一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的方法与流程

文档序号:21501742发布日期:2020-07-14 17:40阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的试纸条,其特征在于由样品垫、涂覆纳米金-探针复合物的金标结合垫、设有检测线探针及质控线探针的硝酸纤维素膜、吸水垫和粘合底板组成,其中样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘于粘合底板上,各部分间应有2~3mm重叠,组装完成后压实,4℃下干燥储存,所述试纸条的制备工艺如下:

1)、dna片段与探针的设计

通过在ncbi数据库中查找到的95条pnrsv病毒核酸序列,寻找高度特异保守区,确定检测序列,并以此为根据,设计出发夹dna、纳米金probe1、probe2和probe3。其中probe1的5’端有巯基标记,可与纳米金结合;

2)、纳米金的制备

纳米金的制备采用氯金酸还原法制备,制备好的纳米金溶液4℃避光保存备用;

3)、纳米金-probe1复合物的合成

将上述1ml纳米金溶液浓缩后,将巯基修饰的probe1通过au-s键共价结合在纳米金表面,组装成纳米金-probe1复合物,4℃避光保存;

4)、试纸条的组装

试纸条由样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和粘合底板五部分组装制备;

(1)样品垫由玻璃纤维组成,将样品垫在缓冲液中浸泡,37℃下干燥;

(2)金标结合垫由玻璃纤维组成,将上述步骤制备的纳米金-探针复合物滴加到玻璃纤维垫上,37℃下干燥;

(3)将硝酸纤维素膜在缓冲液中浸泡,37℃下干燥。在硝酸纤维素膜一端划上10μm的probe2溶液做为检测线,另一端划上10μm的probe3溶液做为质控线,两条线之间的间隔为5mm,固定交联;

(4)吸收垫由吸水纸组成,在pbs缓冲液中浸泡,在37℃下干燥;

(5)将样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘在粘合底板上,各部分间应有2~3mm的重叠,组装完成后经重物过夜压实,4℃下干燥储存。

2.按照权利要求1所述的一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的试纸条的检测方法,其特征在于包括以下步骤:

1)、样品的制备

取pnrsv阳性樱桃植株及无病毒组培苗叶片,用自来水冲洗干净,再用蒸馏水清洗,采用ctab法提取叶片总rna,取1μg总rna进行dnaseⅰ处理去除残余的dna,95℃加热5min使酶失活后,冰上冷却,采用cdna第1链合成试剂盒进行反转录获得cdna;

2)、核酸外切酶ⅲ酶切放大

取上述步骤制备的适量的cdna,加入杂交buffer,在95℃下加热5min,然后迅速置于冰水浴中,使之形成自由直链状态,将10μmhairpindna溶液5μl加入10μl双蒸水中,95℃变性5min,然后慢慢冷却至室温,使其退火形成发夹型的二级结构,然后,将上述两种dna溶液混合,加入exoⅲ外切酶4μl,双蒸水补齐至50μl,37℃酶切60min,将反应后的溶液在80℃加热10min,使exoⅲ外切酶失活,酶切反应终止,最后将酶切反应液冷却至室温,用于试纸条的检测;

3)、试纸条检测

将酶切反应液滴加在核酸检测试纸条的样品垫上,再加pbs缓冲液100μl作为展开液冲洗试纸条,最后根据检测线和质控线的显色情况进行结果判读:若检测线和质控线同时显示红色条带,则结果为阳性;若检测线不显色,质控线显示红色条带,则结果判定为阴性;若质控线不显色,则检测无效。


技术总结
本发明涉及植物病毒检测技术领域,特别涉及一种甜樱桃李属坏死环斑病毒的检测方法。包括以下步骤:1)、DNA片段与探针的设计合成;2)纳米金的制备;3)、纳米金‑探针1复合物的制备;4)、试纸条的组装;5)、样品的制备;6)、核酸外切酶Ⅲ信号放大;7)、试纸条检测。本发明采用核酸检测探针制备试纸条,不需要制备抗体,制备工艺简单,成本低廉;针对甜樱桃李属坏死环斑病毒的高度特异保守区设计探针,检测效果好,特异性强,不易产生假阳性;利用核酸外切酶Ⅲ循环酶切进行信号放大,提高了检测灵敏度,且无需专业人员和专门的仪器,携带、检测方便,结果凭肉眼可测;显色时间短,仅需10min。

技术研发人员:王磊;宿红艳;吴凡林;朱冬姿;王雪辉;王先钰
受保护的技术使用者:鲁东大学
技术研发日:2020.04.17
技术公布日:2020.07.14
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