一种胎盘底蜕膜干细胞的分离方法与流程

本发明涉及一种胎盘底蜕膜干细胞的分离方法，属于再生医学和生物学
技术领域：
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背景技术：
：随着对间充质干细胞(msc)日渐深入的研究，msc移植已经成为治疗许多系统疾病的有效手段。近年来，胎盘成为众多学者关注的mscs重要来源，已有学者成功从胎盘胎儿侧的羊膜和绒毛膜中分离出具有移植潜能的mscs，但对母体侧的底蜕膜却鲜有研究。胎盘中提取的底蜕膜干细胞不但具有含量丰富和移植后排斥反应低、无伦理障碍等优点。底蜕膜间充质干细胞增殖能力强，倍增时间快于其他文献报道的骨髓、脂肪以及绒毛膜来源的间充质干细胞，且细胞周期与其他来源的间充质干细胞类似。目前，胎盘底蜕膜干细胞的分离提取方法主要采用酶消化方法，尽管酶解法能获取数量充足的细胞，但其中的底蜕膜干细胞含量较低。此外，对胎盘底蜕膜部位进行酶解消化提取，消化组织体积大，耗时长，其获取细胞数量大，但是干细胞的活率较低；底蜕膜提取干细胞，其获取细胞中含有大量的杂细胞，给后续纯化造成麻烦；整个底蜕膜干细胞提取过程，步骤繁琐，提取的细胞数量波动性较大、污染几率大大增加，不利于工业化生产。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种胎盘底蜕膜干细胞的分离方法，该方法采用了新的酶解方案，显著的提高了细胞活性，提取出的细胞数量充足且其中含有底蜕膜干细胞数量高。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种胎盘底蜕膜干细胞的分离方法，包括如下步骤：(1)采集胎盘，并浸泡于胎盘保存液中；(2)将步骤(1)所述的胎盘进行底蜕膜剥离，获得底蜕膜，用清洗液初步清洗底蜕膜，然后用一次性移液管吸取清洗液再次清洗，直至底蜕膜血液被清洗干净；(3)用剪刀将步骤(2)处理后的底蜕膜剪碎，将剪碎后的底蜕膜用酶解液a进行酶解后离心，弃上清液，再用酶解液b进行酶解；(4)将步骤(3)酶解后的组织液取出，分装至离心管中，并加入细胞清洗液，配平后离心；(5)倒掉步骤(4)离心后的上清液，加入细胞清洗液重悬细胞沉淀，再用细胞筛网过滤到离心管中，混匀后取细胞悬液用细胞计数板计数，然后配平后离心；(6)倒掉步骤(5)离心后的上清液，用培养基溶液调整细胞接种密度，添加双抗，混匀后接种。本发明的发明人通过研究发现：酶解法用于提取胎盘底蜕膜干细胞关键是提高干细胞的提取数量、保证干细胞的存活率。因此，本发明所述的胎盘干细胞的分离方法中，酶解液的组成成分、提取条件成为至关重要的因素。在本发明以前，胎盘羊膜是胎盘干细胞的主要提取组织；对羊膜进行机械剪碎后用酶液进行酶解提取，所获得的细胞数量充足，但是含有的杂细胞数量大，干细胞的数量较低。本发明旨在优化酶解液成分，增加营养供给，提高细胞抗凋亡特性。此外，本发明所述的胎盘干细胞的分离方法所提取的细胞污染率极低；本发明所述的分离方法整个操作工程简单有效，显著提高分离提取效率；同时优化提取分离的条件，尽可能的提高底蜕膜干细胞的存活率。作为本发明所述胎盘干细胞的分离方法的一种优选实施方式，步骤(1)的具体操作为将分娩后获得的胎盘在6小时内浸泡于保存液，所述保存的温度为4℃；所述胎盘保存液为pbs中含有1×-2×双抗、体积浓度为10％高糖dmem的基础培养基。本发明选用健康分娩的胎盘，采用低温胎盘保存液对胎盘进行保存，在6小时后进入试验流程，在短时间内尽可能的提取出活性高的造血干细胞。作为本发明所述胎盘干细胞的分离方法的一种优选实施方式，步骤(2)中，所述初步清洗底蜕膜的清洗液为0-4℃pbs，所述一次性移液管的体积为10ml。作为本发明所述胎盘干细胞的分离方法的一种优选实施方式，步骤(3)中，底蜕膜剪碎后的面积为3×3cm2；在37℃，酶解液a与底蜕膜以10:1的体积比，200r酶解0.5h，1500rpm离心5min；在37℃，酶解液b与底蜕膜以20:1的体积比，200r酶解1.5-2.5h。作为本发明所述胎盘干细胞的分离方法的一种优选实施方式，所述酶解液a为含有质量浓度为0.25％胰酶和质量浓度为0.02％edta的dmem高糖基础培养基；所述酶解液b为含有0.1-0.2mg/ml胶原酶ⅳ、0.01-0.05mg/ml中性酶、5-10ng/mlfasligand抑制剂和5-10ng/mlsurvivin抑制剂的dmem高糖基础培养基。本发明所述的胎盘保存液中含有脐血浆等营养物质，保证了胎盘组织的营养供给；还添加了survivin抑制剂(抗凋亡试剂)，极大的抑制了细胞启动凋亡程序，调高了细胞的活率，酶解液中dmem高糖基础培养基作为溶剂，在酶解过程中为细胞提供营养供给，保证了细胞的活力。作为本发明所述胎盘干细胞的分离方法的一种优选实施方式，步骤(4)中，取出组织液，分装至4支50ml离心管，所述离心管中每管中的组织液不超过25ml，所述加入细胞清洗液的体积与所述组织液相同，所述离心的速率为2000rpm，所述离心的时间为5min。作为本发明所述胎盘干细胞的分离方法的一种优选实施方式，步骤(5)中，用移液管向每管加入10ml细胞清洗液重悬细胞沉淀，用100μm细胞筛网过滤到1支50ml离心管中，混匀后用移液枪头取50-200μl细胞悬液用细胞计数板计数；所述离心的速率为2000rpm，所述离心的时间为5min。作为本发明所述胎盘干细胞的分离方法的一种优选实施方式，所述细胞计数板计数具体为按细胞悬液与0.4％台盼蓝以1:1的混匀后，取10μl滴至细胞计数板上计数，检测细胞活力并计算细胞总数。其中，所述0.4％台盼蓝为购买的商品，品牌为sigma，批号为rnbg4319，货号为t8154-100ml。作为本发明所述胎盘干细胞的分离方法的一种优选实施方式，步骤(6)中，所述培养基为lonza完全培养基，所述细胞接种密度为(1-1.5)×105cell/ml，所述双抗为100×双抗。作为本发明所述胎盘干细胞的分离方法的一种优选实施方式，步骤(6)中，用10cm培养皿接种的步骤为用移液管接种10ml的细胞悬液至10cm培养皿中；用15cm培养皿接种的步骤为用移液管接种20ml的细胞悬液至15cm培养皿中；接种后十字摇晃培养皿5次，使细胞悬液均匀分布于培养皿中。本发明所述的胎盘干细胞的分离方法，采用了双酶解法提取胎盘底蜕膜细胞，该方法操作步骤简单，细胞获取率高，提取的细胞数量足够、细胞活率高。此外，本发明旨在全方位提取胎盘的底蜕膜细胞。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明所述的胎盘干细胞的分离方法，操作步骤简化，实验操作时间短，提取的细胞污染几率低；(2)本发明所述的胎盘干细胞的分离方法，提取的细胞数量充足，其中的干细胞的含量大大提高，且细胞活率高；(3)本发明所述的胎盘干细胞的分离方法所提取的细胞数量较稳定。附图说明图1为本发明实施例1所述的胎盘底蜕膜干细胞的分离方法提取细胞在显微镜下的细胞形态学观察图；图2为本发明实施例2所述的胎盘底蜕膜干细胞的分离方法提取细胞在显微镜下的细胞形态学观察图；图3为本发明实施例3所述的胎盘底蜕膜干细胞的分离方法提取细胞在显微镜下的细胞形态学观察图；图4为对比例1所述的胎盘底蜕膜干细胞的分离方法提取细胞在显微镜下的细胞形态学观察图；图5为对比例2所述的胎盘底蜕膜干细胞的分离方法提取细胞在显微镜下的细胞形态学观察图。具体实施方式为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本发明以下实施例所述的0.4％台盼蓝为购买的商品，品牌为sigma，批号为rnbg4319，货号为t8154-100ml。实施例1本实施例为本发明所述的一种胎盘干细胞的分离方法，包括如下步骤：(1)采集胎盘，并浸泡于胎盘保存液中：将分娩后获得的胎盘在6小时内浸泡于含有1×-2×双抗、体积浓度为10％高糖dmem的基础培养基的pbs保存液，4℃保存运输；(2)将步骤(1)所述的胎盘进行底蜕膜剥离，获得底蜕膜，用0℃pbs初步清洗胎盘底蜕膜，然后用10ml一次性移液管吸取清洗液至组织中，直至底蜕膜血液被清洗干净；(3)用剪刀将步骤(2)处理后的底蜕膜剪碎，面积为3×3cm2，将剪碎后的底蜕膜，在37℃，用酶解液a(含有质量浓度为0.25％胰酶和质量浓度为0.02％edta的dmem高糖基础培养基)与底蜕膜以10:1的体积比，200r酶解0.5h，1500rpm离心5min；在37℃，用酶解液b(含有0.1mg/ml胶原酶ⅳ、0.01mg/ml中性酶、5ng/mlfasligand抑制剂和5ng/mlsurvivin抑制剂的dmem高糖基础培养基)与底蜕膜以20:1的体积比，200r酶解1.5h；(4)将步骤(3)酶解后的组织液取出，分装至4支50ml离心管(每管不超过25ml)，并加入等体积的细胞清洗液，配平后放入离心机内2000rpm离心5min；(5)轻轻倒掉步骤(4)离心后的上清液，用移液管向每管加入10ml细胞清洗液重悬细胞沉淀，用100μm细胞筛网过滤到1支50ml离心管中，混匀后用移液枪头取50μl细胞悬液用细胞计数板计数，离心管配平后放入离心机内2000rpm离心5min；细胞计数方法：按细胞悬液：0.4％台盼蓝(体积比)＝1:1的比例，混匀后取10μl滴至细胞计数板上计数，检测细胞活力并计算细胞总数；(6)倒掉步骤(5)离心后的上清液，根据细胞计数结果，用lonza完全培养基溶液调整细胞接种密度为1×105cell/ml，根据体积添加100×双抗，混匀后接种；其中，用10cm培养皿接种的步骤为用移液管接种10ml的细胞悬液至10cm培养皿中；用15cm培养皿接种的步骤为用移液管接种20ml的细胞悬液至15cm培养皿中；接种后十字摇晃培养皿5次，使细胞悬液均匀分布于培养皿中。实施例2本实施例为本发明所述的一种胎盘干细胞的分离方法，包括如下步骤：(1)采集胎盘，并浸泡于胎盘保存液中：将分娩后获得的胎盘在6小时内浸泡于含有1×-2×双抗、体积浓度10％高糖dmem的基础培养基的pbs保存液，4℃保存运输；(2)将步骤(1)所述的胎盘进行底蜕膜剥离，获得底蜕膜，用4℃pbs初步清洗胎盘底蜕膜，然后用10ml一次性移液管吸取清洗液至组织中，直至底蜕膜血液被清洗干净；(3)用剪刀将步骤(2)处理后的底蜕膜剪碎，面积为3×3cm2，将剪碎后的底蜕膜，在37℃，用酶解液a(含有质量浓度为0.25％胰酶和质量浓度为0.02％edta的dmem高糖基础培养基)与底蜕膜以10:1的体积比，200r酶解0.5h，1500rpm离心5min；在37℃，用酶解液b(含有0.2mg/ml胶原酶ⅳ、0.05mg/ml中性酶、10ng/mlfasligand抑制剂和10ng/mlsurvivin抑制剂的dmem高糖基础培养基)与底蜕膜以20:1的体积比，200r酶解2.5h；(4)将步骤(3)酶解后的组织液取出，分装至4支50ml离心管(每管不超过25ml)，并加入等体积的细胞清洗液，配平后放入离心机内2000rpm离心5min；(5)轻轻倒掉步骤(4)离心后的上清液，用移液管向每管加入10ml细胞清洗液重悬细胞沉淀，用100μm细胞筛网过滤到1支50ml离心管中，混匀后用移液枪头取200μl细胞悬液用细胞计数板计数，离心管配平后放入离心机内2000rpm离心5min；细胞计数方法：按细胞悬液：0.4％台盼蓝(体积比)＝1:1的比例，混匀后取10μl滴至细胞计数板上计数，检测细胞活力并计算细胞总数；(6)倒掉步骤(5)离心后的上清液，根据细胞计数结果，用lonza完全培养基溶液调整细胞接种密度为1.5×105cell/ml，根据体积添加100×双抗，混匀后接种；其中，用10cm培养皿接种的步骤为用移液管接种10ml的细胞悬液至10cm培养皿中；用15cm培养皿接种的步骤为用移液管接种20ml的细胞悬液至15cm培养皿中；接种后十字摇晃培养皿5次，使细胞悬液均匀分布于培养皿中。实施例3本实施例为本发明所述的一种胎盘干细胞的分离方法，包括如下步骤：(1)采集胎盘，并浸泡于胎盘保存液中：将分娩后获得的胎盘在6小时内浸泡于含有1×-2×双抗、质量名都10％高糖dmem的基础培养基的pbs保存液，4℃保存运输；(2)将步骤(1)所述的胎盘进行底蜕膜剥离，获得底蜕膜，用2℃pbs初步清洗胎盘底蜕膜，然后用10ml一次性移液管吸取清洗液至组织中，直至底蜕膜血液被清洗干净；(3)用剪刀将步骤(2)处理后的底蜕膜剪碎，面积为3×3cm2，将剪碎后的底蜕膜，在37℃，用酶解液a(含有质量浓度为0.25％胰酶和质量浓度为0.02％edta的dmem高糖基础培养基)与底蜕膜以10:1的体积比，200r酶解0.5h，1500rpm离心5min；在37℃，用酶解液b(含有0.4mg/ml胶原酶ⅳ、0.1mg/ml中性酶、15ng/mlfasligand抑制剂和15ng/mlsurvivin抑制剂的dmem高糖基础培养基)与底蜕膜以20:1的体积比，200r酶解2h；(4)将步骤(3)酶解后的组织液取出，分装至4支50ml离心管(每管不超过25ml)，并加入等体积的细胞清洗液，配平后放入离心机内2000rpm离心5min；(5)轻轻倒掉步骤(4)离心后的上清液，用移液管向每管加入10ml细胞清洗液重悬细胞沉淀，用100μm细胞筛网过滤到1支50ml离心管中，混匀后用移液枪头取100μl细胞悬液用细胞计数板计数，离心管配平后放入离心机内2000rpm离心5min；细胞计数方法：按细胞悬液：0.4％台盼蓝(体积比)＝1:1的比例，混匀后取10μl滴至细胞计数板上计数，检测细胞活力并计算细胞总数；(6)倒掉步骤(5)离心后的上清液，根据细胞计数结果，用lonza完全培养基溶液调整细胞接种密度为1.5×105cell/ml，根据体积添加100×双抗，混匀后接种；其中，用10cm培养皿接种的步骤为用移液管接种10ml的细胞悬液至10cm培养皿中；用15cm培养皿接种的步骤为用移液管接种20ml的细胞悬液至15cm培养皿中；接种后十字摇晃培养皿5次，使细胞悬液均匀分布于培养皿中。对比例1本对比例参照文献1所述的胎盘底蜕膜和脐带间充质干细胞的分离和培养方法进行，具体如下：将胎盘组织用无菌盐水冲洗后，小心分离脐带和胎盘底蜕膜组织，将脐带和底蜕膜组织分开操作。用无菌组织剪剪成小组织块，使用胶原酶和胰酶消化，消化后的混合液体经200目滤网过滤后，接种于细胞培养瓶中，用含10％胎牛血清的df12培养液于37℃、5％co2培养箱中培养，待细胞生长至80％融合时，胰酶消化细胞，按1:3传代。文献1为：韩之波，王有为，王涛，池颖，杨舟鑫，及月茹，孟磊，杨萍，韩忠朝.人胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离及其生物学特性研究[j].中国实验血液学杂志,2013,(3).对比例2本对比例参照文献2所述的人胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离培养方法进行，具体如下：与产妇及其家属签署知情同意书后，取人足月健康产妇胎盘(来自南方医科大学珠江医院妇产科)，无菌条件下剪取胎盘母体侧的底蜕膜层，剪碎至米粒样大小，经0.1％ⅱ型胶原酶和0.25％胰蛋白酶依次消化后，人淋巴细胞分离液(密度为1.077g/l)2000r/min离心20min，吸取中间白膜层，pbs洗涤两遍后用含10％fbs的dmem/f12培养液重悬，按1×106/l密度接种于25t培养瓶中。37℃、5％co2的饱和湿度培养箱中培养，7d后首次换液，之后每3～4d换液1次。待细胞融合达到70％左右时用0.25％胰蛋白酶消化，以1∶2或1∶3比例传代，定期倒置显微镜下观察细胞形态变化文献2为：卢国辉，张世忠，陈强，王雪峰，卢凤飞，刘剑，李明，李振勇.人胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究[j].南方医科大学学报,2011,(2).实验例1细胞的数量提取及活力检测本发明实施例1-3所述的胎盘底蜕膜干细胞的分离方法提取细胞的数量与活力，其检测方法为：取刚分离出来的胎盘底蜕膜干细胞，调整细胞密度为1×106cell/ml。按细胞悬液：0.4％台盼蓝＝3:1(v:v)充分混匀，取20μl细胞混匀液加入细胞计数板中，用countstar细胞计数器进行细胞活率及体积检测。对比例1和对比例2所述的胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离培养方法提取细胞的数量与活力，其检测方法参照对应的文献所记载的进行。本发明实施例1-3与对比例1-2，细胞p0的数量提取及活力检测结果如下表1所示，细胞在显微镜下的细胞形态学观察图如图1-5所示。表1本发明所述胎盘底蜕膜干细胞的分离方法提取细胞的数量与活力检测实施例活细胞数总细胞数细胞活率实施例14.69×108cells4.77×108cells98.2％实施例25.21×108cells5.33×108cells97.6％实施例35.57×108cells5.83×108cells95.4％对比例12.96×108cells3.48×108cells85.1％对比例22.73×108cells3.16×108cells86.3％从上表可知，本发明从胎盘中提取出底蜕膜干细胞在4.69×108～5.57×108cells之间，细胞活力高达95％以上；均高于对比例1和对比例2的细胞提取数量和细胞活率，说明了本发明所述的所胎盘底蜕膜干细胞的分离方法，即双酶解法所提取的细胞活率高，活力好。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12