一种DSE菌剂制备及其施用方法与共生效应敏感期监测与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种dse菌剂制备及其施用方法与共生效应敏感期监测。

背景技术：

深色有隔内生真菌(darkseptateendophytes，dse)是一类可以与绝大多数植物根系形成互利共生关系的土壤真菌，其菌丝颜色较深，具有明显横隔。已有研究表明，dse具有促进宿主植物吸收矿质营养、促进宿主植物对有机养分的吸收、提高宿主植物的抗逆性和提高宿主的抗病能力的生态功能，其在植物-微生物-土壤三位一体的生态系统中发挥着重作用。目前，dse菌剂限于实验室生产，所消耗人力、物力较大，生产成本较高；为实现其合理化施用，最大化发挥其对植物的作用效益，研究dse菌剂的固体新鲜菌剂制备方法。

另外dse菌剂接入土壤植物根系，开始发挥其作用，与植物建立共生关系，促进植物生长，确定出dse与植物形成共生关系后对促进植物生长的敏感期，对于野外监测最佳时间的选择具有重要意义。

技术实现要素：

本发明一个目的是提供一株新菌株。

本发明提供的格孢菌pleosporalessp.针a2-8，其保藏编号为cgmccno.18812。

本发明第二个目的是提供一种菌剂。

本发明提供的菌剂，为固态菌剂，其按照包括如下步骤的方法制备：

1)将上述格孢菌接入液体培养基中培养，得到培养液；

2)过滤培养液，收集固态物质(呈团状粘稠物质)，得到菌剂。

上述菌剂中，所述培养的时间为4-6天。

上述菌剂中，所述培养条件为25-28℃、160-180r/min振荡培养。

上述菌剂中，所述过滤采用中速滤纸；

或，所述液体培养基为液体mmn培养基。

上述菌剂中，将所述格孢菌接入液体培养基为将所述格孢菌的菌丝体接入液体培养基；

所述格孢菌的菌丝体按照如下方法制备：

a)将所述格孢菌在固体培养基中培养至布满菌丝体；

b)再从布满菌丝的培养基上取菌片接入所述液体培养基中培养；

上述菌剂中，所述菌片的直径和所述液体培养基的配比为1mm：25-35ml；具体为所述菌片的直径和所述液体培养基的配比为1mm：30ml；

在本发明的实施例中，具体采用菌片的直径为5mm；液体培养基体积为150ml。

上述菌剂中，所述得到的培养液浓度为每ml培养液所含dse干物质的量为4.5-8.7mg。

本发明的实施例中，所述在固体培养基中培养的条件为25-28℃恒温倒置培养7-10天；采用的固体培养基为pda培养基。

上述格孢菌或上述菌剂在如下1)-5)中至少一种中的应用也是本发明保护的范围内：

1)促进植物生长；

2)促进植物在贫瘠土壤中生长；

3)野外生态治理或修复；

4)监测des菌与植物共生效应；

5)野外土地复垦和/或生态重建。

本发明还有一个目的是提供一种监测des菌与植物共生效应的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：对植物施上述第二个目的制备的菌剂，培养，选择培养后15-20天的时段监测共生效应。

上述培养为在贫瘠土壤中生长。

上述共生效应体现在与不接菌剂的对照相比，接入菌剂促进植物鲜重增加。

本发明采用的培养条件为25℃，3000lx的光强，光照时间16h白天/8h晚上，维持培养基质持水量在60％-80％之间。

本发明第4个目的是提供一种促进植物生长的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：对植物施用上述的菌剂，培养，实现促进植物生长。

上述方法中，所述对植物施用上述第二个目的制备的菌剂为按照每2-3g种子接种6g菌剂的方式，将所述菌剂接入所述植物的种子所在培养基质中；

在本发明的实施例中，所述对植物施用上述第二个目的制备的菌剂具体为按照每2.3g种子接种6g菌剂的方式(每10粒种子接种0.06g菌剂)，将所述菌剂接入所述植物的种子所在培养基质中。

本发明采用的培养条件为25℃，3000lx的光强，光照时间16h白天/8h晚上，维持培养基质持水量在60％-80％之间。

在本发明的实施例中，所用的植物为苜蓿，具体为紫花苜蓿。

本发明的实验证明，本发明提供了一种新菌株及其制备的固态菌剂，将其施用于于植物，促使该菌与植物达成共生关系，使该菌对植物的促生长效应达到最大化，找到菌与植物侵染共生体形成的过程，其共生敏感时段的监测，将更好揭示出dse生态修复效应，对于利用微生物技术提高土地复垦效率节约成本，更具有经济效益，也为野外规模化土地复垦和生态重建提供一种微生物技术支撑。该方法更有易于发挥dse菌剂作用效率最大化，为dse菌剂的规模施用提供经济、高效的科学方法。

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：链格孢alternariasp.

生物材料的菌株编号：001

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：cgmcc

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

生物材料的保藏日期：2019年4月8日

生物材料的保藏中心登记入册编号：cgmccno.17463

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：darksideazeta

生物材料的菌株编号：针a1-3

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：cgmcc

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

生物材料的保藏日期：2019年4月8日

生物材料的保藏中心登记入册编号：cgmccno.17464

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：格孢菌pleosporalessp.

生物材料的菌株编号：针a2-8

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：cgmcc

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

生物材料的保藏日期：2019年11月19日

生物材料的保藏中心登记入册编号：cgmccno.18812

附图说明

图1为针a2-8的形态照片。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pda培养基：将马铃薯浸粉3.0g，葡萄糖20.0g和琼脂14.0g混合后，加入蒸馏水1000ml，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15min，备用。

液体mmn培养基(ph5.5)：将cacl20.05g、mgso40.15g、nacl0.025g、fecl30.01g、kh2po40.5g、vitaminb1(硫胺素)0.0001g、(nh4)2hpo40.25g、葡萄糖10g、柠檬酸0.2g和maltextract(麦芽提取物)10g混合，得到混合物，然后加入蒸馏水并定容至1l，分装，121℃高压灭菌30min，备用。

实施例1、dse菌株的分离和鉴定及保藏

挑选从内蒙古自治区锡林郭勒盟锡林浩特市北电胜利矿区采集的针茅新鲜根样，用无菌水多次清洗，放入75％乙醇水溶液消毒5min，无菌水冲洗3次，再放入10％次氯酸钠水溶液消毒5min，无菌水清洗3次，用滤纸吸去根样表面水分。将根段剪成1cm左右小段，放入加有抗生素(含50mg/lampicillin和50mg/lstreptomycinsulfate)的pda培养基，每个培养皿放2-3个根段。于28℃黑暗条件下分离培养并纯化。

分离纯化得到1号菌、2号菌和5号菌。

检测1号菌的its序列，如序列表中序列1所示，鉴定为深色有隔内生真菌(dse)，命名为001。该菌株已于2019年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17463，分类命名为链格孢alternariasp.。

检测2号菌的its序列，如序列表中序列2所示，鉴定为深色有隔内生真菌(dse)，命名为针a1-3。该菌株已于2019年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17464，分类命名为darksideazeta。

检测5号菌的its序列，如序列表中序列3所示，鉴定为格孢菌pleosporalessp.，命名为针a2-8。该菌株已于2019年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18812，分类命名为格孢菌pleosporalessp.。

针a2-8的形态照片见图1，具有典型的深色暗隔菌丝和由细胞壁膨大加厚的细胞紧密堆积形成的微菌核结构，其属于深色有隔内生真菌(darkseptateendophytes，dse)。

实施例2、不同培养天数的dse菌剂对紫花苜蓿的促生效应

一、不同培养天数的dse菌剂的制备

1、针a2-8菌剂的制备

1)活化

将格孢菌pleosporalessp.cgmccno.18812自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于pda培养基的平皿中；于28℃恒温倒置黑暗培养7天，待菌丝布满平皿，在菌落边缘打孔成菌片；

2)固态菌剂制备

将直径为5mm的菌片(菌丝)接入150ml液体mmn培养基中，28℃，180r/min分别黑暗震荡培养4、6、8、10天，得到培养4天后针a2-8培养液(4.6mg/ml)、培养6天后针a2-8培养液(7.9mg/ml)、培养8天后针a2-8培养液(8.0mg/ml)、培养10天后针a2-8培养液(8.7mg/ml)；在无菌操作台中用灭菌的中速定性滤纸(30-50微米孔径)将各个培养液进行过滤，在定性滤纸中收集固体(呈团状粘稠物质)，得到培养4天后针a2-8菌剂(0.6911g)、培养6天后针a2-8菌剂(1.1859g)、培养8天后针a2-8菌剂(1.1999g)、培养10天后针a2-8菌剂(1.3031g)，备用。

上述培养液的浓度为每ml培养液中dse菌干物质的量。

上述菌剂的量为干物质的量。

2、针a1-3菌剂的制备

1)活化

将darksideazetacgmccno.17464自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于pda培养基的平皿中；于28℃恒温倒置黑暗培养7天，待菌丝布满平皿，在菌落边缘打孔成菌片；

2)菌剂制备

将直径为5mm的菌片接入150ml液体mmn培养基中，28℃，180r/min分别黑暗震荡培养4、6、8、10天，在无菌操作台中用灭菌的30～50微米孔径定性滤纸将dse菌液进行过滤，在定性滤纸中收集固体(呈团状粘稠物质)，得到培养4天后针a1-3菌剂、培养6天后针a1-3菌剂、培养8天后针a1-3菌剂、培养10天后针a1-3菌剂，备用。

3、001菌剂的制备

1)活化

将alternariasp.cgmccno.17463自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于pda培养基的平皿中；于28℃黑暗恒温倒置培养7天，待菌丝布满平皿，在菌落边缘打孔成菌片；

2)菌剂制备

将直径为5mm的菌片接入150ml液体mmn培养基中，28℃，180r/min分别黑暗震荡培养4、6、8、10天，在无菌操作台中用灭菌的30～50微米孔径定性滤纸将dse菌液进行过滤，在定性滤纸中收集固体(呈团状粘稠物质)，得到培养4天后001菌剂、培养6天后001菌剂、培养8天后001菌剂、培养10天后001菌剂，备用。

二、不同培养天数的dse菌剂对紫花苜蓿的促生效应

培养基质：采自北京市北沙滩的沙土(营养成分单一，模拟贫瘠土地)，过筛(目数为2mm)，121℃高温高压蒸汽灭菌2h，自然风干，备用。

供试植物：紫花苜蓿品种为雅典娜紫花苜蓿(可从新余市硕农农业有限公司获得)，将颗粒饱满的紫花苜蓿种子用浓度10％(质量分数)的h2o2水溶液浸泡10min进行表面消毒，用无菌水清洗5-6次，备用。

试验用盆：试验用盆采用270ml的一次性纸杯，体积百分含量75％乙醇溶液消毒，每杯装培养基质250g。

试验方案：每种菌剂分别设计如下5个处理：

处理1：接入培养4天后的dse菌剂；

处理2：接入培养6天后的dse菌剂；

处理3：接入培养8天后的dse菌剂；

处理4：接入培养10天后的dse菌剂；

对照组：未接入菌剂；

上述每个处理3个重复，共15杯。

具体实验如下：

先将纸杯浇水至培养基质持水量的70％，用无菌铁匙在基质上挖出孔穴，用无菌的镊子按照上述每个菌剂的5个处理组方式分别将0.06g对应的dse菌剂接入穴内，覆少许沙土；再将10粒(约0.023g)紫花苜蓿种子接入培养基质，覆盖培养基质共生培养，培养条件：在人工气候箱内共生培养，25℃，3000lx的光强，光照时间16h白天/8h晚上，维持基质持水量在60％-80％之间。30天后收获接种每个菌剂对应的5个处理组的紫花苜蓿全部植株，称取紫花苜蓿全部植株鲜重。每个处理组收3盆，(实验重复1次)，结果取平均值。

上述每种dse菌剂对应的5个处理组分别接入上述一制备的不同培养天数得到的a2-8菌剂、不同培养天数得到的a1-3菌剂和不同培养天数得到的001菌剂。

结果如下：

接种培养4天后针a2-8菌剂接种紫花苜蓿共生培养30天后紫花苜蓿鲜重为0.2680g；

接种培养6天后针a2-8菌剂接种紫花苜蓿共生培养30天后紫花苜蓿鲜重为0.2916g；

接种培养8天后针a2-8菌剂接种紫花苜蓿共生培养30天后紫花苜蓿鲜重为0.1924g；

接种培养10天后针a2-8菌剂接种紫花苜蓿共生培养30天后紫花苜蓿鲜重为0.1826g；

接种培养4天后针a1-3菌剂接种紫花苜蓿共生培养30天后紫花苜蓿鲜重为0.2448g；

接种培养6天后针a1-3菌剂接种紫花苜蓿共生培养30天后紫花苜蓿鲜重为0.2254g；

接种培养8天后针a1-3菌剂接种紫花苜蓿共生培养30天后紫花苜蓿鲜重为0.2122g；

接种培养10天后针a1-3菌剂接种紫花苜蓿共生培养30天后紫花苜蓿鲜重为0.1560g。

接种培养4天后001菌剂接种紫花苜蓿共生培养30天后紫花苜蓿鲜重为0.2382g；

接种培养6天后001菌剂接种紫花苜蓿共生培养30天后紫花苜蓿鲜重为0.1806g；

接种培养8天后001菌剂接种紫花苜蓿共生培养30天后紫花苜蓿鲜重为0.1801g；

接种培养10天后001菌剂接种紫花苜蓿共生培养30天后紫花苜蓿鲜重为0.1491g。

对照组：不接入菌剂紫花苜蓿单独培养30天后紫花苜蓿鲜重为0.1630g。

本实施例中的如下百分比为(各组紫花苜蓿鲜重-对照组紫花苜蓿鲜重)/对照组紫花苜蓿鲜重的百分比。

接种培养4、6、8、10天后针a2-8菌剂对紫花苜蓿生长量相比对照组提高了64.41％、78.84％、18.04％、12.02％。

接种培养4、6、8、10天后针a1-3菌剂对紫花苜蓿生长量相比对照组提高了50.16％、38.27％、30.15％、-4.29％。

接种培养4、6、8、10天后001菌剂对紫花苜蓿生长量相比对照组提高了46.16％、10.82％、10.48％、-8.53％。

上述结果表明，与针a1-3菌剂和001菌剂相比，接种针a2-8菌剂显著促进紫花苜蓿的生长量，具体体现在鲜重。接种针a2-8菌剂中，培养4-6天的针a2-8菌剂对紫花苜蓿促生效应更明显，且培养时间较短，更具经济性。尤其是培养6天后针a2-8菌剂对紫花苜蓿促生效应最为显著(相比对照提高的百分比最大)。

实施例3、接种dse菌剂对不同时间段紫花苜蓿的生长效应

一、不同培养天数的dse菌剂的制备

与实施例2的一相同；

二、接种dse菌剂对不同时间段紫花苜蓿的生长效应

培养基质：采自北京市北沙滩的沙土(营养成分单一，模拟贫瘠土地)，过筛(目数为2mm)，121℃高温高压蒸汽灭菌2h，自然风干，备用。

供试植物：紫花苜蓿品种为雅典娜紫花苜蓿，将颗粒饱满的紫花苜蓿种子用浓度10％(质量分数)的h2o2水溶液浸泡10min进行表面消毒，用无菌水清洗5-6次，备用。

试验用盆：试验用盆采用270ml的一次性纸杯，体积百分含量75％酒精消毒，每杯装培养基质250g。

试验方案：针a2-8菌剂分别设计如下5个处理：

处理1：接入培养4天后的dse菌剂针a2-8；

处理2：接入培养6天后的dse菌剂针a2-8；

处理3：接入培养8天后的dse菌剂针a2-8；

处理4：接入培养10天后的dse菌剂针a2-8；

对照组：未接入菌剂针a2-8；

上述每个处理3个重复，共15杯。

具体实验如下：

先浇水至基质持水量的70％，用无菌铁匙在基质上挖出孔穴，用无菌的镊子按照上述每个菌剂的5个处理组方式分别将0.06g对应的dse菌剂针a2-8接入穴内，覆少许沙土；再将10粒(约0.023g)紫花苜蓿种子接入培养基质，覆盖培养基质共生培养，培养条件：在人工气候箱内共生培养，25℃，3000lx的光强，光照时间16h白天/8h晚上，维持基质持水量在60％-80％之间。在共生培养10、15、20、25、30天后收获接种接种针a2-8菌剂对应的5个处理组的紫花苜蓿全部植株，称取紫花苜蓿全部植株鲜重。每个处理组收3盆，结果取平均值。

上述针a2-8dse菌剂对应的5个处理组分别接入上述一制备的不同培养天数得到的a2-8菌剂。

结果如表1所示。

表1针a2-8菌剂不同处理下不同生长时间紫花苜蓿鲜重

根据表1计算出针a2-8菌剂接种后共生培养不同时间段的植物增长率，寻找dse与植物共生最敏感的时段；计算公式为一个时间段内紫花苜蓿的鲜重增长率＝(后一时间点鲜重-前一时间点鲜重)/前一时间点鲜重×100％，结果见表2。

表2针a2-8菌剂不同处理下不同生长时间段紫花苜蓿鲜重增长率(％)

试验结果表明，接种dse真菌针a2-8菌剂的紫花苜蓿相比对照组，培养4-8天的dse菌剂均与紫花苜蓿共生15-20天生长较快，且无明显差异，该时期为监测dse接菌效果的最敏感时段，可在此阶段进行接种效应的监测更能敏感反映出dse的作用效果；这与促进紫花苜蓿生长的结果基本一致。

sequencelisting

<110>中国矿业大学（北京）西安科技大学

<120>一种dse菌剂制备及其施用方法与共生效应敏感期监测

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