一种仿生2019新型冠状病毒、其制备方法及应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种仿生2019新型冠状病毒、其制备方法及应用。

背景技术：

冠状病毒是一组有包膜的正链单股rna病毒，直径约80-120nm，其遗传物质是所有rna病毒中最大的，具有感染性。外膜主要是三种糖蛋白：刺突蛋白（s），其构成冠状病毒特征性的冠状突起，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点；小包膜蛋白（e）和膜蛋白（m），两者结合形成包膜并可突出在表面。与基因组相关的是一种磷蛋白（n），其缠绕在病毒基因组表面形成螺旋状核壳体，主要定位在细胞质中，是主要的抗原分子，具有广泛的生物学功能，常被应用于血清学诊断。所述核壳体通过膜蛋白（m）与病毒包膜连接。某些病毒膜上还可见到另一种蛋白凝集酯酶(he)，它具有血凝素或酯酶的活性。

2019新型冠状病毒（covid-19）基因组全长约29800个碱基对，基因组一般含有13个基因，编码14个蛋白，主要包括多聚蛋白、刺突蛋白（s蛋白）、膜蛋白（m蛋白）、囊膜蛋白（e蛋白）、衣壳蛋白（n蛋白），以及特有蛋白（如图1）。新型冠状病毒造成全球大量感染及死亡，且目前尚无有效药物和疫苗。因而，急需一种可应用于临床的新型冠状病毒疫苗。

近几年，利用微生物获得重组的病毒蛋白，是制备病毒疫苗的有效方法。重组的病毒蛋白能利用抗原分子蛋白刺激人或动物产生抗体，从而中和或消除天然的病毒，达到临床治疗的效果。但传统病毒因携带病毒基因组而具有传染性，操作中存在感染人体的危险性。为解决这一问题，可利用构建重组环状质粒，并经原核或真核细胞表达后获得重组的病毒蛋白，但重组的病毒蛋白多以游离的溶液形式出现和使用，在人体复杂的环境中极易被蛋白酶等降解失活，大大降低了有效时间和药效率。因此，如何利用重组的病毒蛋白制备大小及结构类似天然病毒的仿生病毒成为本领域的研究热点。

本发明人在对仿生新型冠状病毒的制备及筛选中，发现利用纳米颗粒结合病毒蛋白形成的仿生新型冠状病毒具备以下特点：1）能够局部浓缩蛋白浓度，提高了蛋白含量，可更容易被免疫细胞吞噬，提升了抗体产生的效率；2）没有携带病毒核酸，不具备传染性。该仿生病毒可应用于科研开发蛋白疫苗、治疗用抗原及临床治疗，对控制病毒流行有着重要意义。另外，目前尚无任何关于负载2019新型冠状病毒的仿生病毒的技术公开。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明公开一种仿生2019新型冠状病毒，该仿生病毒安全不具传染性，能够提升抗体产生的效率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明公开了一种仿生2019新型冠状病毒，其为核壳结构的纳米体系，内核为纳米颗粒，外壳为重组表面蛋白，所述重组表面蛋白是由2019新型冠状病毒表面蛋白进行人工重组及微生物外源表达制备得到。

进一步，所述重组表面蛋白包括刺突蛋白、膜蛋白、囊膜蛋白和衣壳蛋白中的任一或多种组合，所述刺突蛋白、膜蛋白、囊膜蛋白或衣壳蛋白分别携带有完整的氨基酸序列或者部分功能片段的氨基酸序列。

进一步，所述重组表面蛋白还包括连接标签，所述连接标签是具有连接作用的蛋白质。

进一步，所述重组表面蛋白还包括荧光蛋白，用于观察及定位病毒。

进一步，制备所述纳米颗粒的材料包括pla、plga、pcl、zno、sio2、tio2、pei、cs中的一种或多种。

进一步，所述仿生2019新型冠状病毒的直径为20nm-250nm。

本发明还公开了一种重组表面蛋白的制备方法，包括：

设计并构建含有天然2019新型冠状病毒表面蛋白的表达质粒；

将所述表达质粒导入微生物宿主，诱导宿主合成并纯化，即得。

本发明还公开了一种仿生2019新型冠状病毒的制备方法，包括：

将质量比大于1ng:1ng的重组表面蛋白与纳米颗粒混合后，进行自组装，即得仿生2019新型冠状病毒悬浊液；

将所述悬浊液进行冻干，即得仿生2019新型冠状病毒冻干粉。

进一步，所述自组装包括：

在温度为30-37℃下，静置大于10分钟；或者

在温度为20-30℃下，静置大于30分钟；或者

在温度为4-8℃下，静置大于60分钟。

本发明还公开了一种仿生2019新型冠状病毒在促进体内产生抗2019新型冠状病毒的抗体中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明的仿生2019新型冠状病毒安全不具有传染性，在动物功能性和安全性实验中无死亡病例，且组织细胞无坏死症状，也没有咳嗽、气促、呼吸困难、烦躁及耸毛等临床表现；本发明的仿生2019新型冠状病毒的表面蛋白含量高，更易被免疫细胞吞噬，能促进体内产生抗2019-ncov病毒的抗体，从而中和或消除2019新型冠状病毒，显著提升了抗体产生的效率；本发明的仿生2019新型冠状病毒可用于科研开发蛋白疫苗、治疗用抗原以及临床治疗，对防控2019新型冠状病毒流行具有重要意义。

附图说明

图1为2019新型冠状病毒的基因组结构；

图2为本发明仿生2019新型冠状病毒的结构示意图；

图3为本发明仿生2019新型冠状病毒的电镜图；

图4为本发明制备重组表面蛋白的流程图；

图5为本发明含有连接标签的重组表面蛋白的结构示意图；

图6为本发明制备仿生2019新型冠状病毒的流程图；

图中，

a为无连接标签的结合方式；

b为含连接标签的结合方式；

c为不含连接标签的重组表面蛋白与纳米颗粒进行静电吸附自组装；

d为含连接标签phap/his/gst的重组表面蛋白根据不同的特性与纳米颗粒进行自组装。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

请参阅图2：本发明实施例公开了一种仿生2019新型冠状病毒，其为核壳结构的纳米体系，内核为纳米颗粒，外壳为重组表面蛋白。所述重组表面蛋白是由2019新型冠状病毒表面蛋白进行人工重组及微生物外源表达制备得到。

本发明实施例中所述纳米颗粒为纳米级的不规则颗粒、球体或椭球。

本发明制备纳米颗粒的材料包括：以pla、plga、pcl、pha家族（含phb、pbhv、phbhhx、phbvhhx、p34hb等）及其衍生物为代表的疏水类高分子材料；以壳聚糖（cs）、pei（含pla-pei、plga-pei、pcl-pei等）为代表的带正电荷高分子材料；和以氧化锌、氧化硅、氧化钛等为代表的无机材料。

本发明实施例制备纳米颗粒的材料具体包括表1中的任一种或几种组合，当通过几种材料混合制备纳米颗粒时，单一材料的质量比例占总质量的1-50%。

表1-本发明实施例制备纳米颗粒的材料及其表面电荷

其中，所述疏水类高分子材料和带正电荷高分子材料的分子量为5-500kd。

本发明所述重组表面蛋白包括刺突蛋白、膜蛋白、囊膜蛋白和衣壳蛋白中的任一或多种组合，所述刺突蛋白、膜蛋白、囊膜蛋白或衣壳蛋白都携带完整的氨基酸序列或者部分功能片段的氨基酸序列。

本发明所述重组表面蛋白还包括连接标签，连接标签是具有连接作用的蛋白质。本发明实施例中所用连接标签为phap、his及gst中的任一种。

phap是一种天然生物高分子pha（聚羟基脂肪酸酯）表面的结合蛋白，具有良好的生物相容性，无毒无害。phap蛋白有两种蛋白构象，是由四个单体组成的双亲性蛋白，可通过其疏水区结合位点与较疏水的高分子材料结合，如pha（聚羟基脂肪酸酯），pla（聚乳酸），plga（聚乳酸-羟基乙酸共聚物），pcl（聚己内酯）等；也可以粘附在疏水的油珠表面作表面活性剂。利用连接标签phap，可将重组的2019新型冠状病毒表面蛋白粘附在纳米颗粒表面。

his标签蛋白由6个组氨酸连接而成，能与金属形成配位键稳定结合，达到两者结合的目的。

gst标签蛋白是一种能特异地与谷胱甘肽结合，表现出酶和底物的作用原理，将谷胱甘肽以配基的方式结合在纳米颗粒上，再将带有gst标签蛋白的重组的2019新型冠状病毒表面蛋白与之结合达到自组装的目的。

本发明所述重组表面蛋白还包括荧光蛋白，用于观察及定位病毒。本发明实施例中所述荧光蛋白包括红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白中的任一种。

请参阅图3：本发明所述仿生2019新型冠状病毒的直径为20nm-250nm。

请参阅图4：本发明还公开了一种重组表面蛋白的制备方法，利用人工重组及微生物外源表达进行制备，步骤如下：

s1、设计并构建含有天然2019新型冠状病毒表面蛋白的表达质粒，包括：

通过ncbi网站获取及优化天然covid-19病毒蛋白（n/s/e/m）完整基因或部分功能基因序列；

可以将天然covid-19蛋白基因片段的一种或者多种与连接标签的基因序列融合；

也可以将天然covid-19蛋白完整基因片段的一种或者多种、天然covid-19蛋白部分功能基因片段的一种或者多种；

也可以将上述两种情形与荧光蛋白的基因序列融合；

s2、将所述表达质粒导入微生物宿主，诱导宿主合成并纯化，具体为：

将构建好的重组载体在宿主细胞中表达出重组蛋白，利用纯化手段得到重组表面蛋白，所述重组表面蛋白可以含有covid-19蛋白完整片段或部分功能片段，也可以在covid-19蛋白完整片段或部分功能片段中加入不同连接标签。

请参阅图5，本发明实施例的含有连接标签的重组表面蛋白：

图（a）中，（a1）和（a2）表示连接标签和重组表面蛋白的基因序列的前后顺序或蛋白上下游关系可变换。

本发明对连接两者的连接及其他重组蛋白的序列；对重组表面蛋白纯化方式及对应的纯化连接标签不作限定。

图（b）中，（b1）和（b2）表示连接标签和重组表面蛋白的基因序列的前后顺序或蛋白上下游关系可变换

本发明对连接两者的连接及其他重组蛋白的序列；对重组表面蛋白纯化方式及对应的纯化连接标签不作限定。

本发明对重组表面蛋白表达的宿主及对应启动子无特殊要求，本实施例选择大肠杆菌和酵母。

请参阅图6：本发明还公开了一种仿生2019新型冠状病毒的制备方法，包括两种连接方式，具体步骤为：

将质量比大于1ng:1ng的重组表面蛋白与纳米颗粒混合后，进行自组装，即得仿生2019新型冠状病毒悬浊液；

将所述悬浊液进行冻干，即得仿生2019新型冠状病毒冻干粉。

图（c）中，不含连接标签的重组表面蛋白，通过自身负电荷的特性与带正电的荷高分子材料制成的纳米颗粒进行静电吸附自组装；

图（d）中，含有phap/his/gst等连接标签的重组表面蛋白，根据不同的特性与纳米颗粒自组装。

本发明所述自组装包括：

在温度为30-37℃下，静置大于10分钟；

或在温度为20-30℃下，静置大于30分钟；

或在温度为4-8℃下，静置大于60分钟。

本发明实施例提供四种自组装方式，包括：

（1）含phap连接标签的重组的2019新型冠状病毒表面蛋白与pla、plga、pcl、pha等疏水类高分子材料制备的纳米颗粒的自组装方式；

（2）含his连接标签的重组的2019新型冠状病毒表面蛋白与氧化锌、二氧化硅、二氧化钛等无机材料制备的纳米颗粒的自组装方式；

（3）重组的2019新型冠状病毒表面蛋白与pla-pei、plga-pei、pcl-pei、壳聚糖（cs）等带正电荷高分子材料制备的纳米颗粒依赖静电的自组装方式；

（4）含gst连接标签的重组的2019新型冠状病毒表面蛋白与含谷胱甘肽的纳米颗粒的特异性自组装方式。

本发明还公开了一种仿生2019新型冠状病毒在促进体内产生抗2019新型冠状病毒的抗体中的应用。

下面结合实施例，更进一步阐述本发明。

实施例1-不含连接标签的重组表面蛋白的制备

不含连接标签的重组表面蛋白的制备方法，包括：

根据2019年新型冠状病毒的含s蛋白、m蛋白、e蛋白和n蛋白的蛋白质序列，构建可在大肠杆菌为宿主的异源蛋白表达载体的质粒和酵母为宿主的异源蛋白表达载体的质粒；

采用大肠杆菌为合成宿主，t7或sp6启动子为被载体的启动子，经iptg诱导后，分别获得过量表达的异源重组蛋白，所述异源重组蛋白包括：完整s蛋白或部分功能的s蛋白片段，完整m蛋白或部分功能的m蛋白片段，完整e蛋白或部分功能的e蛋白片段，完整n蛋白或部分功能的n蛋白片段；

对获得的至少两种完整蛋白进行组合，或者对至少两种部分功能的蛋白片段进行组合，或者对至少一种完整蛋白和至少一种部分功能的蛋白片段进行组合，冷冻干燥，保存；

采用毕赤酵母为合成宿主，gap或aox1启动子为被载体的启动子，经甲醇或低温等方式诱导后，分别获得过量表达的异源重组蛋白，所述异源重组蛋白包括：完整s蛋白或部分功能的s蛋白片段，完整m蛋白或部分功能的m蛋白片段，完整e蛋白或部分功能的e蛋白片段，完整n蛋白或部分功能的n蛋白片段；

对获得的至少两种完整蛋白进行组合，或者对至少两种部分功能的蛋白片段进行组合，或者对至少一种完整蛋白和至少一种部分功能的蛋白片段进行组合，冷冻干燥，保存。

实施例2-含连接标签phap的重组表面蛋白的制备

含连接标签phap的重组表面蛋白的制备方法，包括：

根据2019年新型冠状病毒的含s蛋白、m蛋白、e蛋白、n蛋白和连接标签phap的蛋白质序列，构建可在大肠杆菌为宿主的异源蛋白表达载体的质粒和酵母为宿主的异源蛋白表达载体的质粒；

采用大肠杆菌为合成宿主，t7或sp6启动子为被载体的启动子，经iptg诱导后，分别获得过量表达的异源重组蛋白，所述异源重组蛋白包括：s蛋白-phap重组蛋白（s-phap），m蛋白-phap重组蛋白（m-phap），e蛋白-phap重组蛋白（e-phap），n蛋白-phap重组蛋白（n-phap），冷冻干保存；

采用毕赤酵母为合成宿主，gap或aox1启动子为被载体的启动子，经甲醇或低温等方式诱导后，分别获得过量表达的异源重组蛋白，所述异源重组蛋白包括：s蛋白-phap重组蛋白（s-phap），m蛋白-phap重组蛋白（m-phap），e蛋白-phap重组蛋白（e-phap），n蛋白-phap重组蛋白（n-phap），冷冻干保存；

本实施例中，所述s蛋白、m蛋白、e蛋白、n蛋白与连接标签phap的基因序列的位置可互换；所述s蛋白、m蛋白、e蛋白、n蛋白可以是完整蛋白，也可以是部分功能的蛋白片段。

实施例3-含连接标签his的重组表面蛋白的制备

含连接标签his的重组表面蛋白的制备方法，包括：

根据2019年新型冠状病毒的含s蛋白、m蛋白、e蛋白、n蛋白和连接标签his的蛋白质序列，构建可在大肠杆菌为宿主的异源蛋白表达载体的质粒和酵母为宿主的异源蛋白表达载体的质粒；

采用大肠杆菌为合成宿主，t7或sp6启动子为被载体的启动子，经iptg诱导后，分别获得过量表达的异源重组蛋白，所述异源重组蛋白包括：s蛋白-his重组蛋白（s-his），m蛋白-his重组蛋白（m-his），e蛋白-his重组蛋白（e-his），n蛋白-his重组蛋白（n-his），冷冻干保存；

采用毕赤酵母为合成宿主，gap或aox1启动子为被载体的启动子，经甲醇或低温等方式诱导后，分别获得过量表达的异源重组蛋白，所述异源重组蛋白包括：s蛋白-his重组蛋白（s-his），m蛋白-his重组蛋白（m-his），e蛋白-his重组蛋白（e-his），n蛋白-his重组蛋白（n-his），冷冻干保存；

本实施例中，所述s蛋白、m蛋白、e膜蛋白、n蛋白与连接标签his的基因序列位置可互换；所述s蛋白、m蛋白、e蛋白、n蛋白可以是完整蛋白，也可以是部分功能的蛋白片段。

实施例4-含连接标签gst的重组表面蛋白的制备

含连接标签gst的重组表面蛋白的制备方法，包括：

根据2019年新型冠状病毒的含s蛋白、m蛋白、e蛋白、n蛋白和连接标签gst的蛋白质序列，构建可在大肠杆菌为宿主的异源蛋白表达载体的质粒和酵母为宿主的异源蛋白表达载体的质粒；

采用大肠杆菌为合成宿主，t7或sp6启动子为被载体的启动子，经iptg诱导后，分别获得过量表达的异源重组蛋白，所述异源重组蛋白包括：s蛋白-gst重组蛋白（s-gst），m蛋白-gst重组蛋白（m-gst），e蛋白-gst重组蛋白（e-gst），n蛋白-gst重组蛋白（n-gst），冷冻干保存；

采用毕赤酵母为合成宿主，gap或aox1启动子为被载体的启动子，经甲醇诱导后，分别获得过量表达的异源重组蛋白，所述异源重组蛋白包括：s蛋白-gst重组蛋白（s-gst），m蛋白-gst重组蛋白（m-gst），e蛋白-gst重组蛋白（e-gst），n蛋白-gst重组蛋白（n-gst），冷冻干保存；

本实施例中，所述s蛋白、m蛋白、e蛋白、n蛋白与连接标签gst的基因序列位置可互换；所述s蛋白、m蛋白、e蛋白、n蛋白可以是完整蛋白，也可以是部分功能的蛋白片段。

实施例5-含荧光蛋白的重组表面蛋白的制备

根据2019年新型冠状病毒的含s蛋白、m蛋白、e蛋白、n蛋白的蛋白质序列，与荧光蛋白序列构建可在大肠杆菌为宿主的异源蛋白表达载体的质粒和酵母为宿主的异源蛋白表达载体的质粒，所述荧光蛋白包括：红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白；

采用大肠杆菌为合成宿主，t7或sp6启动子为被载体的启动子，经iptg诱导后，可分别获得过量表达的异源带荧光重组蛋白，冷冻冻干保存。

采用毕赤酵母为合成宿主，gap或aox1启动子为被载体的启动子，经甲醇或低温等诱导后，分别获得过量表达的异源带荧光重组蛋白，冷冻冻干保存。

本实施例中所述重组表面蛋白含连接标签或不含连接标签。

实施例6-仿生2019新型冠状病毒的制备

一种仿生2019新型冠状病毒，其为核壳结构的纳米体系，内核为纳米颗粒，外壳为实施例1制备的不含连接标签的重组表面蛋白。

所述纳米颗粒利用带正电荷高分子材料制备。

本实施例所述纳米颗粒的制备材料和不含连接标签的重组表面蛋白的种类，详见表2。

表2-本实施例所用纳米颗粒的制备材料和重组表面蛋白的种类

其制备方法，步骤包括：

将质量比大于1ng:1ng的所述不含连接标签的重组表面蛋白与纳米颗粒混合5秒后，进行自组装，即得单一含s蛋白、m蛋白、e蛋白、n蛋白中的任一蛋白的仿生2019新型冠状病毒悬浊液。

所述自组装包括：在温度为30-37℃下，静置大于10分钟。

将所述悬浊液进行冻干，即得仿生2019新型冠状病毒冻干粉。

实施例7-仿生2019新型冠状病毒的制备

一种仿生2019新型冠状病毒，其为核壳结构的纳米体系，内核为纳米颗粒，外壳为实施例2制备的含连接标签phap的重组表面蛋白。

所述纳米颗粒利用疏水类生物材料制备。

本实施例所述纳米颗粒的制备材料与含连接标签phap的重组表面蛋白的种类，详见表3。

表3-本实施例所用纳米颗粒的制备材料与重组表面蛋白的种类

其制备方法，步骤包括：

将质量比大于1ng:1ng的所述含连接标签phap的重组表面蛋白与纳米颗粒混合5秒后，进行自组装，即可得到phap介导的单一含s蛋白、m蛋白、e蛋白、n蛋白中的任一蛋白的仿生2019新型冠状病毒的悬浊液。

所述含连接标签phap的重组表面蛋白包括：s蛋白-phap重组蛋白（s-phap），m蛋白-phap重组蛋白（m-phap），e蛋白-phap重组蛋白（e-phap），n蛋白-phap重组蛋白（n-phap）。

所述自组装包括：在温度为20-30℃下，静置大于30分钟。

将所述悬浊液进行冻干，即得仿生2019新型冠状病毒冻干粉。

实施例8-仿生2019新型冠状病毒的制备

一种仿生2019新型冠状病毒，其为核壳结构的纳米体系，内核为纳米颗粒，外壳为实施例3制备的含连接标签his的重组表面蛋白。

所述纳米颗粒是利用氧化锌制备得到；

本实施例所述纳米颗粒的制备材料与含连接标签his的重组表面蛋白的种类，详见表4。

表4-本实施例所用纳米颗粒的制备材料与重组表面蛋白的种类

其制备方法，步骤包括：

将质量比大于1ng:1ng的所述含连接标签his的重组表面蛋白与纳米颗粒混合5秒后，进行自组装，即可得到his介导的单一含s蛋白、m蛋白、e蛋白、n蛋白中的任一蛋白的仿生2019新型冠状病毒。

所述含连接标签his的重组表面蛋白包括：s蛋白-his重组蛋白（s-his），m蛋白-his重组蛋白（m-his），e蛋白-his重组蛋白（e-his），n蛋白-phap重组蛋白（n-his）。

所述自组装包括：在温度为4-8℃下，静置大于60分钟；

将所述悬浊液进行冻干，即得仿生2019新型冠状病毒冻干粉。

实施例9-仿生2019新型冠状病毒的制备

一种仿生2019新型冠状病毒，其为核壳结构的纳米体系，内核为纳米颗粒，外壳为实施例4制备的含连接标签gst的重组表面蛋白。

所述纳米颗粒是利用吸附谷胱甘肽的sio2制备得到。

本实施例所述纳米颗粒的制备材料与含连接标签gst的重组表面蛋白的种类，详见表5。

表5-本实施例所用纳米颗粒的制备材料和重组表面蛋白的种类

其制备方法，步骤包括：

将质量比大于1ng:1ng的所述含连接标签gst的重组表面蛋白与纳米颗粒混合5秒后，进行自组装，即可得到gst介导的单一含s蛋白、m蛋白、e蛋白、n蛋白中的任一蛋白的仿生2019新型冠状病毒。

所述含连接标签gst的重组表面蛋白包括：s蛋白-gst重组蛋白（s-gst），m蛋白-gst重组蛋白（m-gst），e蛋白-gst重组蛋白（e-gst），n蛋白-gst重组蛋白（n-gst）。

所述自组装包括：在温度为20-30℃下，静置大于30分钟；

将所述悬浊液进行冻干，即得仿生2019新型冠状病毒冻干粉。

实施例10-复合连接方式的仿生2019新型冠状病毒的制备

一种仿生2019新型冠状病毒，其为核壳结构的纳米体系，内核为纳米颗粒，外壳为实施例4制备的含连接标签gst的重组表面蛋白。

所述纳米颗粒是利用氧化锌制备得到。

本实施例所述纳米颗粒的制备材料与含连接标签gst的重组表面蛋白的种类，详见表7。

表7-本实施例所用纳米颗粒的制备材料和重组表面蛋白的种类

其制备方法，步骤包括：

按照大于1ng:1ng的质量比，分别将实施例1-4制备的所述重组表面蛋白中的任一种或多种，与任一或多种以上纳米颗粒混合5秒后，进行自组装，即可得到含n蛋白、s蛋白、e蛋白、m蛋白中的两种及以上的仿生2019新型冠状病毒的悬浊液。

所述自组装包括：在温度为20-30℃下，静置大于30分钟。

将所述悬浊液进行冻干，即得仿生2019新型冠状病毒冻干粉。

实施例11-本发明仿生2019新型冠状病毒的侵染性实验

根据文献（中国呼吸与危重监护杂志，2008(02):81-87+161-162；清华大学，2014；中国疾病预防控制中心，2016）对本发明仿生2019新型冠状病毒进行侵染性实验。

将本发明仿生2019新型冠状病毒接种细胞和小鼠。

1、考察刺激物对细胞病变的影响

（1）实验资料

293细胞接种于6孔培养板，长满后分为3组，其中，

实验组：本发明仿生2019新型冠状病毒刺激物；

对照组：普通灭活的病毒刺激物；

空白组：pbs刺激物。

（2）实验方法

分别加入刺激物10小时后观察细胞病变情况。

（3）实验结果

空白组和实验组都健康生长；对照组产生一定程度的细胞病变，主要是本发明仿生2019新型冠状病毒不具备自我复制能力，不会在细胞内自行组装病毒，而天然灭活病毒侵染细胞后自主装成病毒后崩解细胞。

2、考察气管滴注法对健康小鼠的影响

（1）实验资料

选鼠龄6-8周，体重20g左右的健康小鼠468只，进行气管滴注，随机分为实验组115组、对照组1组和空白组1组，每组4只。

实验组：本发明仿生2019新型冠状病毒刺激物；

对照组：普通灭活的病毒组刺激物；

空白组：pbs刺激物。

（2）实验方法

分别将100ul总量的液体给小鼠气管滴注。依次考察所有处理过的小鼠是否出现咳嗽、气促、呼吸困难、烦躁、耸毛等临床表现，并对其生存与死亡时间进行详细记录。72小时内摘眼球放血处死小鼠，详细观察肺、脾和淋巴结等组织的形态变化。取肺、脾组织常规病理学切片处理，进行he染色、免疫组化和免疫荧光，并且对处理过的小鼠进行抗体检测，

（3）实验结果

实验组和空白组都健康生长，但实验组和对照组均产生抗体，而空白组未产生抗体，详见表8。

表8-气管滴注法对健康小鼠的影响

3、考察尾静脉注射法对健康小鼠的影响

（1）实验资料

选鼠龄6-8周，体重20g左右的健康小鼠468只，进行尾静脉注射，随机分为实验组115组、对照组1组和空白组1组，每组4只。

实验组：本发明仿生2019新型冠状病毒刺激物；

对照组：天然灭活的病毒刺激物；

空白组：pbs刺激物。

（2）实验方法

分别将100ul总量的液体通过尾静脉注射入小鼠。依次考察所有处理过的小鼠是否出现咳嗽、气促、呼吸困难、烦躁、耸毛等临床表现，并对其生存与死亡时间进行详细记录。72小时内摘眼球放血处死小鼠，详细观察肺、脾和淋巴结等组织的形态变化。取肺、脾组织常规病理学切片处理，进行he染色、免疫组化和免疫荧光，并且对处理过的小鼠进行抗体检测。

（3）实验结果

空白组和实验组都健康生长；对照组发生严重的细胞病变和临床病症，详见表9。

表9-静脉注射法对健康小鼠的影响

通过细胞试验以及表8、表9可知，对照组出现严重病变，空白组、实验组中的细胞通过镜检并未发现病变情况；小鼠除了对照组出现病毒侵染的情况外，实验组和空白组的小鼠都未出现病毒侵染的情况，但是实验组和对照组都能检测到抗体。

综合上述，本发明仿生2019新型冠状病毒具有侵染性，但是不会出现病变。

实施例12-本发明仿生2019新型冠状病毒的传染性实验

1、将侵染的细胞转接到健康细胞中，健康细胞没有受到侵染。实施例11中的细胞消化收集以后离心，去掉上清，加pbs反复悬浮离心三次后对细胞进行计数，取１×10^４个细胞到健康细胞中；空白组、实验组和对照组加同等数量的健康细胞，10小时以后观察细胞病变情况。

2、将接种本发明仿生2019新型冠状病毒的小鼠放到健康小鼠笼中，观察健康小鼠是否受到感染，结果发现健康小鼠没有受到感染。

同实施例11的实验方法，利用气管滴注法获取三组小鼠，分别是空白pbs组1只、天然灭活病毒组1只、本发明仿生2019新型冠状病毒组115只，分别放进空白组1组、对照组1组、实验组115组，所述空白组、对照组和实验组中均有3只健康小鼠。依次考察每组健康小鼠是否出现咳嗽、气促、呼吸困难、烦躁、耸毛等临床表现，并对其生存与死亡时间进行详细记录。72小时内摘眼球放血处死小鼠，详细观察肺、脾和淋巴结等组织的形态变化。取肺、脾组织常规病理学切片处理，进行he染色、免疫组化和免疫荧光，并且对处理过的小鼠进行抗体检测，结果见表10。

表10-传染性实验结果

通过细胞试验以及表10可知，除天然灭活病毒组中的健康细胞被再次侵染外，其余两组中的健康细胞通过镜检并未发现病变情况；小鼠除了天然灭活病毒对照组死亡表现出病毒传染情况，其余实验组和空白组的健康小鼠都没有出现病毒传染的情况。

因此，本发明仿生2019新型冠状病毒无传染性。

实施例13-本发明仿生2019新型冠状病毒各组分的侵染性对比实验

根据文献（中国呼吸与危重监护杂志，2008(02):81-87+161-162；清华大学，2014；中国疾病预防控制中心，2016）对本发明仿生2019新型冠状病毒进行各组分的侵染性实验。

将本发明仿生2019新型冠状病毒各组分接种细胞和小鼠。

1、考察刺激物对细胞病变的影响

（1）实验资料

293细胞接种于6孔培养板，长满后分为3组，其中

实验组：本发明仿生2019新型冠状病毒组刺激物；

对照组：s、m、e、n四种蛋白及其含有phap、his、gst连接标签的蛋白溶液；

空白组：通过表1材料制备的纳米颗粒。

（2）实验方法

分别加入刺激物10小时后观察细胞病变情况。

（3）实验结果

空白组、实验组和对照组都健康生长；实验组和对照组都产生一定程度的细胞数量上的差异，但是实验组效果更明显，可能是本发明仿生2019新型冠状病毒更易侵染细胞，原因在于本发明仿生2019新型冠状病毒的核壳结构能够局部浓缩重组表面蛋白，而局部浓缩更易被细胞吞噬，达到更强有力的侵染效果。

2、考察气管滴注法对健康小鼠的影响

选鼠龄6-8周，体重20g左右的健康小鼠120只，进行气管滴注，随机分为实验组10组、对照组10组、空白组10组，每组4只。

实验组：本发明仿生2019新型冠状病毒组刺激物；

对照组：s、m、e、n四种蛋白或含有phap、his、gst连接标签的s、m、e、n四种蛋白的蛋白溶液；

空白组：通过表1材料制备的纳米颗粒。

分别将100ul总量的液体给小鼠气管滴注。依次考察所有处理过的小鼠是否出现咳嗽、气促、呼吸困难、烦躁、耸毛等临床表现，并对其生存与死亡时间进行详细记录。72小时内摘眼球放血处死小鼠，详细观察肺、脾和淋巴结等组织的形态变化。取肺、脾组织常规病理学切片处理，进行he染色、免疫组化和免疫荧光，并且对处理过的小鼠进行抗体检测，结果见表11。

表11-气管滴注法对健康小鼠的影响

3、考察尾静脉注射法对健康小鼠的影响

选鼠龄6-8周，体重20g左右的健康小鼠120只，进行气管滴注，随机分为实验组10组、对照组10组、空白组10组，每组4只。

实验组：本发明仿生2019新型冠状病毒组刺激物；

对照组：s、m、e、n四种蛋白及其含有phap、his、gst连接标签的蛋白溶液；

空白组：通过表1材料制备的纳米颗粒。

分别将100ul总量的液体给小鼠气管滴注。依次考察所有处理过的小鼠是否出现咳嗽、气促、呼吸困难、烦躁、耸毛等临床表现，并对其生存与死亡时间进行详细记录。72小时内摘眼球放血处死小鼠，详细观察肺、脾和淋巴结等组织的形态变化。取肺、脾组织常规病理学切片处理，进行he染色、免疫组化和免疫荧光，并且对处理过的小鼠进行抗体检测，结果见表12。

表12-静脉注射法对健康小鼠的影响

通过细胞试验以及表11、表12可知，注射本发明仿生2019新型冠状病毒的健康细胞被侵染更明显；对照组的健康细胞通过镜检也发现侵染情况，但都健康生长；空白组的健康细胞未出现病毒侵染的情况；同时，实验组产生抗体的速度比对照组快。

因此，本发明的具有核壳结构的仿生2019新型冠状病毒侵染性更强，抗体产生速率更快，说明本发明的仿生2019新型冠状病毒能够局部浓缩蛋白浓度，提高了蛋白含量，可更容易被免疫细胞吞噬，提升了抗体产生的效率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。