

所述的制备方法，含-sh的封闭walker链和hap链修饰到金纳米颗粒表面的操作步骤如下：（1）首先将含-sh的walker链和lock链按照摩尔比1:3混合反应，形成锁住的walker链。

（2）含-sh锁住的walker链和hap链按照摩尔比1:20的比例均匀混合在一起，作为底物探针。

（3）取1ml纳米金颗粒溶液于离心管中，离心10min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300µl灭菌水使纳米金溶液浓缩至3nm。移入1ml玻璃瓶中，用锡箔纸封口。

（4）室温放置30min后，加入150µl浓度为30µm的修饰了-sh的底物探针，（纳米金颗粒与底物链的摩尔比为1：5000）混合均匀后，4℃下放置24h。

（5）24h后，分多次缓慢加入50µlpb缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10min后，继续加入27µlpbs缓冲液。取出磁子，再放到王水中，4℃放置48h。

（6）48h后分多次缓慢加入62µlpbs缓冲液，4℃下放置。

（7）24h后，将标记好的金纳米颗粒移至离心管中，然后加入1ml灭菌水，15000rpm·min^-1离心10min，除去上层清液，再加入1ml灭菌水离心。此过程重复两次（为了洗脱未标记的dna链）。

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

①将灭菌水、目标物（3µl）、纳米金溶液（5µl）、mn²⁺（3µl）、k⁺（3µl）、缓冲液（3µl）、血红素（3µl）（浓度分别为0.2µm，0.4µm，0.6µm，0.8µm，1.0µm，1.2µm）、鲁米诺（3µl）、过氧化氢（3.3µl）加入到预先准备好的灭菌的ep管中并震荡，放入37℃的恒温水浴锅孵育2h。

②将①步反应后的溶液（30µl）稀释至100µl，用荧光仪在420nm处检测化学发光。荧光仪激发波长设置为350nm，发射波长设置为420nm，检测范围350nm-550nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

结果见图2，从图中可以看出，随着血红素浓度的增加，实验得到的化学发光强度不断增强，在血红素的浓度达到1.0µm之后，化学发光强度基本不变。说明最适的血红素浓度是1.0µm。

实施例2

一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法：

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）金纳米颗粒的制备；

（2）将含-sh的封闭walker链和hap链修饰到金纳米颗粒表面；

（3）标记好的纳米金颗粒的均相反应；

（4）化学发光检测。

本发明需要合成金纳米颗粒，用于dnawalker的载体。

所述金纳米颗粒的制备方法操作步骤如下：

采用柠檬酸三钠还原法制备，合成之前，所用的玻璃仪器都得提前用王水浸泡24h，并用超纯水冲洗干净。然后，500µl0.04g·ml^-1的haucl4加入到含有200ml超纯水的三口烧瓶中，加热至沸腾。在搅拌条件下，快速加入3ml1%的柠檬酸三钠溶液，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min，撤去热源，慢慢冷却至室温，于4℃保存备用。取70µl金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用uv-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在519nm处的摩尔消光系数8.78×10⁸m^-1cm^-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nm。

所述的制备方法，含-sh的封闭的walker链和hap链修饰到金纳米颗粒表面的操作步骤如下：

（1）首先将含-sh的walker链和lock链按照摩尔比1:3混合反应，形成锁住的walker链。

（2）含-sh锁住的walker链和hap链按照摩尔比1:20的比例均匀混合在一起，作为底物探针。

（3）取1ml纳米金颗粒溶液于离心管中，离心10min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300µl灭菌水使纳米金溶液浓缩至3nm。移入1ml玻璃瓶中，用锡箔纸封口。

（4）室温放置30min后，加入150µl浓度为30µm的修饰了-sh的底物探针，（纳米金颗粒与底物链的摩尔比为1：5000）混合均匀后，4℃下放置24h。

（5）24h后，分多次缓慢加入50µlpb缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10min后，继续加入27µlpbs缓冲液。取出磁子，再放到王水中，4℃放置48h。

（6）48h后分多次缓慢加入62µlpbs缓冲液，4℃下放置。

（7）24h后，将标记好的金纳米颗粒移至离心管中，然后加入1ml灭菌水，15000rpm·min^-1离心10min，除去上层清液，再加入1ml灭菌水离心。此过程重复两次（为了洗脱未标记的dna链）。

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

①将灭菌水、目标物（3µl）、纳米金溶液（5µl）、mn²⁺（3µl）、k⁺（3µl）、缓冲液（3µl）、血红素（3µl）、鲁米诺（3µl）（浓度分别为0.2mm，0.4mm，0.6mm，0.8mm，1.0mm，2.0mm，3.0mm）、过氧化氢（3.3µl）加入到预先准备好的灭菌的ep管中并震荡，放入37℃的恒温水浴锅孵育2h。

②将①步反应后的溶液（30µl）稀释至100µl，用荧光仪在420nm处检测化学发光。荧光仪激发波长设置为350nm，发射波长设置为420nm，检测范围350nm-550nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

结果见图3，从图中可以看出，随着鲁米诺浓度的增加，实验得到的化学发光强度不断增强，在鲁米诺的浓度达到2.0µm之后，化学发光强度基本不变或略有降低。说明最适的鲁米诺浓度是2.0µm。

实施例3

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）金纳米颗粒的制备；

（2）将含-sh的封闭的walker链和hap链修饰到金纳米颗粒表面；

（3）标记好的纳米金颗粒的均相反应；

（4）化学发光检测。

本发明需要合成金纳米颗粒，用于dnawalker的载体。

所述金纳米颗粒的制备方法操作步骤如下：

采用柠檬酸三钠还原法制备，合成之前，所用的玻璃仪器都得提前用王水浸泡24h，并用超纯水冲洗干净。然后，500µl0.04g·ml^-1的haucl4加入到含有200ml超纯水的三口烧瓶中，加热至沸腾。在搅拌条件下，快速加入3ml1%的柠檬酸三钠溶液，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min，撤去热源，慢慢冷却至室温，于4℃保存备用。取70µl金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用uv-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在519nm处的摩尔消光系数8.78×10⁸m^-1cm^-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nm。

所述的制备方法，含-sh的封闭的walker链和hap链修饰到金纳米颗粒表面的操作步骤如下：（1）首先将含-sh的walker链和lock链按照摩尔比1:3混合反应，形成锁住的walker链。

（2）含-sh锁住的walker链和hap链按照摩尔比1:20的比例均匀混合在一起，作为底物探针。

（3）取1ml纳米金颗粒溶液于离心管中，离心10min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300µl灭菌水使纳米金溶液浓缩至3nm。移入1ml玻璃瓶中，用锡箔纸封口。

（4）室温放置30min后，加入150µl浓度为30µm的修饰了-sh的底物探针，（纳米金颗粒与底物链的摩尔比为1：5000）混合均匀后，4℃下放置24h。

（5）24h后，分多次缓慢加入50µlpb缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10min后，继续加入27µlpbs缓冲液。取出磁子，再放到王水中，4℃放置48h。

（6）48h后分多次缓慢加入62µlpbs缓冲液，4℃下放置。

（7）24h后，将标记好的金纳米颗粒移至离心管中，然后加入1ml灭菌水，15000rpm·min^-1离心10min，除去上层清液，再加入1ml灭菌水离心。此过程重复两次（为了洗脱未标记的dna链）。

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

①将灭菌水、目标物（3µl）、纳米金溶液（5µl）、mn²⁺（3µl）、k⁺（3µl）、缓冲液（3µl）、血红素（3µl）、鲁米诺（3µl）、过氧化氢（3.3µl）（浓度分别为2mm，4mm，6mm，8mm，10mm，15mm，20mm）加入到预先准备好的灭菌的ep管中并震荡，放入37℃的恒温水浴锅孵育2h。

②将①步反应后的溶液（30µl）稀释至100µl，用荧光仪在420nm处检测化学发光。荧光仪激发波长设置为350nm，发射波长设置为420nm，检测范围350nm-550nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

结果见图3，从图中可以看出，随着过氧化氢浓度的增加，实验得到的化学发光强度不断增强，在过氧化氢的浓度达到15mm之后，化学发光强度基本不变或略有降低。说明最适的过氧化氢浓度是15mm。

实施例4

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）金纳米颗粒的制备；

（2）将含-sh的封闭的walker链和hap链修饰到金纳米颗粒表面；

（3）标记好的纳米金颗粒的均相反应；

（4）化学发光检测。

本发明需要合成金纳米颗粒，用于dnawalker的载体。

所述金纳米颗粒的制备方法操作步骤如下：

采用柠檬酸三钠还原法制备，合成之前，所用的玻璃仪器都得提前用王水浸泡24h，并用超纯水冲洗干净。然后，500µl0.04g·ml^-1的haucl4加入到含有200ml超纯水的三口烧瓶中，加热至沸腾。在搅拌条件下，快速加入3ml1%的柠檬酸三钠溶液，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min，撤去热源，慢慢冷却至室温，于4℃保存备用。取70µl金纳米颗粒溶液于微量比色皿中，使用uv-2550紫外可见分光光度计对其进行光吸收波谱扫描，根据波长在519nm处的摩尔消光系数8.78×10⁸m^-1cm^-1计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nm。

所述的制备方法，含-sh的封闭的walker链和hap链修饰到金纳米颗粒表面的操作步骤如下：（1）首先将含-sh的walker链和lock链按照摩尔比1:3混合反应，形成锁住的walker链。

（2）含-sh锁住的walker链和hap链按照摩尔比1:20的比例均匀混合在一起，作为底物探针。

（3）取1ml纳米金颗粒溶液于离心管中，离心10min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300µl灭菌水使纳米金溶液浓缩至3nm。移入1ml玻璃瓶中，用锡箔纸封口。

（4）室温放置30min后，加入150µl浓度为30µm的修饰了-sh的底物探针，（纳米金颗粒与底物链的摩尔比为1：5000）混合均匀后，4℃下放置24h。

（5）24h后，分多次缓慢加入50µlpb缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10min后，继续加入27µlpbs缓冲液。取出磁子，再放到王水中，4℃放置48h。

（6）48h后分多次缓慢加入62µlpbs缓冲液，4℃下放置。

（7）24h后，将标记好的金纳米颗粒移至离心管中，然后加入1ml灭菌水，15000rpm·min^-1离心10min，除去上层清液，再加入1ml灭菌水离心。此过程重复两次（为了洗脱未标记的dna链）。

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

①将灭菌水、目标物（3µl）（终浓度分别为0，10pm，50pm，100pm，500pm，1000pm）、纳米金溶液（5µl）、mn²⁺（3µl）、k⁺（3µl）、缓冲液（3µl）、血红素（3µl）、鲁米诺（3µl）、过氧化氢（3.3µl）加入到预先准备好的灭菌的ep管中并震荡，放入37℃的恒温水浴锅孵育2h。

②将①步反应后的溶液（30µl）稀释至100µl，用荧光仪在420nm处检测化学发光。荧光仪激发波长设置为350nm，发射波长设置为420nm，检测范围350nm-550nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

检测结果如图5所示，图中我们可以看到，当啶虫脒浓度在10pm到1000pm时化学发光值不断增加，反应稳定进行。在啶虫脒的浓度在10pm到时1000pm，啶虫脒的对数与化学发光强度值的大小成正比关系，拟合曲线：cl=248.7logc+715.1(cl是化学发光强度，c是啶虫脒浓度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>济南大学

<120>一种检测啶虫脒的化学发光传感器及其制备方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>1

tgggtagggcgggttgggcactatggaagagaaaaacccg40

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>80

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>3

ttttttttttttttttttttttttttttttttttttcttcataaattagtcagtctcttc60

tccgagccggtcgaaatagt80