一种用于样本保存及原体核酸快速提取的器具及方法与流程

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种用于样本保存及病原体核酸快速提取的器具及方法。

背景技术：

感染性疾病通常由病原微生物感染引起，其宿主常常为人、牲畜、家禽及其他哺乳类动物。随着社会经济的迅速发展,人们的生活方式也发生了较大的变化,这给传染病防治工作带来了新的问题和挑战。sars，ebola，mers，ncp等流行病的爆发，对国家政府甚至国际机构应对突发重大公共卫生事件的能力水平提出了巨大挑战。第一时间快速响应，最快最有效的诊断大规模病例，成为了防疫治疫的重中之重。

传统的病原微生物检验方法常有灵敏度不高或特异性较低等问题,在诊断低浓度样本,混合感染或不明原因感染时显示出局限性。随着分子生物学与基因组学的不断发展,各种核酸检测方法与抗体检测技术逐渐成为公共卫生、临床检验、畜牧业检疫等领域的重要工具。但是对于多数病原微生物，市场上无特异性抗体，即使蛋白结构清楚，也很难在短时间内研发出安全有效的抗体，从而产生研发成本高，周期长的问题，且由于窗口期和技术敏感性等问题，使得利用蛋白抗原抗体结合的免疫检测技术难以适用于所有病原体的检测。尽管核酸检测可以很好的解决这些问题，但其技术本身也存在一些困难，如核酸的不稳定性，前期样本收集和处理不当，会导致rna的降解；操作步骤繁琐，因为技术敏感性高，过多的步骤容易导致样本的污染，并且多次开盖，换管，也会增加感染的风险；操作时间长，对操作人员，尤其是核酸提取人员要求高；当感染程度较低，病原体滴度低时，传统的核酸提取往往会造成较大程度的病原体核酸丢失，从而无法检测到病原体核酸；试剂种类多，且部分有害，对废液需要做特殊处理等。

要有效获得病原体核酸，需要有效的捕获病原体。病毒往往存在于宿主细胞表面，以及细胞外的体液中，病毒核酸常常存在于细胞内部，可能有少量存在于细胞外的体液中。传统方法将样本保存于固定液或保护液中，多数采用离心的方法获得宿主细胞，只是对宿主细胞进行裂解，因此病毒获得量有限。细菌一般存在于细胞外，如需去除宿主细胞，传统方法往往步骤繁多，而且依然无法完全分离宿主细胞和细菌。目前二代测序被广泛应用，但是由于宿主dna污染严重，往往需要牺牲大量数据，经过一定的时间，以获得细菌测序结果。

技术实现要素：

为解决目前核酸检测步骤繁多，时间较长的问题，本发明提出一种用于样本保存及原体核酸快速提取的器具及方法，缩短了核酸检测前的样本处理和提取时间，简化了操作流程，降低了设备、试剂以及人力成本，从而进一步扩大了核酸检测的应用空间，将为促进公共卫生快速检测防疫工作更快更广的开展提供重要的技术手段。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种用于样本保存及原体核酸快速提取的器具包括收集反应管、推杆。

所述的收集反应管包括带有刻度的通管，通管一端设有与通管连通的出液管，通管另一端向外延伸形成连接口，收集反应管还包括分别与出液管、连接口适配的盖子。

作为优选，通管、出液管、连接口为一体成型，材料优选为聚丙烯，具有耐高温，耐酸碱，成本低，易加工的特点。通管中空，上下通透，液体可上进下出。

作为优选，出液管呈圆柱形，出液管的直径小于通管直径，出液管设有外螺纹，通管内在与出液管连接处设有滤膜，滤膜外径与通管内径相等；连接口设有外螺纹。与出液管、连接口相配的盖子侧壁设有内螺纹，方便拧紧。

作为优选，滤膜固定在通管与出液管的连接处，由于出液管的直径小于通管直径，使通管内液体完全经过滤膜后进入出液管。

作为优选，所述盖子底部固定有密封垫，密封垫选用硅胶材料，密封垫的面积略大于盖子底部面积，与盖子底部紧配合，在使用时由于需要加热，管中有液体，压力增大，硅胶垫可以很好的起到缓冲作用，避免产生意外。

所述连接口的盖子在底部设有通孔，通孔直径小于盖子底部直径，密封垫起到密封作用，同时在需要加样的情况下，不用开盖，在用针头穿刺硅胶垫加样后，硅胶垫仍能保持密合性。

所述的推杆呈“工”字形，选用聚丙烯材料，在通管内的活塞端在通管内滑动，活塞端顶部设有一层橡胶层，起到加压排出液体的作用。推杆的长度大于通管与连接口的长度和。

作为优选，在通管与连接口之间设有外延层与连接口、通管内径相同，外延层的外径大于通管外径，便于推杆的推动。

本发明的收集反应管可作样本收集和保存用途。

使用所述的快速提取病原体核酸样本的器具提取病原体核酸样本的方法，包括提取病毒核酸与细菌核酸两种提取方法：

当提取病毒核酸时：

（1）打开第一收集反应管连接口盖子，将样本加入预置有裂解液的管中，盖上盖，震荡混匀；

（2）加热试管到65℃保温10-15min，在75-95℃保温5-10min；

（3）打开连接口盖子，放进第一收集反应管推杆，打开出液管盖子，向下推动推杆，收集液体，即为核酸终产物，然后冷冻保存；

当提取细菌核酸时：

（1）打开连接口盖子，在第一收集反应管内加入样本，样本体积小于最大刻度，加入pbs（磷酸盐缓冲盐水）或医用生理盐水至最大刻度的90%，放入第一收集反应管推杆，打开出液管盖子，使用第二收集反应管收集滤过后的液体；

（2）推入第二收集反应管推杆，打开出液管盖子，滤过的液体做医疗垃圾处理，拿开推杆，盖上出液管盖子，在第二收集反应管内加入裂解液；

（3）盖上连接口盖子，加热试管在65℃保温15-20mins，在95℃保温5mins；

（4）打开连接口盖子，放进第二收集反应管推杆，打开出液管盖子，向下推动推杆，收集液体，即为核酸终产物，然后冷冻保存。

本发明从样本收集到核酸提取，操作时间不超过30分钟，仅仅使用不超过两个收集反应管，不超过两种试剂。

所述样本类型包括唾液，气管及肺泡灌洗液，口咽、鼻腔及阴道拭子，血清，尿液，粪便，痰液。

所述第一收集反应管的滤膜为聚酰胺材料，孔径为10μm，其目的是为了阻隔样本中杂质进入到终产物中；在需要提取细菌dna时，该滤膜可阻隔宿主细胞，而使细菌和其他液体流过。

所述第二收集反应管为聚四氯乙烯材料，孔径为0.22μm，可有效阻隔细菌，使得液体滤过，加入裂解液后，可有效裂解细菌。

作为优选，收集反应管有大小之分，对于小体积以及不用去除宿主细胞的样本，选用5ml收集反应管，对于体积=<5ml的样本，如需提取细菌dna,，选择5ml收集反应管；对于体积>5ml的样本，如需提取细菌dna，选择50ml收集反应管。作为优选，第一收集反应管与第二收集反应管的盖子颜色有所不同，且生产包装时可用管侧的标签标记，从而进行区分。

当提取病毒核酸时，液体样本体积与裂解液体积比例1-2:1。若样本为粪便，样本体积与裂解液体积比例0.1-0.5:1；若样本为拭子，将棉签端折断，放入管中。

当提取细胞病毒时，加入样本，不超过第一收集反应管最大刻度，如样本体积小于最大刻度的20%，加入pbs或医用生理盐水至最大刻度的80-90%。如使用拭子，可在预置有pbs或医用生理盐水的收集反应管中剧烈震荡，然后取出，如需提高细菌核酸的产量，可在取出后折断拭子头，放入第二收集反应管中。

所述裂解液为尿素8m+蛋白酶k100μg/ml。尿素可使病毒及细菌蛋白质变性，从而使核酸释放；蛋白酶k可降解样本中蛋白质，尤其是可以导致核酸降解的核酸酶，以及影响下游反应的其他酶类。

作为优选，当样品为粘稠物时，如痰液，所述裂解液由氢氧化钠0.2m+尿素8m+蛋白酶k100μg/ml，中和液组成，所述中和液为tris（三羟甲基氨基甲烷）-hcl（ph7.5）。氢氧化钠用于液化样本，减低样本粘稠度，有助于下一步反应发生。tris-hcl用于中和氢氧化钠造成的ph改变。上述试剂均不会对下游的pcr等酶反应造成任何影响。

当样本为抗凝全血时，再加入裂解液前，先加入红细胞裂解液对样本进行处理。

提取方法中加热分段保温，第一步高温加热是蛋白酶k降解其他蛋白质的反应温度，第二步加热是为了是蛋白酶k灭活以及使细菌包膜破裂。该裂解液不会对下游的pcr等酶反应造成任何影响。作为优选，若提取终产物为rna，放入水浴箱，加热试管在65℃保温10-15mins，在75℃保温10mins。若提取终产物dna，加热试管在65℃保温15-20mins，在95℃保温5mins。

所述裂解液也可作为核酸保护液，如果现场不提取核酸，而需要运输或暂时保存时，可将样本保存于有裂解液的收集反应管，室温不超过8小时，4℃不超过24小时，或者-20℃不超过1个月。

本发明采用收集反应管解决收集与裂解、一步法灭活并裂解的方法提取病毒核酸，对样本中液体和细胞的直接裂解，可以最大程度的获得病毒核酸。利用细菌与宿主细胞大小的区别，采用滤膜快速分离宿主细胞与细菌、一步法裂解的方法提取细菌核酸。该方法可减少液体转移步骤，避免吸附和洗脱步骤，可最大程度避免核酸的降解和丢失。病原体立刻灭活，试剂均安全无毒，操作简单，实验产生的废物废液极少，可极大程度避免人员感染和环境污染的风险。利用本方法所提取的rna和dna，无需进一步纯化，可直接用于逆转录、pcr、二代测序（需稀释）等下游检测。从样本收集到核酸提取，操作时间不超过30分钟，仅仅使用不超过两个收集反应管，不超过两种试剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：该方法大大缩短了核酸检测前的样本处理和提取时间，简化了操作流程，降低了设备、试剂以及人力成本，从而进一步扩大了核酸检测的应用空间，将为促进公共卫生快速检测防疫工作更快更广的开展提供重要的技术手段。

附图说明

图1为本发明快速提取病原体核酸样本的器具的结构示意图；

其中，1为通管，2为连接口，21为连接口盖子,22为通孔，3为出液管，31为出液管盖子，4为推杆，41为橡胶层，5为密封垫，6为滤膜。

图2为提取病毒核酸流程示意图；

图3为提取细菌核酸流程示意图。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，实施例中所用原料均可市购或采用常规方法制备。

商品化红细胞裂解液，如博士德生物，货号ar1118。仅当样本为全血，提取细菌dna时，用于裂解红细胞。

实施例采用1.5ml无核酸酶离心管，用于核酸终产品的收集和保存。

实施例1

一种快速提取病原体核酸样本的器具如图1所示，包括收集反应管、推杆4。

所述的收集反应管包括带有刻度的通管1，通管1一端设有与通管连通的出液管3，通管另一端向外延伸形成连接口2，连接口2的内径与通管1的内径相同。通管1、出液管3、连接口2为一体成型，用聚丙烯材料制成。出液管1呈圆柱形，出液管3的直径小于通管1直径，出液管3设有外螺纹，连接口2设有外螺纹，出液管盖子31、连接口盖子21侧壁设有内螺纹，方便拧紧。连接口盖子21在底部设有通孔22，通孔22直径小于盖子21底部直径。出液管盖子31、连接口盖子21底部固定有密封垫6，密封垫6使用硅胶材料制成，起到密封作用。

通管1内在与出液管3连接处固定滤膜5，滤膜5外径与通管1内径相等；使通管1内液体完全经过滤膜后进入出液管3。

推杆4呈“工”字形，选用聚丙烯材料制成，推杆4在通管1内的活塞端顶部设有一层橡胶层41，推杆的长度大于通管与连接口的长度和。

第一收集反应管的滤膜5孔径为10μm，刻度5ml收集反应管的通管1长6.5cm，通管1与连接口2的直径1.8cm，出液口3的直径为1.0cm，滤膜5厚度0.2cm，连接口2长度为0.8cm。刻度50ml收集反应管（通管1长6.5cm，通管1与连接口2的直径5.5cm，出液口3的直径为3.0cm）第一收集反应管的盖子为红色，区分于第二收集反应管。

第二收集反应管的滤膜5孔径为0.22μm，刻度5ml收集反应管的通管1长6.5cm，通管1与连接口2的直径1.8cm，出液口3的直径为1.0cm，滤膜5厚度0.2cm，连接口2长度为0.8cm。刻度50ml收集反应管（通管1长6.5cm，通管1与连接口2的直径5.5cm，出液口3的直径为3.0cm）第一收集反应管的盖子为蓝色，区分于第一收集反应管。

利用第一收集反应管与第二收集反应管按照如图2所示的流程方法进行病毒rna或者dna的样本收集和提取，按照如图3所示的流程方法进行细菌dna的样本收集和提取。

提取例1：对于病毒rna的样本收集和提取方法（样本为尿液）

（1）刻度5ml的第一收集反应管中预置裂解液300μl（尿素8m+蛋白酶k100μg/ml）。

（2）打开连接口盖子21，将新鲜采集的尿液500μl直接加入第一收集反应管中，盖上盖子21，震荡管身，混匀。

（3）放入水浴箱，加热试管在65℃保温15mins，75℃10mins，加热过程中，震荡。

（4）打开盖子21，放置推杆4；打开盖子31；向下推动推杆4，使用收集管收集液体，即为核酸终产物为rna，然后进行-80冻存。

提取例2：对于病毒dna的样本收集和提取方法（样本为阴道拭子）

（1）第一收集反应管中预置裂解液400μl（尿素8m+蛋白酶k100μg/ml）。

（2）打开盖子21，将阴道棉签端折断，放入管中，盖上盖子21，震荡管身，混匀。

（3）因为要提取的终产物，加热试管在65℃保温20mins，在95℃保温5mins。加热过程中，震荡。

（4）打开上盖21，放置推杆4；打开下盖31；向下推动推杆，拭子可不取出，避免污染，因为液体体积不超过1.5ml，整个收集反应管大于5ml，因此注射器推杆,4不必推至管底也可以将全部液体推出；收集液体进入收集管，极为核酸终产物为dna，然后进行-80冻存。

提取例3：对于病毒rna的样本收集和提取方法（样本为痰液）

（1）第一收集反应管收中预置裂解液400μl（氢氧化钠0.2m+尿素8m+蛋白酶k100μg/ml）。

（2）打开盖子21，将新鲜采集的痰液400μl直接加入收集反应管中，盖上盖子21，震荡管身，混匀。

（3）放入水浴箱，加热试管在65℃保温10mins，在75℃保温10mins，加热过程中，震荡。

（4）从水浴箱中取出，用针管直接从盖a上扎入，加入中和液tris-hcl（ph7.5）200μl。

（5）打开上盖21，放置推杆4；打开下盖31；向下推动推杆4；收集液体进入收集管，极为核酸终产物rna，然后进行-80冻存。

提取例4：对于细菌dna的样本收集和提取方法（样本为粪便）

（1）在刻度5ml的第一收集反应管中直接加入样本，样本体积小于最大刻度的20%，加入医用生理盐水至4ml，震荡后放入推杆4，打开盖子31，向下推动推杆，收集滤过的液体进入第二收集反应管。

（2）在收集有滤过样本的刻度为5ml的第二收集反应管，放入推杆4，打开盖子31，滤过的液体做医疗垃圾处理，盖上盖子31；加入裂解液（尿素8m+蛋白酶k100μg/ml）100μl，盖上盖子21。

（3）在水浴槽中加热试管在65℃保温20mins，在95℃保温5mins，加热过程中，震荡。

（4）打开上盖21，放置推杆4；开下盖31；向下推动推杆；收集液体进入收集管，即为核酸终产物dna，然后进行-80冻存。

提取例5：对于细菌dna的样本收集和提取方法（样本为鼻腔拭子）

（1）在刻度为50ml的第一收集反应管中直接加入拭子头，加入pbs至45ml刻度处，震荡，然后取出拭子，取出后折断拭子头，放入刻度为50ml的第二收集反应管中，放入第一收集反应管推杆4，打开盖子31，向下推动推杆，收集滤过的液体进入已放入拭子的第二收集反应管。

（2）在收集有滤过样本的第二收集反应管，放入推杆4，打开盖子31，滤过的液体做医疗垃圾处理，盖上盖31；加入裂解液（尿素8m+蛋白酶k100μg/ml）500μl，盖上盖子21。

（3）在水浴槽中加热试管在65℃保温15mins，在95℃保温5mins，加热过程中，震荡。

（4）打开上盖21，放置推杆4；开下盖31；向下推动推杆；收集液体进入收集管，极为核酸终产物dna，然后进行-80冻存。

提取例6：对于细菌dna的样本收集和提取方法（样本类型：抗凝全血）

（1）在刻度为5ml的第一收集反应管中直接加入样本到刻度3ml，放入推杆4，打开盖子31，收集滤过的液体进入刻度为5ml的第二收集反应管。

（2）在收集有滤过样本的第二收集反应管，放入推杆4，打开盖子31，滤过的液体做医疗垃圾处理；立刻加入红细胞裂解液2ml，放入推杆滤过的液体做医疗垃圾处理；再次加入红细胞裂解液2ml，放入推杆，滤过的液体做医疗垃圾处理；加入pbs2ml，放入推杆c，滤过的液体做医疗垃圾处理；盖上盖子31。

（3）加入裂解液（尿素8m+蛋白酶k100μg/ml）100μl，盖上盖子21，在水浴槽中加热试管在65℃保温18mins，在95℃保温5mins，加热过程中，震荡。

（4）打开上盖21，放置推杆4；开下盖31；向下推动推杆；收集液体进入收集管，极为核酸终产物dna，然后进行-80冻存。