本发明属于蛋白标记试剂领域，具体涉及一种含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂及其制备方法与应用。
背景技术：
：：蛋白质的大规模鉴定和定量分析是蛋白质组学研究的关键。蛋白质定量分析新技术在生命基本机制及疾病标志物的发现中发挥着关键的推动作用。其中，基于生物质谱的稳定同位素化学标记技术在蛋白质的相对定量和绝对定量中发挥着越来越重要的作用[1]。生物质谱仪器的快速发展在蛋白质鉴定、翻译后修饰和蛋白质定量分析等方面的应用和研究中发挥着重要作用。生物质谱技术的发展加快了蛋白质组学研究的进程，但样品的复杂性和庞大数据的处理是生物质谱技术面临的不可避免的挑战。相信随着生物质谱技术的不断完善和改进，它必将会在蛋白质组学研究中发挥更加重要的作用。多种稳定同位素标记蛋白质谱定量方法和试剂相继被成功开发，如itraq[2],icat[3]和tmt[4]等作为商品化试剂在生命科学和临床研究中得到广泛的应用。基于高分辨质谱技术的稳定同位素标记分子探针已经成为蛋白质组学研究中蛋白质定量的核心方法，基于化学反应和工具酶催化标记等原理成功开发了多样化的蛋白质定量方法。例如，基于一级质谱分析(ms)的稳定同位素标签，如多标还原甲基化标记、18o标记、silac(stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture)、153eu标记定量探针及胰酶催化n端精氨酸标记等。最近，科学家发展出基于肽段报告离子定量的easi-tag及基于异丙基修饰脯氨酸结构的tmtpro两种全新的等重标记蛋白定量技术[5-6]。虽然报告离子结构有所创新，但在质谱检测灵敏度方面并未取得提升。另外，传统标记策略基于经典的蛋白质化学，标记化学的选择性、标记试剂的质谱灵敏度和色谱分离、同位素效应及试剂价格非常昂贵等，定量通量受到限制，严重制约着大规模蛋白质组学定量分析研究，新的标记策略和标记试剂的研发具有重要的意义。本发明基于有机磷标记化学，[7,8]合成了一系列结构新颖的等重稳定同位素标记有机磷试剂，并运用该试剂对标准蛋白质和生物样品蛋白进行成功定量分析。参考文献：1.ong,s.e.；mann,m.massspectrometry-basedproteomicsturnsquantitative.nat.chem.biol.2005,1,252-262.2.ross,p.l.；huang,y.n.；marchese,j.n.；williamson,b.；parker,k.；hattan,s.；khainovski,n.；pillai,s.；dey,s.；daniels,s.；purkayastha,s.；juhasz,p.；martin,s.；bartlet-jones,m.；he,f.；jacobson,a.；pappin,d.j.multiplexedproteinquantitationinsaccharomycescerevisiaeusingamine-reactiveisobarictaggingreagents.mol.cell.proteomics2004,3,1154-1169.3.gygi,s.p.；rist,b.；gerber,s.a.；turecek,f.；gelb,m.h.；aebersold,r.quantitativeanalysisofcomlexproteinmixturesusingisotope-codedaffinitytags.nat.biotechnol.1999,17,994-999.4.thompson,a.；schafer,j.；kuhn,k.；kienle,s.；schwarz,j.；schmidt,g.；neumann,t.；hamon,c.tandemmasstags:anovelquantificationstrategyforcomparativeanalysisofcomplexproteinmixturesbyms/ms.anal.chem.2003,75,1895-1904.5.winter,s.v.；meier,f.；wichmann,c.；cox,j.；mann,m.；meissner,f.easi-tagenablesaccuratemultiplexedandinterference-freems2-basedproteomequantification.naturemethods,2018,15,527–530.6.li,j.m.；vanvranken,j.g.；etal.tmtproreagents:asetofisobariclabelingmasstagsenablessimultaneousproteome-widemeasurementsacross16samples.naturemethods,2020,doi:10.1038/s41592-020-0781-4.7.zhang,s.；shi,j.；shan,c.；huang,c.；wu,y.；ding,r.；xue,y.；liu,w.；zhou,q.；zhao,y.；xu,p.；gao,x.,stableisotopen-phosphorylaminoacidslabelingforquantitativeprofilingofamine-containingmetabolitesusingliquidchromatographymassspectrometry.anal.chim.acta2017,978,24-34.8.gao,x.；wu,h.；lee,k.-c.；liu,h.；zhao,y.；cai,z.；jiang,y.,stableisotopen-phosphorylationlabelingforpeptidedenovosequencingandproteinquantificationbasedonorganicphosphoruschemistry.anal.chem.(washington,dc,u.s.)2012,84(23),10236-10244.技术实现要素：针对上述现有技术存在的不足之处，本发明目的在于提供一种含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂及其制备方法与应用。为了达成上述目的，本发明的解决方案是：一种含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂，其特征在于其结构式如下：结构中：a为14或15；b为12或13；c为16或18；d为1或2；n为1、2、3、4或5，优选1或2；n1为0、1或2，优选0或1；r1为含稳定同位素或不含稳定同位素l构型或d-构型的氨基酸的侧链取代基，其中r1优选为甲基；r2为含稳定同位素或不含稳定同位素的氨基酸的侧链取代基，其中r2优选为氢。含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)n端保护的含等重稳定同位素的氨基酸制备可分为两种方法：方法a：将含等重稳定同位素的氨基酸r1溶于碱溶液中冷却后加入有机溶剂溶解制得氨基酸混合溶液；将9-芴甲基羰酰氯溶于有机溶剂后缓慢加至氨基酸混合溶液中，所得混合物在低温下搅拌反应后再继续室温搅拌反应，然后除去溶剂，将所得剩余物纯化后即可制得9-芴甲基羰基保护的含等重稳定同位素的氨基酸fmoc-r1；方法b：将含等重稳定同位素的氨基酸r1溶于碱溶液中冷却后加入有机溶剂溶解制得氨基酸混合溶液；将二碳酸二叔丁酯溶于1,4-二氧六环后缓慢加至氨基酸混合溶液中，所得混合物在低温下搅拌反应后再继续室温搅拌反应，然后除去溶剂，将所得剩余物纯化后即可制得叔丁氧羰基保护的含等重稳定同位素的氨基酸boc-r1；(2)n端保护的含等重稳定同位素的氨基酸活化酯fmoc/boc-r1-nhs的制备：将步骤(1)中制备的fmoc/boc-r1和n-羟基丁二酰亚胺溶于有机溶剂并加入缩合剂进行缩合反应制得n端保护的含等重稳定同位素的氨基酸活化酯fmoc/boc-r1-nhs；(3)含等重稳定同位素的二肽的制备：将步骤(2)中制备的fmoc/boc-r1-nhs溶于混合溶剂后低温下加入至溶剂了含等重稳定同位素的氨基酸r2的碱溶液中，所得混合物在低温下搅拌反应后再继续室温搅拌反应，反应结束后除去溶剂，将所得剩余物纯化后进行脱fmoc/boc处理即可制得所述含等重稳定同位素的二肽；(4)含等重稳定同位素的亚磷酸酯的制备：在惰性气氛保护下，将由含等重稳定同位素醇类溶剂和二氯甲烷组成的混合溶液在冰浴下缓慢滴加至三氯化磷的二氯甲烷溶液中，然后将所得混合物在室温下搅拌反应，跟踪反应至三氯化磷消耗完后停止反应，反应结束后除去溶剂及盐酸气，最后将所得油状产物进行减压蒸馏即可；(5)含等重稳定同位素的亚磷酸酯二肽的制备：将步骤(3)中制备的含等重稳定同位素的二肽溶于由水和乙醇的混合溶液中，加入三乙胺在低温搅拌后缓慢滴加由步骤(4)中所制备的含等重稳定同位素的亚磷酸酯和6-10当量的四氯化碳组成的混合溶液；所得混合物在低温下搅拌反应后再继续室温搅拌反应，反应结束后除去溶剂，将所得剩余物纯化后即可制得稳定同位素标记的亚磷酸酯丙甘二肽；(6)稳定同位素标记n-磷酰化氨基酸活化酯的制备：将步骤(5)中制备的稳定同位素标记的亚磷酸酯丙甘二肽和n-羟基丁二酰亚胺溶于有机溶剂并加入缩合剂进行缩合反应，反应结束后除去溶剂，将所得剩余物纯化后即可制得所述含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂。优选地，步骤(1)和步骤(3)中所述的碱溶液选自氢氧化钠溶液，氢氧化钾溶液，碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液中的一种，优选碳酸钠溶液；所述的冷却和低温均为冰浴条件；所述的低温搅拌反应时间为2-4小时，所述的室温搅拌反应为5-12小时；优选地，步骤(2)和步骤(6)中所述的有机溶剂选自乙二醇二甲醚或二氯化碳中的一种；所述缩合剂为dcc或edci中的一种。优选地，步骤(5)所述的低温为冰浴条件；所述的低温搅拌反应时间为2-4小时，所述的室温搅拌反应为4-6小时。优选地，步骤(4)中所述的含等重稳定同位素醇类溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇中的一种，优选甲醇或乙醇。含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂在多肽定量分析中的应用。含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂在标准蛋白质或细胞中蛋白质定量分析中的应用。含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂在尿样中所含蛋白定量分析中的应用。含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂在血样中所含蛋白定量分析中的应用。本发明的具体原理如下：本发明所提供的含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂可作为等重稳定同位素磷酰化标记分子探针(isipl)用于对肽段的n-端和赖氨酸侧链氨基进行选择性高效标记，然后通过质谱分析尤其二级质谱裂解产生的报告离子对多肽和蛋白进行相对定量分析。目前，生物质谱技术的定量信息大多还是来自一级质谱图，一般即是首先在蛋白质酶解产生的肽段上引入稳定同位素标签，然后比较在一级质谱中带有稳定同位素标记的质谱峰强度进行蛋白质的相对定量。本专利所提供的方法经过肽段母离子的选择，二级质谱和一级质谱定量相比，大大降低了二级质谱图的噪声水平即提高了二级质谱图的信噪比，进而可以提高肽段和蛋白质定量的准确性和定量通量。这里以六标等重稳定同位素n-磷酰化标记蛋白质定量方法为例进行原理说明：如上式所示的含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂中对编号1-5的原子进行同位素标记后，标记试剂中稳定同位素主要分布于报告离子磷酸酯基团和平衡连接臂部分，为了使报告离子出现于低分子量端，且二级质谱裂解中具有较好稳定性及最高质谱分析灵敏度，磷酸酯基团采用乙氧基结构；考虑到13c与15n标记合成模块的可获得性，标记试剂中平衡连接臂采用价格相对便宜的甘氨酸；考察不同有机磷试剂标记后，肽段裂解碎片离子对报告离子的分析干扰，选择在相应m/z范围内对报告离子没有干扰的标记试剂。本发明的优点：(1)本发明所提供的含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂是一种基于特征磷酰胺报告离子的全新结构，成功建立o-18、n-15及c-13等稳定同位素原子高效引入有机磷分子探针的方法，通过组合不同的稳定同位素标记磷酰化二肽从而获得对两标、四标、六标、八标或十标蛋白相对定量分析。(2)本发明所提供的含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂的制备方法具有所需原理廉价易得、反应条件温和、标记效率高、纯化方法简单及产率高的优点。(3)本发明所提供的含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂可作为等重稳定同位素磷酰化标记分子探针(isipl)用于多肽定量分析，标准蛋白质样品及细胞中蛋白质样品定量分析，尿样和血样中所含蛋白定量分析中，结果表明：本发明所提供的定量方法具有高灵敏度、蛋白覆盖率高、准确性高及可重复性好的优点。附图说明图1为含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂的结构式图。图2为isipl0和tmt0标记试剂二级质谱片段图。图3为isipl0和tmt0标记1μghela肽段鉴定种类对比图。具体实施方式下面进一步结合实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，示例中具体的质量、反应时间和温度、工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，均为按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买的常规产品。如图1所示为本发明所制备的含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂的结构式图。isipl多肽及蛋白定量分析的通用方法为：将含等重稳定同位素的磷酰化蛋白标记试剂配制成反应液后加入待测样品(可为多肽，标准蛋白质样品，细胞中蛋白质样品，尿液及血样中的一种)进行衍生化反应，所得产物经浓缩和除盐处理后直接进行lc-ms分析即可。定量分析质谱分析条件为：质谱仪为：电喷雾电离-飞行时间质谱(esi-tofms)、喷雾电离-轨道阱质谱(esi-orbitrapms)、电喷雾电离-离子阱质谱(esi-itms)、基质辅助激光诱导解析电离-飞行时间质谱(maldi-tof/tofms)等，首选电喷雾电离-飞行时间质谱(esi-tofms)和电喷雾电离-轨道阱质谱(esi-orbitrapms)。离子电离模式为：正离子模式。裂解模式为：碰撞诱导解离(cid)、高能碰撞裂解(hcd)等，首选高能碰撞裂解(hcd)模式。高效液相色谱仪为：easy-nanolc1000纳流液相色谱仪、dionexultimate3000高效液相色谱仪。实施例1亚磷酸二乙酯丙甘二肽活化酯的制备，具体步骤如下：(1)取丙甘二肽(5mmol，731mg)溶于2ml水，搅拌溶解后加入2ml三乙胺以及1ml乙醇，搅拌混匀后冷却至-10℃；取0.71ml亚磷酸二乙酯(5.5mmol)溶于3ml四氯化碳中，低温下滴加至二肽溶液中，低温下反应半小时后逐渐升至室温反应4-6小时；停止反应后用旋转蒸发仪浓缩除去部分溶剂，剩余物可添加适量的水稀释溶解用2×10ml乙醚萃取两次后取水层，低温下用1m稀盐酸调ph为2-3，然后用3×10ml乙酸乙酯萃取，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩干燥得到白色固体或油状液体粗产物，可用乙酸乙酯：正己烷＝1:5或乙酸乙酯：石油醚＝1:5进行重结晶，得到白色固体产物，记为deph-l-ala-gly，结构如下式所示：deph-l-ala-gly(c9h19n2o6p):1hnmr(600mhz,cdcl3):δ＝7.40(s,1h),4.33-4.28(m,1h),4.16-4.06(m,4h),3.95-3.92(m,2h),1.47(d,j＝6.00hz,3h),1.38-1.34(m,6h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3):δ＝173.51,172.63,63.34(dd,j1＝4.53hz,j2＝6.04hz),51.19,41.53,20.99,16.10(dd,j1＝j2＝1.51hz)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3):δ＝7.29ppm.esi-ms:[m-h]-,m/z281.0905(理论值281.0902，相对误差为1.1ppm)。取以上得到的deph-l-ala-gly(1mmol，282.24mg),n-羟基丁二酰亚胺(1.02mmol，117mg)和dcc(1.05mmol，217mg)溶于10ml二氯甲烷，室温下搅拌反应过夜；反应结束后，过滤并浓缩滤液，固体产物用乙酸乙酯：正己烷＝1:6重结晶，得到白色固体化合物即为目标产物，记为deph-l-ala-gly-nhs，结构如下式所示：deph-l-ala-gly-nhs(c13h22n3o8p):1hnmr(600mhz,cdcl3):δ＝7.79(t,1h),4.44(d,j＝6.00hz,2h),4.14-4.06(m,4h),3.93-3.90(m,1h),3.71-3.65(m,1h),2.89(s,4h),1.47(d,j＝6.00hz,3h),1.37-1.33(m,6h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3):δ＝174.04(d,j＝6.04hz),168.71,165.69,62.99(dd,j1＝j2＝4.53hz),51.11,38.98,25.60,20.65(d,j＝4.53hz),16.19(dd,j1＝j2＝3.02hz)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3):δ＝7.25ppm.实施例2含氮-15稳定同位素标记的两标亚磷酸二乙酯的丙甘二肽活化酯的制备，具体步骤如下：步骤1、稳定同位素标记的boc-ala合成：将l-n15-ala(5mmol)溶于naoh(1m，5ml)水溶液中，冷却至0℃。将(boc)2o(1.636g，7.5mmol)的1,4-二氧六环(10ml)溶液滴加至水溶液中，加入nahco3(420mg，5mmol)，反应混合物在室温下搅拌过夜，将反应液减压蒸发，然后加入10ml水，用etoac(15ml×2)洗去过量(boc)2o，在冰浴中冷却并用khso4水溶液(1m)酸化至ph＝2.5-3。水层用etoac(3×25ml)萃取。最后，将合并的萃取液用饱和nacl溶液洗涤，无水mgso4干燥并减压浓缩溶剂，得到白色固体产物boc-n15-ala(877mg，92％)，结构如下式所示：boc-n15-ala(c8h1515no4):1hnmr(600mhz,meod)δ＝4.11(q,j＝7.4hz,1h),1.44(s,9h),1.35(dd,j＝7.3,3.0hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,meod)δ＝175.40,156.46(d,j＝26.0hz),79.05,48.96(d,j＝12.8hz),27.35,16.55ppm.esi-ms:m/z＝189.0897([m-h]-,theoreticalmass:189.0893,relativeerror:2.1ppm).步骤2、稳定同位素标记的boc-ala-gly合成在0℃下，将dcc(1.33g，6.45mmol)加入到boc-n15-ala(877mg，4.61mmol)、n-羟基丁二酰亚胺(583.5mg，5.07mmol)的etoac溶液中。在低温下搅拌30min，室温进一步搅拌24h。过滤除去生成的杂质dcu，减压蒸发溶剂，残余物加入戊烷(63ml)在n2下搅拌2h，过滤得boc-n15-ala-osu，直接用于下一步反应。取合成得到的boc-n15-ala-osu(4.61mmol)溶于18.44ml丙酮和73.76ml乙醇，在0℃条件下缓慢滴加至甘氨酸(4.61mmol，346mg)的nahco3(9.22mmol，774.5mg)水溶液中，滴加完后移至室温反应20h。停止反应后，减压浓缩除去部分溶剂，剩余物加46.1mlh2o振荡混匀。用乙酸乙酯(2×25ml)萃取水层，剩余水溶液冷却至0℃，用稀盐酸(1m)调ph至2左右。酸性水溶液用乙酸乙酯萃取(3×60ml)，合并有机层，用饱和nacl水溶液洗涤，无水mgso4干燥，过滤，减压浓缩得粗产物。粗产物重结晶(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)得boc-n15-ala-gly(800mg，70％)白色固体产物，结构如下式所示：boc-n15-ala-gly(c10h18n15no5):1hnmr(600mhz,meod)δ＝4.18–3.99(m,1h),3.91(q,j＝17.8hz,2h),1.44(s,9h),1.32(dd,j＝7.2,3.0hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,meod)δ＝174.85,171.35,156.34,79.25,50.10(d,j＝11.4hz),40.35,27.30,17.00ppm.esi-ms:m/z＝246.1120([m-h]-,theoreticalmass:246.1108,relativeerror:4.9ppm).同理，可由boc-ala(5mmol，946.1mg)和n15-gly(5mmol，380.3mg)反应得到boc-ala-n15-gly(864mg，70％)为白色固体产物，结构如下式所示：boc-ala-n15-gly(c10h18n15no5):1hnmr(600mhz,meod)δ＝4.10(m,1h),3.91(q,j＝17.8hz,2h),1.44(s,9h),1.32(d,j＝7.2hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,meod)δ＝175.12,171.35,156.26,79.26,50.10(d,j＝11.4hz),40.34(d,j＝12.8hz),27.30,17.00ppm.esi-ms:m/z＝246.1120([m-h]-,theoreticalmass:246.1108,relativeerror:4.9ppm).步骤3、稳定同位素标记的ala-gly合成boc-n15-ala-gly(3.2mmol，800mg)溶于8mlthf，加入8ml浓盐酸，n2保护下室温反应3h，蒸发溶剂，残余物用10mlh2o溶解，ch2cl2(2×10ml)萃取后取水层，减压蒸发得n15-ala-gly淡黄色油状物，未进一步纯化，直接用于下一步反应。同理，可由boc-ala-n15-gly(3.5mmol，864mg)反应得到ala-n15-gly淡黄色油状液体，结构如下式所示：n15-ala-gly(c5h10n15no3):1hnmr(600mhz,d2o)δ＝4.08(q,j＝7.1hz,1h),3.98(s,2h),1.48(dd,j＝7.1,3.1hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,d2o)δ＝172.96,171.29,49.02(d,j＝6.9hz),41.09,16.38ppm.esi-ms:m/z＝146.0583([m-h]-,theoreticalmass:146.0584,relativeerror:0.68ppm).同理，可制备ala-n15-gly，结构如下式所示：ala-n15-gly(c5h10n15no3):1hnmr(600mhz,d2o)δ＝4.08(q,j＝7.1hz,1h),3.97(s,2h),1.47(d,j＝7.1hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,d2o)δ＝172.95,171.28(d,j＝17.2hz),49.03(d,j＝9.5hz),41.05(d,j＝12.6hz),16.36ppm.esi-ms:m/z＝146.0583([m-h]-,theoreticalmass:146.0584,relativeerror:0.68ppm).步骤4、稳定同位素标记的deph-ala-gly的合成n15-ala-gly(3mmol，443mg)溶于3ml水，加入1.5ml三乙胺以及1.5ml乙醇，搅拌混匀后冷却至0℃；取亚磷酸二乙酯(3.3mmol，0.425ml)溶于3ml四氯化碳，滴加至二肽溶液中，低温下反应6h；停止反应后减压蒸发除去部分溶剂，粗产物进行高效液相色谱制备得deph-n15-ala-gly(513mg，60.3％)为透明油状物。同理，可由ala-n15-gly(3.5mmol，514mg)和亚磷酸二乙酯(3.85mmol，0.496ml)反应得到deph-ala-n15-gly(599.2mg，60.4％)透明油状物，结构如下式所示：deph-n15-ala-gly(c9h19n15no6p):1hnmr(600mhz,cdcl3)δ＝7.38(s,1h),4.23(dd,j＝18.6,5.9hz,1h),4.10–3.98(m,4h),3.89(dd,j＝18.5,3.7hz,2h),1.41(dd,j＝6.9,2.7hz,3h),1.37–1.23(m,6h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3)δ＝173.64,172.55,63.33(dd,j＝18.3,5.7hz),51.15(d,j＝8.3hz),41.51,20.93(d,j＝4.6hz),16.09(dd,j＝6.9,1.9hz).31pnmr(243mhz,cdcl3)δ＝7.40ppm.esi-ms:m/z＝284.1029([m+h]+,theoreticalmass:284.1029,relativeerror:0ppm),306.0848([m+na]+,theoreticalmass:306.0849,relativeerror:0.32ppm).同理，可制备deph-ala-n15-gly，结构如下式所示：deph-ala-n15-gly(c9h19n15no6p):1hnmr(600mhz,cdcl3)δ＝7.52(dq,j＝93.78,3.8hz,1h),4.27(dd,j＝18.6,5.9hz,1h),4.15–4.05(m,4h),3.95(dd,j＝18.6,3.7hz,2h),1.46(d,j＝7.0hz,3h),1.35(dt,j＝12.4,7.1hz,6h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3)δ＝173.64(dd,j＝15.6,6.5hz),172.53,63.31(dd,j＝18.6,5.8hz),51.15(d,j＝8.1hz),41.49(d,j＝13.3hz),20.90(d,j＝4.7hz),16.09(dd,j＝6.9,1.9hz)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3)δ＝7.34ppm.esi-ms:m/z＝284.1029([m+h]+,theoreticalmass:284.1029,relativeerror:0ppm),306.0847([m+na]+,theoreticalmass:306.0849,relativeerror:0.65ppm).步骤5、稳定同位素标记的deph-ala-gly-nhs合成deph-n15-ala-gly(1.81mmol，513mg)，n-羟基丁二酰亚胺(1.84mmol，212.5mg)溶于18ml二氯甲烷，在0℃下加入dcc(1.99mmol，410.8mg)，反应液在低温下反应半小时，移至室温搅拌反应过夜；反应结束后，过滤并浓缩滤液，产物用二氯甲烷:正己烷＝1:6重结晶，得到deph-n15-ala-gly-nhs(687mg，99％)白色固体化合物。同理，可由deph-ala-n15-gly(2.115mmol，599.2mg)和n-羟基丁二酰亚胺(2.157mmol，248.2mg)反应得到deph-ala-n15-gly-nhs(748mg，93％)，结构如下式所示：deph-n15-ala-gly-nhs(c13h22n215no8p):1hnmr(600mhz,cdcl3)δ＝7.84(t,j＝5.5hz,1h),4.37(dd,j＝5.6,2.2hz,2h),4.09–4.00(m,4h),3.87(dt,j＝16.5,7.0hz,1h),2.82(s,4h),1.40(dd,j＝6.7,2.7hz,3h),1.29(dt,j＝9.1,7.1hz,6h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3)δ＝174.13(d,j＝5.5hz),168.77,165.70,77.29,77.08,76.86,63.03(dd,j＝18.8,5.6hz),51.11(d,j＝8.4hz),38.96,25.60,20.71(d,j＝5.0hz),16.16(dd,j＝7.0,3.3hz)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3)δ＝7.25ppm.esi-ms:m/z＝381.1191([m+h]+,theoreticalmass:381.1193,relativeerror:0.52ppm),403.1012([m+na]+,theoreticalmass:403.1013,relativeerror:0.24ppm).同理，可制备deph-ala-n15-gly-nhs，结构如下式所示：deph-ala-n15-gly-nhs(c13h22n215no8p):1hnmr(6600mhz,cdcl3)δ＝7.81(dt,j＝94.1,5.7hz,1h),4.37(d,j＝5.5hz,2h),4.10–4.00(m,4h),3.87(dt,j＝16.6,7.0hz,1h),2.83(s,4h),1.41(d,j＝6.9hz,3h),1.29(dt,j＝9.1,7.1hz,6h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3)δ＝174.08(dd,j＝14.4,5.5hz),168.76,165.69,63.06(dd,j＝18.6,5.6hz),51.12(d,j＝8.6hz),38.96(d,j＝13.5hz),25.60,20.69(d,j＝5.1hz),16.16(dd,j＝6.9,3.2hz)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3)δ＝7.26ppm.esi-ms:m/z＝381.1190([m+h]+,theoreticalmass:381.1193,relativeerror:0.78ppm),403.1010([m+na]+,theoreticalmass:403.1013,relativeerror:0.7ppm).实施例3含氘-2、碳-13、氧-18和氮-15稳定同位素标记的六标亚磷酸二乙酯的丙甘二肽活化酯的制备：步骤1、氮-15标记的9-芴甲基羰酰基-l-丙氨酸的制备称取15n-l-ala(7.6mmol，684mg)溶于30ml的na2co3(19mmol，2g)水溶液中，冷却至0℃，然后向其中缓慢加入19ml1,4-二氧六环；取9-芴甲基羰酰氯(8.4mmol，2.17g)溶于19ml1,4-二氧六环，缓慢滴加至氨基酸溶液中，低温下搅拌两个小时后移至室温搅拌反应5.5个小时。停止反应后，用旋转蒸发仪浓缩除去溶剂，剩余固体溶于150ml水中，用4×40ml无水乙醚萃取；保留水层用3m的hcl水溶液调ph至2左右，析出白色沉淀；然后用4×50ml的乙酸乙酯萃取，收集有机层并用40ml饱和nacl水溶液洗涤一次，有机层用无水硫酸镁干燥，过滤后滤液浓缩得到白色固体粗产物。得到的白色固体进行进一步纯化：加入40ml正己烷搅拌一个小时后，过滤除去滤液，固体用减压真空泵干燥；以此得到的白色固体用适量的乙酸乙酯加热溶解后，向其中滴加约10倍体积的正己烷进行重结晶，并存于4℃冰箱过夜以析出更多固体产物，得到纯净的白色固体，记为fmoc-15n-ala(c18h1715no4)，结构如下式所示：fmoc-15n-ala(c18h1715no4):1hnmr(600mhz,cd3od):δ＝7.77-7.28(m,8h),4.31(m,2h),4.19(q,2h),3.31(dt,j1＝j2＝6.00hz,1h),1.40(dd,j1＝j2＝6.00hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cd3od):δ＝175.23,157.05(d,j＝27.18hz),143.86(d,j＝25.67hz),141.17,127.39,126.77(d,j＝4.53hz),124.88(d,j＝9.06hz),119.52,66.59,49.45(d,j＝13.59hz),46.94,16.42ppm.esi-ms:[m+na]+,m/z335.1017(理论值335.1026，相对误差为2.7ppm)。esi-ms:[m-h]-,m/z311.1056(理论值311.1050，相对误差为2ppm)。同理，将起始原料15n-l-ala换为15n-d-ala，其它条件不变即可制备得到fmoc-15n-d-ala(c18h1715no4)。步骤2、含氧-18同位素标记的9-芴甲基羰酰基l-丙氨酸的制备烘干的双颈烧瓶冷却后放入磁子以及称好的fmoc-l-ala(以1mmol为例，即为311mg)抽干约两个小时；配制10ml氧-18水(加入180μl乙酰氯，即得到0.25mhcl),置换成氮气保护，塞紧瓶塞备用；充好氮气球备用。烘干的冷凝管连接上氮气球，实验抽干的样品和双颈瓶于红外灯外连接上冷凝管和氮气球并用水泵置换掉体系内的空气，搭好装置连接上冷凝水；然后用针筒取1.5ml无水的1,4-二氧六环搅拌均匀后逐渐加热至110℃，与此同时可向其中滴加0.5ml配置好的氧-18水(25mmol，即25当量)，则冷凝回流搅拌反应24个小时。反应结束后，待冷却至室温后把反应液转移至单颈圆底烧瓶，无水条件下，使用了相同当量的氧-18水又搅拌回流反应了24小时，进行浓缩干燥后得到浅黄色固体粉末即为目标化合物，记为fmoc-ala-18oh(c18h17n18oo3)，结构如下式所示：fmoc-ala-18oh(c18h17n18oo3):1hnmr(600mhz,cd3od):δ＝7.78-7.28(m,8h),4.34(dd,j1＝j2＝6.00hz,1h),4.28(dd,j1＝j2＝6.00hz,1h),4.20(t,j＝6.00hz,2h),3.31(dt,j1＝j2＝6.00hz,1h),1.40(d,j＝6.00hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cd3od):δ＝175.15,157.06,143.87(d,j＝24.16hz),141.17,127.39,126.77(d,j＝4.53hz),124.88(d,j＝9.06hz),119.52,66.59,49.43,46.94,16.40ppm.esi-ms:[m+na]+,m/z338.1132(理论值338.1140，相对误差为2.4ppm)。若要把氮-15标记的9-芴甲基羰酰基-l-丙氨酸交换上氧-18，同样按照此方法把化合物fmoc-15n-ala(c18h1715no4)与氧-18水多次交换反应即可得到目标化合物fmoc-15n-ala-18oh(c18h1715n18oo3)，结构如下式所示：fmoc-15n-ala-18oh(c18h1715n18oo3):1hnmr(600mhz,cd3od):δ＝7.76-7.27(m,8h),4.30(m,2h),4.19(dt,j1＝12.00hz,j2＝6hz,2h),3.32(dt,j1＝j2＝6.00hz,1h),1.40(dd,j1＝j2＝6.00hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cd3od):δ＝177.13,159.00(d,j＝27.18hz),145.82(d,j＝25.67hz),143.12,129.35,128.73(d,j＝4.53hz),126.84(d,j＝10.57hz),121.49,68.55,51.39(d,j＝13.59hz),48.89,18.39ppm.esi-ms:[m+na]+,m/z339.1077(理论值339.1111，相对误差为8ppm)。步骤3、含氧-18、碳-13、氮-15稳定同位素标记的9-芴甲基羰酰基丙甘二肽的制备取9-芴甲基羰酰基-l-丙氨酸(fmoc-ala，3mmol，933mg)和n-羟基丁二酰亚胺(3mmol，345mg)溶于约30ml的二氯甲烷中，冷却至0℃左右，而后加入dcc(3.3mmol，680mg)于低温下搅拌反应24小时。停止反应后，过滤除去生成的杂质dcu，滤液用减压浓缩，得到白色固体粗产物即9-芴甲基羰酰基-l-丙氨酸-n-羟基丁二酰亚胺酯(产率：96％)，未进行进一步纯化，备用于下一步反应。取合成得到的9-芴甲基羰酰基-l-丙氨酸-n-羟基丁二酰亚胺酯(3mmol)溶于12ml丙酮和48ml乙醇，在0℃条件下缓慢滴加至甘氨酸(3mmol，225mg)的nahco3(6mmol，504mg)水溶液中，滴加完后移至室温反应20个小时。停止反应后，减压浓缩除去溶剂，剩余物加30mlh2o振荡混匀，过滤除去不溶物，滤液用稀盐酸调ph至2左右，析出许多白色固体，过滤得到凝胶状固体产物，冻干后得到白色固体粉末即目标化合物fmoc-ala-15n-gly(c20h20n2o5)(1104mg，产率81％)，结构如下式所示：fmoc-ala-15n-gly(c20h20n2o5):1hnmr(600mhz,cd3od):δ＝7.80-7.29(m,8h),4.36(d,j＝6.00hz,2h),4.16(dt,j1＝j2＝6.00hz,2h),3.90(q,j＝18.00hz,2h),3.31(dt,j1＝j2＝6.00hz,2h),1.36(d,j＝6.00hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cd3od):δ＝174.55(d,j＝15.10hz),171.50,156.89,143.88(d,j＝24.16hz),141.20,127.39,126.78,124.83(d,j＝7.55hz),119.52,66.56,50.53(d,j＝7.55hz),46.98,40.41(d,j＝12.08hz),16.87ppm.esi-ms:[m+na]+,m/z392.1229(理论值392.1240，相对误差为2.8ppm)。同理，若要得到其他稳定同位素标记的9-芴甲基羰酰基-l-丙甘二肽也是按照以上方式合成，不同同位素标记的9-芴甲基羰酰基-l/d-丙氨酸先和n-羟基丁二酰亚胺生成活化酯再和不同同位素标记的甘氨酸反应即可得到以下目标化合物：fmoc-15n-ala-gly(c20h20n2o5)，结构如下式所示的：fmoc-15n-ala-gly(c20h20n2o5):1hnmr(600mhz,cd3od):δ＝7.79-7.29(m,8h),4.37(d,j＝6.00hz,2h),4.20(m,2h),3.88(t,j＝18.00hz,2h),3.31(dt,j1＝j2＝6.00hz,2h),1.36(dd,j＝6.00hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cd3od):δ＝174.47,171.66,156.87(d,j＝33.22hz),143.88(d,j＝27.18hz),141.20,127.39,126.77(d,j＝3.02hz),124.84(d,j＝9.06hz),119.52,66.56,50.53,47.00,40.60,16.88ppm.esi-ms:[m+na]+,m/z392.1212(理论值392.1240，相对误差为7ppm)。fmoc-ala-18oh-15n-gly(c20h20n2o5)，结构如下式所示的：fmoc-ala-18oh-15n-gly(c20h20n2o5):1hnmr(600mhz,cd3od):δ＝7.79-7.29(m,8h),4.36(d,j＝6.00hz,2h),4.19(dt,j1＝12.00hz,j2＝6.00hz,2h),3.90(q,j＝18.00hz,2h),3.31(dt,j1＝j2＝6.00hz,2h),1.36(d,j＝6.00hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cd3od):δ＝174.56(d,j＝7.55hz),171.54,156.89,143.87(d,j＝22.65hz),141.20,127.39,126.77(d,j＝3.02hz),124.83(d,j＝6.04hz),119.52,66.56,50.53(d,j＝7.55hz),46.98,40.44(d,j＝13.59hz),16.87ppm.esi-ms:[m+na]+,m/z394.1272(理论值394.1283，相对误差为2.8ppm)。fmoc-ala-18oh-15n,13c2-gly(c20h20n2o5)，结构如下式所示的：fmoc-ala-18oh-15n,13c2-gly(c20h20n2o5):1hnmr(600mhz,cd3od):δ＝7.79-7.29(m,8h),4.36(d,j＝6.00hz,2h),4.20(m,2h),4.02(dd,j1＝j2＝6.00hz,1h),3.78(dd,j1＝j2＝6.00hz,1h),3.31(dt,j1＝j2＝6.00hz,1h),1.37(d,j＝6.00hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cd3od):δ＝174.57,171.49(d,j＝58.89hz),156.88,143.88(d,j＝22.65hz),141.20,127.39,126.77(d,j＝3.02hz),124.83(d,j＝9.06hz),119.52,66.56,50.52(d,j＝7.55hz),46.98,40.46(dt,j＝60.40hz),16.87ppm.esi-ms:[m+na]+,m/z396.1339(理论值396.1350，相对误差为2.8ppm)。fmoc-15n-ala-18oh-gly(c20h20n2o5)，结构如下式所示的：fmoc-15n-ala-18oh-gly(c20h20n2o5):1hnmr(600mhz,cd3od):δ＝7.79-7.29(m,8h),4.37(d,j＝6.00hz,2h),4.20(dd,j1＝12.00hz,j2＝6hz,2h),3.86(s,2h),3.31(dt,j1＝j2＝6.00hz,2h),1.36(dd,j1＝j2＝6.00hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cd3od):δ＝174.30,172.36,156.97,143.88(d,j＝27.18hz),141.20,127.39,126.77(d,j＝3.02hz),124.82(d,j＝9.06hz),119.52,66.58,50.56,47.00,41.07,16.87ppm.esi-ms:[m+na]+,m/z394.1255(理论值394.1283，相对误差为7ppm)。fmoc-15n-ala-18oh-13c2-gly(c20h20n2o5)，结构如下式所示的：fmoc-15n-ala-18oh-13c2-gly(c20h20n2o5):1hnmr(600mhz,cd3od):δ＝7.79-7.29(m,8h),4.37(d,j＝6.00hz,2h),4.20(dt,j1＝j2＝6.00hz,2h),4.00(t,j＝6.00hz,1h),3.77(t,j＝6.00hz,1h),3.31(dt,j1＝j2＝6.00hz,2h),1.36(dd,j＝6.00hz,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cd3od):δ＝174.43,171.66(d,j＝58.89hz),156.77,143.88(d,j＝27.18hz),141.20,127.38,126.77(d,j＝3.02hz),124.82(d,j＝9.06hz),119.52,66.56,50.56,47.00,40.66(dd,j＝16.61hz),16.88ppm.esi-ms:[m+na]+,m/z396.1324(理论值396.1350，相对误差为6ppm)。步骤4、含氧-18、碳-13、氮-15稳定同位素标记的丙甘二肽的制备取步骤3中制备得到的稳定同位素标记的9-芴甲基羰酰基丙甘二肽(1mmol)溶于15ml的甲醇，加入两滴冰醋酸，再加入十分之一质量的10％钯碳，反应试剂都加入完后用真空泵抽去空气并充入惰性气体，再置换成氢气在室温下搅拌反应过夜。用薄层层析色谱点板跟踪反应完全后，利用助滤剂硅藻土过滤除去钯碳，并用旋转蒸发仪除去溶剂，剩余物中加入约10ml蒸馏水溶解，用10ml三氯甲烷和乙酸乙酯分别萃取一次，同样保留水层，冻干后样品进行高效液相色谱制备即可得到稳定同位素标记的丙甘二肽15n-ala-gly(c5h10n2o3)，结构如下式所示的：15n-ala-gly(c5h10n2o3):1hnmr(600mhz,d2o):δ＝4.13(q,j＝6hz,1h),2.77(s,2h),1.53(dd,j1＝j2＝6hz,3h)ppm.esi-ms:[m-h]-,m/z146.0578(理论值146.0584)，相对误差4ppm。同理，参照相同的方法对步骤3中制备的其它稳定同位素标记的9-芴甲基羰酰基丙甘二肽化合物进行脱fmoc处理可得到下列化合物：ala-15n-gly(c5h10n2o3)，结构如下式所示的：ala-15n-gly(c5h10n2o3):1hnmr(600mhz,d2o):δ＝4.19(q,j＝6hz,1h),2.82(s,2h),1.58(d,j＝6hz,3h)ppm.esi-ms:[m-h]-,m/z146.0578(理论值146.0584)，相对误差4ppm。ala-18oh-15n-gly(c5h10n2o3)，结构如下式所示的：ala-18oh-15n-gly(c5h10n2o3):1hnmr(600mhz,d2o):δ＝4.03(q,j＝6hz,1h),2.66(s,2h),1.41(d,j＝6hz,3h)ppm.esi-ms:[m-h]-,m/z148.0613(理论值148.0626)，相对误差8ppm。ala-18oh-15n,13c2-gly(c5h10n2o3)，结构如下式所示的：ala-18oh-15n,13c2-gly(c5h10n2o3):1hnmr(600mhz,d2o):δ＝4.15(q,j＝6hz,1h),2.78(d,j＝6hz,2h),1.55(d,j＝6hz,3h)ppm.esi-ms:[m-h]-,m/z150.0680(理论值150.0693)，相对误差8ppm。15n-ala-18oh-gly(c5h10n2o3)，结构如下式所示的：15n-ala-18oh-gly(c5h10n2o3):1hnmr(600mhz,d2o):δ＝4.15(m,1h),2.77(s,2h),1.54(dd,j1＝j2＝6hz,3h)ppm.esi-ms:[m-h]-,m/z148.0614(理论值148.0626)，相对误差8ppm。15n-ala-18oh-13c2-gly(c5h10n2o3)，结构如下式所示的：15n-ala-18oh-13c2-gly(c5h10n2o3):1hnmr(600mhz,d2o):δ＝4.18(m,1h),2.79(d,j＝6hz,2h),1.56(dd,j1＝j2＝6hz,3h)ppm.esi-ms:[m-h]-,m/z150.0680(理论值150.0693)，相对误差8ppm。步骤5、氘-2和碳-13标记的亚磷酸二乙酯的制备取无水乙醇(21.7mmol，1g，1.26ml)溶于5ml的二氯甲烷中，三氯化磷(7.2mmol，995mg，632μl)溶于2ml的二氯甲烷中冷却至0℃；在氮气保护下，乙醇溶液缓慢滴加至三氯化磷溶液中。上述反应体系转移至室温下搅拌反应，每半小时进行磷谱跟踪，当三氯化磷消耗完后停止反应，反应时长为12-14小时。利用旋转蒸发仪减压浓缩除去有机溶剂及盐酸气。减压蒸馏得到无色或浅黄色油状液体即为亚磷酸二乙酯。同理，合成含稳定同位素碳-13标记的亚磷酸二乙酯，只需要把原料乙醇换成含氘-2和碳-13标记的乙醇即可制备得到一系列氘-2和碳-13标记的亚磷酸二乙酯，结果为：13c2-1-deph(c213c2h11o3p)，结构如下式所示：13c2-1-deph(c213c2h11o3p):1hnmr(600mhz,cdcl3):δ＝7.30(s,0.5h),6.15(s,0.5h),4.20-4.15(m,2h),3.96-3.90(m,2h),1.29-1.26(m,6h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3):δ＝61.95-61.74(m),16.26(dd,j1＝7.55hz,j2＝6.04hz)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3):δ＝7.48ppm.esi-ms:[m+h]+,m/z141.0586(理论值141.0591，相对误差为3.5ppm)。13c4-deph(13c4h11o3p)，结构如下式所示：13c4-deph(13c4h11o3p):1hnmr(600mhz,cdcl3):δ＝7.35(s,0.5h),6.20(s,0.5h),4.26-4.19(m,2h),4.01-3.95(m,2h),1.45-1.39(m,3h),1.23-1.20(m,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3):δ＝61.87(dd,j1＝6.04hz,j2＝4.53hz),16.26(dd,j1＝j2＝6.04hz)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3):δ＝7.50ppm.esi-ms:[m+h]+,m/z143.0653(理论值143.0658，相对误差为3.5ppm)。d213c2-deph(13c2c2d2h9o3p)，结构如下式所示：d213c2-deph(13c2c2d2h9o3p)：1hnmr(600mhz,cdcl3):δ＝7.32(s,0.5h),6.24(s,0.5h),4.22-4.16(m,2h),4.03-3.96(m,2h),1.44-1.37(m,2h),1.24-1.21(m,2h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3):δ＝61.91-61.72(m),16.28(dd,j1＝7.51hz,j2＝6.09hz)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3):δ＝7.52ppmesi-ms:[m+h]+,m/z143.0639(理论值143.0647，相对误差为5.5ppm)步骤6、含稳定同位素标记的亚磷酸二乙酯丙甘二肽活化酯的制备反应条件与实施例1类似，不同之处在于：将普通的丙甘二肽换成步骤4中得到的稳定同位素标记的丙甘二肽，以及把普通的亚磷酸二乙酯换成以上步骤5中得到的碳-13标记的亚磷酸二乙酯即可，得到稳定同位素标记的亚磷酸二乙酯-丙甘二肽，最后与n-羟基丁二酰亚胺进行活化即可制备得到下列等重稳定同位素标记的六标试剂：deph-ala-18oh-15n,13c2-gly(c9h19n2o6p)，结构如下式所示：deph-ala-18oh-15n,13c2-gly(c9h19n2o6p):1hnmr(600mhz,cdcl3):δ＝11.46(s,1h),8.86(s,1h),4.28(s,2h),4.06(m,4h),3.13(qd,j1＝j2＝6.00hz,1h),1.39(d,j＝6.00hz,3h),1.31(m,6h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3):δ＝172.02(d,j＝28.69hz),169.58,63.29(dd,j1＝4.53hz,j2＝6.04hz),45.97,41.38(dd,j1＝j2＝12.08hz),20.84,16.04(dd,j1＝j2＝3.02hz)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3):δ＝7.31ppm.deph-15n-ala-18oh-13c2-gly，结构如下式所示：deph-15n-ala-18oh-13c2-gly(c9h19n2o6p):1hnmr(600mhz,cdcl3):δ＝11.93(s,1h),4.05(q,j＝6.00hz,4h),3.04(qd,j1＝j2＝6.00hz,1h),1.98(s,2h),1.78(s,1h),1.39(d,j＝6.00hz,3h),1.35(t,j＝6.00hz,6h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3):δ＝172.02(d,j＝28.69hz),171.49,60.44,45.85,41.57(d,j＝58.89hz),21.09,14.23ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3):δ＝7.33(d,j＝43.74hz)ppm.13c2-deph-ala-18oh-15n-gly(c9h19n2o6p)，结构如下式所示：13c2-deph-ala-18oh-15n-gly(c9h19n2o6p):1hnmr(600mhz,cdcl3):δ＝10.57(s,1h),6.59(s,1h),4.04(m,4h),3.79(m,2h),3.03(qd,j1＝j2＝6.00hz,1h),1.26(dt,j1＝j2＝6.00hz,6h),1.16(m,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3):δ＝174.19,171.64,62.88(dd,j1＝4.53hz,j2＝6.04hz),46.11,41.24(d,j＝12.08hz),20.65,16.10(dd,j1＝j2＝4.53hz)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3):δ＝7.34ppm.13c2-deph-15n-ala-18oh-gly(c9h19n2o6p)，结构如下式所示：13c2-deph-15n-ala-18oh-gly(c9h19n2o6p):1hnmr(600mhz,cdcl3):δ＝11.61(s,1h),8.34(s,1h),4.23(d,j＝6.00hz,4h),3.99(m,2h),3.15(qd,j＝6.00hz,1h),1.42(t,j＝6.00hz,6h),1.34(m,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3):δ＝173.85(d,j＝6.04hz),172.14,63.26(dd,j1＝4.53hz,j2＝6.04hz),45.93,41.53,20.88(d,j＝4.53hz),16.03(dd,j1＝j2＝7.55hz)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3):δ＝7.28(dt,j1＝j2＝31.59hz)ppm.13c4-deph-ala-15n-gly(c9h19n2o6p)，结构如下式所示：13c4-deph-ala-15n-gly(c9h19n2o6p):1hnmr(600mhz,cdcl3):δ＝11.25(s,1h),8.79(s,1h),4.16(m,4h),3.91(m,2h),3.11(qd,j1＝j2＝6.00hz,1h),1.36(t,j＝6.00hz,6h),1.17(m,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3):δ＝174.01(dd,j1＝j2＝6.04hz),171.79,63.49(dd,j1＝j2＝6.04hz),46.01,41.43(d,j＝12.08hz),20.80(d,j＝6.04hz),15.98(m)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3):δ＝7.29ppm.13c4-deph-15n-ala-gly(c9h19n2o6p)，结构如下式所示：13c4-deph-15n-ala-gly(c9h19n2o6p):1hnmr(600mhz,cdcl3):δ＝10.55(s,1h),9.55(s,1h),3.95(m,4h),3.75(m,2h),2.95(m,1h),1.17(t,j＝6.00hz,6h),0.97(m,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3):δ＝174.18(d,j＝6.04hz),171.34,62.78(dd,j＝7.55hz),46.05,41.19,20.64(d,j＝4.53hz),15.91(m)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3):δ＝7.15ppm.d213c2-deph-15n-ala-gly(c9h19n2o6p)，结构如下式所示：d213c2-deph-15n-ala-gly(c9h19n2o6p)：1hnmr(600mhz,cdcl3):δ＝10.52(s,1h),9.54(s,1h),3.91(m,4h),3.79(m,2h),2.93(m,1h),1.20(t,j＝6.00hz,4h),0.98(m,3h)ppm.13cnmr(151mhz,cdcl3):δ＝174.13(d,j＝6.02hz),171.39,62.75(dd,j＝7.53hz),46.02,41.21,20.622(d,j＝4.51hz),15.88(m)ppm.31pnmr(243mhz,cdcl3):δ＝7.12ppm.实施例4、hela细胞提取总蛋白酶解肽段和isipl0试剂衍生化分析以hela细胞提取总蛋白酶解肽段为例对培养所用的培养基为dmem培养基，细胞培养条件为37摄氏度，5％co2。细胞蛋白提取步骤为：(1)收细胞用细胞刮将细胞收集起来，1xpbs洗2遍；(2)裂解细胞(lysisbuffer:1％sds，350mmnacl，50mmhepes.koh，ph7.8，5mmedta，1mmdtt，0.5mmpmsf)；(3)超声80％功率，超声10s，间隔30s，超声8次；(4)收集裂解液以及细胞碎片，转速13000g，4℃离心15min；(5)转移上清至新的15ml离心管中，利用bca试剂盒测定蛋白浓度(productno.23227)测得的总蛋白浓度为2.3875μg/μl；(6)取1mg总蛋白提取液进行还原烷基化实验：取419ul总蛋白提取液与3mlua(ua溶液为8murea溶于0.1mtris-hclph＝8.0中)混合在filterunits中，3000g离心约1h，重复3次；加入50mmdtt(溶于以上ua溶液中)于filterunits中，室温反应30min，3000g离心约1h；加入50mmiaa(溶于以上ua溶液中)于filterunits中，室温暗处反应30min，3000g离心约1h；加入3mlua在filterunits中，3000g离心约1h，重复6次；加入3ml100mmteab在filterunits中，3000g离心约1h，重复3次。(7)胰酶酶解：加入20μg胰酶(用1ml的100mmteab溶解)，37℃水浴孵育16h。(8)除盐步骤为：胰酶酶解样品酸化至酸度在ph2-4之间；洗柱：加0.1-1ml乙腈，加压至液面接近填料；平衡：加0.1-1ml0.1％甲酸水溶液，加压至液面接近填料，重复一次；上样：将样品全部转移至柱中；除盐：加0.1-1ml0.1％甲酸水溶液洗柱，重复两次；洗脱：加100μl洗脱液(70％乙腈/30％水/0.1％甲酸)，洗脱的样品接入蛋白低吸附管中，干燥后保存于-20℃。衍生化反应的步骤为：蛋白浓度检测仪测定酶解得到的肽段浓度，等体积分成几管(25-100μg每管)。取其中两管进行实验，一管作为空白对照，另一管和isipl0试剂进行衍生化反应。用50μl乙腈溶解isipl0，加入到100μl肽段溶液中，振荡混匀后于冰浴反应半小时，再移至室温反应半小时，之后干燥离心除去乙腈，经过调酸和除盐处理后供质谱分析使用。isipl0标记试剂结构如下所示:lc-ms/ms分析lc-ms/ms分析条件如下：使用thermoscientific公司的nano-uhplcproxeoneasy-nlc1000偶联ltq-orbitrapq-exactive质谱，样品注入液相色谱内首先被捕获柱(c18,3μm,2cm×100μm)捕获，后进入分析柱(acclaimpepmaprslc-c18,2.0μm,150mm×75μm分离)内分离，总进样量为1μg多肽。色谱条件为：5％-45％含0.1％甲酸的乙腈梯度洗脱120分钟；流速：250nl/min。柱流出液直接进入质谱的电喷雾电离源。hcd碎片用于q-exactive平台。选择丰度前20的离子进行破碎和动态排除20秒。由xcalibur软件(thermoscientific)产生原始数据文件经proteomediscovererv2.1处理，并使用sequest搜索软件检索swiss-prot的人类蛋白数据库，完成肽段鉴定与定量分析。鉴定蛋白结果如表1所示：表1hela细胞提取的总蛋白酶解空白对照和isipl0标记检测蛋白数proteinscontrol2552isipl02002从表1可以看出，hela细胞中提取的总蛋白酶解成肽段未进行衍生化反应，只作为空白对照的检测结果是搜索到2552个蛋白；而酶解成肽段并和isipl0标记试剂进行衍生化反应后，检测结果是搜索到2002个蛋白，说明标记试剂的标记效率较好，蛋白丢失较少。实施例5、isipl0标记试剂和商品化标记试剂tmt0对比分析提取总蛋白和酶解成肽段的实验方法同实施例4，酶解得到的肽段测浓度，均分肽段并取其中四管做实验，其中两管加入120μl的isipl0(3mg)乙腈溶液，使m(isipl0):m(peptide)＝30:1，作为平行试验；另两管分别加入40μl的tmt0(0.8mg)乙腈溶液，使m(tmt0):m(peptide)＝8:1作为平行试验。衍生化反应结束后，同样地进行调酸和除盐处理，以及进行质谱分析，质谱分析碎片离子峰如图2所示；鉴定蛋白结果如表2和图3所示：表2isipl0和tmt0标记肽段检测结果proteinspeptidespsmsms/mscontrol2322107821402344792tmt15446984941047974isipl17585396622438955control-repeat2337108011353744287tmt-repeat13835831805546608isipl-repeat17425171591438240由表2和图3可知，在标记1μghela肽段时，使用isipl0检测到的蛋白数为1758个，使用tmt0检测到的蛋白数为1544个，说明isipl标记试剂对微量蛋白具有更好的鉴定效果和检测重复性。实施例6、bsa标准肽段浓度梯度实验：不同浓度标准肽段与isipl0进行衍生化同实施例4，仅将hela细胞提取的总蛋白换成bsa标准蛋白进行还原烷基化和酶解肽段，把标准蛋白bsa酶解得到的肽段测浓度，稀释成0.002λ,0.01λ,0.05λ,0.25λ,0.8λ，等不同浓度，进行标准肽段浓度梯度实验。用相同质量isiplzero试剂和不同浓度的bsa标准肽段进行衍生化，以检测化学标记试剂可进行肽段鉴定的最低浓度。检测结果如表3所示：表3bsa标准肽段浓度梯度实验结果c(bsa)/μg.μl-10.0020.010.050.250.8peptides708587104103psms517965154021632506coverage/％8892909493标准蛋白酶解步骤：将250微克bsa蛋白溶0.1mtris/hclph8.0(8m尿素)缓冲液中，加入10kd的浓缩管中，14,000g离心至30μl左右；加入100μldtt溶液，混匀后，室温静置30分钟；将浓缩管14,000g离心30分钟；加入100μliaa溶液，混匀后，室温静置5分钟；将浓缩管14,000g离心30分钟；向浓缩管中加入100μl0.1mtris/hclph8.0(8m尿素)溶液，14000g离心40分钟，重复两次；向浓缩管中加入160μl溶有胰酶的碳酸氢三乙胺溶液(酶与蛋白比例为1:50)，混匀，37℃孵育16小时；更换收集管，将浓缩管在14,000g下离心40分钟；加入50μl的0.5mnacl，将浓缩管14,000g离心20分钟；用甲酸酸化后(ph在2到4之间)，按照实施例4除盐方法除盐后进行质谱分析。实施例7、hela细胞提取总蛋白酶解肽段浓度梯度实验：不同浓度肽段与isipl0进行衍生化同实施例4，提取hela细胞总蛋白，进行还原烷基化和酶解后进行衍生化反应得到总蛋白酶解浓度为0.6μg/μl，稀释成0.002μg/μl，0.01μg/μl，0.05μg/μl，0.25μg/μl，0.6μg/μl等不同浓度，进行酶解肽段浓度梯度实验。用相同质量(2mg)isiplzero试剂和不同浓度hela细胞提取的肽段(100μl)进行衍生化，反应结束后按照实施例四除盐并进行质谱检测和蛋白质库搜索。检测结果如表4所示：表4hela总蛋白酶解肽段浓度梯度实验结果c(bsa)/μg.μl-10.0020.010.050.250.6proteins5791059195125602721peptides1545350884611185813041psms26226017146912085822913实施例8、isipl两标试剂对hela总蛋白酶解肽段进行定量取hela总蛋白酶解肽段10μg两份，一份加入isipl2-180，另一份加入等量isipl2-181，低温下衍生化反应半小时后移至室温反应一小时。反应结束后离心干燥除去乙腈，剩余物用1％-2.5％甲酸调ph至2-3，之后等量混合后按照实施例四除盐并进行质谱检测,质谱数据用maxquant软件分析，结果共检测到1582个蛋白质，其中有1580个蛋白质报告离子强度比例在0.5-2之间，说明isipl2-plex试剂可以较好的定量复杂的蛋白样品。isipl两标标记试剂结构如下所示:实施例9、isipl6标试剂对bsa标准蛋白进行定量称取一定量的bsa标准蛋白进行还原烷基化和酶解，测浓度后按质量比为3:3:3:1:1:1分为六份，每份中依次加入isipl6-180、isipl6-181、isipl6-182、isipl6-183、isipl6-184、isipl6-185等量的六标试剂，低温下衍生化反应半小时后移至室温反应一小时。反应结束后离心干燥除去乙腈，剩余物用1％-2.5％甲酸调ph至2-3，之后等量混合后按照实施例4除盐并进行质谱检测和蛋白质库搜索，选择了其中几个肽段序列分析如表6所示：表6isipl六标试剂定量标准肽段部分检索结果从表6中可以看出：在报告离子产生区域出现明显的特征报告离子峰m/z180-185，说明磷酸酯基团在质谱检测中有很好的灵敏度且六标试剂标记成功，定量结果准确。isipl6标试剂结构如下所示：实施例10、isipl6标试剂对尿液蛋白进行定量尿样中蛋白的提取方法参考文献资料，取200微升尿液进行离心，上层清液加入filter(3k)进行13000rpm离心处理，离心管中的蛋白参考实例4进行还原烷基化处理，测浓度后，六份样品中依次加入isipl6-180、isipl6-181、isipl6-182、isipl6-183、isipl6-184、isipl6-185等量的六标试剂，低温下衍生化反应半小时后移至室温反应一小时。反应结束后离心干燥除去乙腈，剩余物用1％-2.5％甲酸调ph至2-3，之后等量混合后按照实施例4除盐并进行质谱检测。质谱数据用maxquant软件分析，结果共检测到1459个蛋白质，其中有1406个蛋白质报告离子强度比列在0.5-2之间，说明isipl6标试剂可以较好的定量尿样中的蛋白质。实施例11、isipl6标试剂对血液蛋白进行定量血清中蛋白的提取方法参考文献资料，取200微升血清样品进行离心，上层清液加入filter(3k)进行13000rpm离心处理，离心管中的蛋白参考实例4进行还原烷基化处理，测浓度后，六份样品依次加入isipl6-180、isipl6-181、isipl6-182、isipl6-183、isipl6-184、isipl6-185等量的六标试剂，低温下衍生化反应半小时后移至室温反应一小时。反应结束后离心干燥除去乙腈，剩余物用1％-2.5％甲酸调ph至2-3，之后等量混合后按照实施例4除盐并进行质谱检测。质谱数据用maxquant软件分析，结果共检测到2732个蛋白质，其中有2686个蛋白质报告离子强度比列在0.5-2之间，说明isipl6标试剂可以较好的定量血清中的蛋白质。当前第1页12当前第1页12