1.一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的试纸条,其特征在于由样品垫、涂覆纳米金-探针复合物的金标结合垫、设有检测线探针及质控线探针的硝酸纤维素膜、吸水垫和粘合底板组成,其中样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘于粘合底板上,各部分间应有2~3mm重叠,组装完成后压实,4℃下干燥储存,所述试纸条的制备工艺如下:
1)、dna片段与探针的设计
通过在ncbi数据库中查找到的95条pnrsv病毒核酸序列,寻找高度特异保守区,确定检测序列,并以此为根据,设计出发夹dna、纳米金probe1、probe2和probe3。其中probe1的5’端有巯基标记,可与纳米金结合;
2)、纳米金的制备
纳米金的制备采用氯金酸还原法制备,制备好的纳米金溶液4℃避光保存备用;
3)、纳米金-probe1复合物的合成
将上述1ml纳米金溶液浓缩后,将巯基修饰的probe1通过au-s键共价结合在纳米金表面,组装成纳米金-probe1复合物,4℃避光保存;
4)、试纸条的组装
试纸条由样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和粘合底板五部分组装制备;
(1)样品垫由玻璃纤维组成,将样品垫在缓冲液中浸泡,37℃下干燥;
(2)金标结合垫由玻璃纤维组成,将上述步骤制备的纳米金-探针复合物滴加到玻璃纤维垫上,37℃下干燥;
(3)将硝酸纤维素膜在缓冲液中浸泡,37℃下干燥。在硝酸纤维素膜一端划上10μm的probe2溶液做为检测线,另一端划上10μm的probe3溶液做为质控线,两条线之间的间隔为5mm,固定交联;
(4)吸收垫由吸水纸组成,在pbs缓冲液中浸泡,在37℃下干燥;
(5)将样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘在粘合底板上,各部分间应有2~3mm的重叠,组装完成后经重物过夜压实,4℃下干燥储存。
2.按照权利要求1所述的一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的试纸条的检测方法,其特征在于包括以下步骤:
1)、样品的制备
取pnrsv阳性樱桃植株及无病毒组培苗叶片,用自来水冲洗干净,再用蒸馏水清洗,采用ctab法提取叶片总rna,取1μg总rna进行dnaseⅰ处理去除残余的dna,95℃加热5min使酶失活后,冰上冷却,采用cdna第1链合成试剂盒进行反转录获得cdna;
2)、核酸外切酶ⅲ酶切放大
取上述步骤制备的适量的cdna,加入杂交buffer,在95℃下加热5min,然后迅速置于冰水浴中,使之形成自由直链状态,将10μmhairpindna溶液5μl加入10μl双蒸水中,95℃变性5min,然后慢慢冷却至室温,使其退火形成发夹型的二级结构,然后,将上述两种dna溶液混合,加入exoⅲ外切酶4μl,双蒸水补齐至50μl,37℃酶切60min,将反应后的溶液在80℃加热10min,使exoⅲ外切酶失活,酶切反应终止,最后将酶切反应液冷却至室温,用于试纸条的检测;
3)、试纸条检测
将酶切反应液滴加在核酸检测试纸条的样品垫上,再加pbs缓冲液100μl作为展开液冲洗试纸条,最后根据检测线和质控线的显色情况进行结果判读:若检测线和质控线同时显示红色条带,则结果为阳性;若检测线不显色,质控线显示红色条带,则结果判定为阴性;若质控线不显色,则检测无效。