本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及化学耐受性的葡萄糖脱氢酶突变体，其编码核酸，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，突变体酶制剂的制备方法，以及该突变体酶制剂在氧化还原反应中参与辅酶再生中的应用。
背景技术：
葡萄糖脱氢酶(glucosedehydrogenase,gdh)是用于辅酶再生的一类重要工具酶。它能催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，同时将产生的氢负离子与电子受体nad+或nadp+结合，生成还原型辅酶nadh或nadph，从而实现还原型辅酶的循环再生。葡萄糖脱氢酶催化辅酶再生具有以下优点：(1)酶催化效率高；(2)双辅酶再生(nadh和nadph)，(3)所使用的底物葡萄糖廉价易得；(4)对于nad(p)+的km较小，即与辅酶的亲和力大；(5)反应不可逆。上述的这些优点使得葡萄糖脱氢酶在辅酶再生的领域具有广泛的应用前景及潜力。为了满足工业应用日益增长的需求，从巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中克隆获得了多种葡萄糖脱氢酶并于大肠杆菌中重组表达。并且已经详细研究了来自巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶的特征。
在应用方面，makino等人对来源于bacillusmegateriumiwg3的葡萄糖脱氢酶进行了化学诱变，得到了四株热稳定性提高的突变体e96a、e96g、q252l和y253c，其中e96a最稳定，与母本相比，热稳定性提高了大约20℃(febslett.,1989,253:113-116)。baik等人将来源于bacilluslicheniformisifo12200，bacillusmegateriumifo15308，bacillussubtilisifo13719和来源于bacillusmegateriumiwg3的葡萄糖脱氢酶突变体q252l通过dnashuffling得到了一个热稳定性进一步提高的突变体q252l/e170k(appl.environ.microbiol.,2005,71:3285-3293)。通过上述分子改造，使得高活性天然葡萄糖脱氢酶突破了热稳定性差的瓶颈，从而使其在工业应用中具有更大的竞争优势。
葡萄糖脱氢酶作为一种性能优良的辅酶再生工具酶，因其良好的催化活性和热稳定性，已经基本满足了大部分的实际应用需求。但在大规模工业应用中，催化体系中常常存在高浓度的疏水性底物或产物，导致葡萄糖脱氢酶快速失活，限制了其广泛应用。酶在高浓度疏水性底物或产物中的稳定性，通常称为化学耐受性或化学稳定性，类似于有机溶剂的耐受性。ding等人发现来源于lactobacillussalivarius的葡萄糖脱氢酶lsgdh在与水互溶的有机溶剂和双相溶剂系统中都表现出了较高的化学稳定性，但在正丁醇中却展现出很差的化学耐受性，使用10％(v/v)的正丁醇处理后，其活性几乎完全丧失(bioresour.technol.,2011,102:1528-1536)。研究人员也在酶有机溶剂耐受性方面做了大量改造工作，其中利用蛋白质工程来提高酶的有机溶剂耐受性已成为比较成熟的方法。酶工程的方法集中于改变蛋白质分子的一级序列，以产生在有机介质中具有优异稳定性和活性的酶突变体。但是，目前针对葡萄糖脱氢酶对于高浓度底物耐受性的改造工作还未见报道。通过定向进化等蛋白质工程技术对其结构进行分子改造，提高其化学稳定性及在高浓度化学品转化体系中的辅酶再生能力，有助于进一步降低酶催化生产成本、推动生物催化在医药、农药、材料、能源等领域中的更广泛应用。
技术实现要素：
鉴于现有技术存在的不足，本发明选择已报道具有高活性和热稳定性的bmgdhq252l/e170k(pdb:1rwb)作为目标，通过蛋白质工程的手段对其进行进一步的分子改造，使用高浓度1-苯乙醇对突变库进行有机溶剂耐受性筛选，获得了对高浓度化学品耐受性显著提升的突变体，增强了该酶的应用性。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
技术方案之一，本发明提供对高浓度苯乙醇耐受性显著提升的葡萄糖脱氢酶突变体。以氨基酸序列如seqidno.2所示的葡萄糖脱氢酶bmgdh作为母本，通过随机突变的方法，结合酶标仪高通量初筛和进一步摇瓶复筛，鉴别获得多个对高浓度苯乙醇耐受性提高的突变体，与母本相比，优选的突变体不仅提高了其化学稳定性，在热稳定性方面也有所提高。
本发明所述葡萄糖脱氢酶突变体，是将如seqidno.2所示氨基酸序列的蛋白质的第23位甲硫氨酸、第41位赖氨酸、第47位丝氨酸、第72位缬氨酸、第74位天冬酰胺、第85位赖氨酸、第99位缬氨酸、第100位丝氨酸、第111位赖氨酸、第137位赖氨酸、第139位苏氨酸、第166位赖氨酸、第194位脯氨酸、第202位天冬氨酸、第210位谷氨酸或第213位异亮氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质，所述衍生蛋白质对高浓度苯乙醇耐受性显著提升，在热稳定性方面也有所提高。
具体的，所述葡萄糖脱氢酶突变体是如下序列中的一种：
(1)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸；
(2)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(3)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(4)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(5)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸；
(6)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(7)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(8)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第23位甲硫氨酸替换为缬氨酸，第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(9)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸；
(10)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第137位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(11)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第72位缬氨酸替换为异亮氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(12)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸，第139位苏氨酸替换为丙氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸；
(13)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(14)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第47位丝氨酸替换为半胱氨酸，第85位赖氨酸替换为苏氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(15)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第111位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第194位脯氨酸替换为精氨酸；
(16)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第72位缬氨酸替换为异亮氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第137位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(17)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第111位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(18)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第41位赖氨酸替换为甲硫氨酸，第74位天冬酰胺替换为丝氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第213位异亮氨酸替换为缬氨酸；
(19)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第74位天冬酰胺替换为天冬氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第111位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第194位脯氨酸替换为精氨酸。
技术方案之二，本发明提供编码所述葡萄糖脱氢酶突变体的核酸序列。同时，本发明还提供含有所述酶基因核酸序列的重组表达载体。
所述核酸编码表达如技术方案一所述的进化改造获得的葡萄糖脱氢酶突变体，其来源包括：通过基因工程技术对技术方案一所述的系列葡萄糖脱氢酶突变体的基因序列进行克隆；或者通过人工全序列合成的方法得到编码如技术方案一所述葡萄糖脱氢酶突变体的核酸分子。
所述的重组表达载体可通过本领域常规方法，将本发明所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因的编码核酸序列连接于各种市售空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并能表达出相应的酶即可。针对不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。对于大肠杆菌宿主，所述质粒载体优选的为pet-28a(+)质粒。可通过下述方法制备本发明所述的大肠杆菌重组表达载体：将通过pcr扩增所得的葡萄糖脱氢酶突变体基因片段用限制性内切酶ndei和bamhi双酶酶切，同时将空载质粒pet-28a(+)同样用限制性内切酶ndei和bamhi进行双酶酶切，回收上述酶切后的葡萄糖脱氢酶突变体的dna片段以及空载质粒，利用t4dna连接酶进行连接，构建获得用于大肠杆菌表达的含有所述葡萄糖脱氢酶突变体编码核酸的重组表达载体。
技术方案之三，本发明提供包含本发明所述葡萄糖脱氢酶突变体基因或其重组表达载体的重组表达转化体。
可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导有效表达目标蛋白即可。本发明首选大肠杆菌作为宿主细胞，更优选大肠杆菌e.colibl21(de3)用于高效表达本发明所述的葡萄糖脱氢酶突变体。
技术方案之四，本发明提供重组葡萄糖脱氢酶突变体催化剂，所述的重组葡萄糖脱氢酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述葡萄糖脱氢酶突变体的转化体细胞；
(2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述葡萄糖脱氢酶突变体的粗酶液；
(3)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述葡萄糖脱氢酶突变体的粗酶液，冷冻干燥得到的粗酶粉。
(4)所述葡萄糖脱氢酶突变体直接作为重组葡萄糖脱氢酶突变体催化剂。
其中所述重组表达转化体的培养方法和条件为本领域常规的方法和条件，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组葡萄糖脱氢酶突变体。对于重组大肠杆菌，优选培养基为lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，ph6.5-7.0。优选的培养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素(kanamycin)的lb培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1-2％(v/v)的接种量接入装有100mllb培养基(含卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的od600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)作为诱导剂，16-25℃诱导16-24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述葡萄糖脱氢酶突变体的冻干细胞。将收获的重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组葡萄糖脱氢酶突变体的粗酶液。收集的粗酶液置于-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到冻干酶粉。将所获得的冻干酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。
本发明中所述葡萄糖脱氢酶突变体的活力测定方法：将含200mm葡萄糖和1mmnadp+的1ml反应体系(100mm磷酸钠缓冲液，ph7.0)预热至30℃，然后加入适量的葡萄糖脱氢酶突变体，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处nadph的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值。
用下式计算得到酶活力：
酶活力(u)＝ew×v×103/(6220×l)
式中，ew为1分钟内340nm处吸光度的变化；v为反应液的体积，单位为ml；6220为nadph的摩尔消光系数，单位为l/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(u)定义为上述条件下每分钟催化生成1μmolnadph所需的酶量。
技术方案之五，本发明提供所述bmgdh母本及其突变体对苯乙醇耐受性的检测方法，将纯化后的所述bmgdh与10％(v/v)的苯乙醇溶液混合，纯酶浓度控制在0.5mg/ml。并于30℃、1000r/min的振荡反应器中振荡，每隔一段时间取样测定残余活力，按照本发明技术方案四中所述的葡萄糖脱氢酶突变体活力测定方法测定残余酶活力，计初始酶的活力为100％，以此来衡量所述bmgdh对所测化合物的耐受性。
技术方案之六，本发明提供了所述bmgdh母本及其突变体热稳定性(t5060)的检测方法，将纯化后的所述bmgdh分别置于不同温度下保温，纯酶浓度控制在0.5mg/ml。每隔一段时间取样测定残余活力，按照本发明技术方案四中所述的葡萄糖脱氢酶突变体活力测定方法测定残余酶活力，计未处理酶的酶活力为100％，当残余酶活力下降到20％以下，即定义为失活，从而确定所述bmgdh的热稳定性。
技术方案之七，本发明提供技术方案之四所述的重组葡萄糖脱氢酶突变体催化剂的应用。
所述重组葡萄糖脱氢酶突变体催化剂在催化辅酶nadh和nadph再生中的应用。
本发明利用定向进化技术对巨大芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶进行了分子改造，得到了热稳定性和化学耐受性均显著提升的突变体，满足了工业应用的需求。与现有技术相比，本发明所述突变体不仅具有高的活性和热稳定性，而且还具有很好的化学耐受性，将更有助于含高浓度有机助溶剂或高浓度底物/产物的生物催化反应体系中的辅酶再生，在工业应用中显示出更加广泛的应用前景。
具体实施方式
本发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案和技术效果进行清楚、完整地描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
下列实施例中的材料来源为：
母本重组质粒pet28a-bmgdh，含有如序列表seqidno.1所示的核酸序列，为发明人自行构建，并进行了相应的密码子优化。采用本领域常规技术方法(如聚合酶链反应pcr)，获得编码所述bmgdh的完整核酸分子。其中涉及的合成引物，选的如seqidno.3和seqidno.4所示：
正向引物seqidno.3：gggaattccatatgatgtataaagatttag
反向引物seqidno.4：cgcggatccttatccgcgtcctgcttg
空质粒载体pet-28a购自novagen公司。
e.colibl21(de3)感受态细胞、2×taqpcrmastermix、琼脂糖凝胶dna回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。
限制性内切酶ndei和bamhi均为newenglandbiolabs(neb)公司的市售产品。
除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照试剂盒的商品说明书。
实施例1随机突变筛选对高浓度苯乙醇耐受性提高的bmgdh突变体
由于影响酶稳定性的位点一般在酶的表面或者loop结构上，很难用理性或者半理性的方法来进行改造，本发明采用随机突变的策略来改善该酶对高浓度苯乙醇的耐受性。
根据bmgdh的开放阅读框，设计上、下游引物如下：
上游引物，如seqidno.3所示：
gggaattccatatgatgtataaagatttag
下游引物，如seqidno.4所示：
cgcggatccttatccgcgtcctgcttg
其中上游引物下划线所示序列为ndei的酶切位点，下游引物下划线所示序列为bamhi的酶切位点。
以质粒pet28a-bmgdh为模板，用rtaqdna聚合酶进行易错pcr，构建随机突变库。pcr体系(50μl)：rtaqdna聚合酶1μl，10×pcrbuffer(mg2+plus)5.0μl，dntpmixture(各2.0mm)4.0μl，终浓度为70μm的mncl2，pet28a-bmgdh质粒150ng，上下游引物(10μm)各1.5μl，加灭菌蒸馏水补足至50μl。pcr反应程序：(1)95℃预变性3min；(2)95℃变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存产物。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，对回收后的目的基因dna片段与空载质粒pet28a分别用限制性内切酶ndei和bamhi在37℃双酶切12h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用t4dna连接酶将得到的线性化pet28a质粒与纯化后的目的基因片段置于16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌e.colibl21(de3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h。
将转化平板上的转化体用牙签挑入96孔深孔板中，于37℃，220rpm摇床中培养过夜。从一级板孔中吸取20μl菌液接入相应的二级板孔中，于37℃，220rpm摇床中培养2-3h后，加入终浓度为0.2mm的iptg，16℃培养20h。然后于4℃、3500×g离心10min，倒掉上层培养基，每个孔中加入200μl溶菌酶液(750mg溶菌酶和10mgdna酶溶解于1l去离子水中)，振荡混匀，再于37℃摇床上处理2.5h。于破碎酶液中加入终浓度为10％的苯乙醇(v/v)进行振荡温育若干小时，以nadp+为辅酶，在96孔板中对表达的蛋白进行高通量筛选，将对苯乙醇耐受性较高的突变体进行纯化表征，对相应的基因进行测序。
所述bmgdh突变体的高通量活力筛选测定方法：将含100mm葡萄糖和0.5mmnadp+的磷酸钠缓冲液(10mm，ph6.0)分装到96孔板中，预热至30℃，然后分别加入适量的bmgdh突变体，30℃振荡反应，在酶标仪上检测340nm处nadph的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值，计算相应的酶活力。
实施例2bmgdh有益突变体的dnashuffling
在实施例1突变的基础上，采用dnashuffling的方法随机组合易错pcr得到的优势突变体。第一步先将这些优势突变体分别抽取重组质粒，以等摩尔混合后作为模板，pcr扩增突变体基因，pcr反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)95℃变性1min；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。混合质粒pcr扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒纯化回收与目的片段大小相同的条带，目的片段浓缩回收后的浓度尽可能不低于200ng/μl。第二步是基因片段的碎片化，dnasei碎片化体系(200μl)：90μl回收的混合目的基因(240ng/μl),4μldnasei(2u/μl),20μl10×dnaseireactionbuffer,86μlddh2o。37℃水浴反应3-4min，取出立即加入100μledta(500mm,ph8.0)，75℃保温处理10min，使dnasei完全失活终止反应。冷却后加入60μl特制dna上样缓冲液。2％(w/v)琼脂糖进行dna凝胶电泳分离，胶回收试剂盒(生工微量琼脂糖凝胶dna回收试剂盒)回收大小为50–250bp的dna片段。特制的上样缓冲液配方：0.25％(w/v)二甲基青，0.1m乙二胺四乙酸(edta，ph8.0)，30％(v/v)甘油。第三步是重聚pcr，pcr扩增程序：(1)95℃,2min；(2)94℃,30s；(3)65℃,30s；(4)60℃,30s；(5)55℃,30s；(6)50℃,30s；(7)45℃,30s；(8)72℃,1min，步骤(2)～(8)共进行45个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存产物。最后一步是有引物pcr，pcr扩增程序和第一步相同，pcr扩增后得到的产物用胶回收试剂盒回收，然后用ndei和bamhi双酶切并与双酶切pet-28a(+)质粒连接后转化入e.colibl21(de3)感受态细胞中，获得dnashuffling突变体库。
通过3轮易错pcr和1轮dnashuffling的建库高通量筛选，得到了对高浓度苯乙醇耐受性显著提高的突变体，进而对这些突变体的纯酶比活和热稳定性(t5060)进行了表征，优选对苯乙醇耐受性增高的系列突变体，且这些突变体的活力和热稳定性都较良好，这些突变体的序列以及这些突变体对nadp+的活性，对苯乙醇耐受性和热稳定性列于表1中。在表1中，序列标号分别对应于表1后面的一系列序列。在活性列中，与母本bmgdh(序列表中seqidno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质)相比，一个加号“+”表示突变体蛋白对nadp+的活性提高了0.1-1倍；两个加号“++”表示突变体蛋白对nadp+的活性提高了1-2倍；三个加号“+++”表示突变体蛋白对nadp+的活性提高了2-10倍。在热稳定性列中，与母本bmgdh(序列表中seqidno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质)相比，一个加号“+”表示突变体蛋白的t5060提高0.1-1℃；两个加号“++”表示突变体蛋白的t5060相比母本提高1-2℃；三个加号“+++”表示突变体蛋白的t5060相比母本提高2-5℃。在对苯乙醇的耐受性列中，与母本bmgdh(序列表中seqidno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质)相比，一个加号“+”表示突变体蛋白对10％(v/v)苯乙醇的耐受性提高了0.1-1倍；两个加号“++”表示突变体蛋白对10％(v/v)苯乙醇的耐受性提高了1-5倍；三个加号“+++”表示突变体蛋白对10％(v/v)苯乙醇的耐受性提高了5-20倍。
表1葡萄糖脱氢酶突变体序列、活力、热稳定性和对苯乙醇耐受性提高倍数
对应序列标号的甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列分别如下：
(1)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸；
(2)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(3)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(4)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(5)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸；
(6)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(7)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(8)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第23位甲硫氨酸替换为缬氨酸，第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(9)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸；
(10)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第137位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(11)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第72位缬氨酸替换为异亮氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(12)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸，第139位苏氨酸替换为丙氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸；
(13)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(14)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第47位丝氨酸替换为半胱氨酸，第85位赖氨酸替换为苏氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(15)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第111位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第194位脯氨酸替换为精氨酸；
(16)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第72位缬氨酸替换为异亮氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第137位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(17)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第111位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(18)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第41位赖氨酸替换为甲硫氨酸，第74位天冬酰胺替换为丝氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第213位异亮氨酸替换为缬氨酸；
(19)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第74位天冬酰胺替换为天冬氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第111位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第194位脯氨酸替换为精氨酸；
实施例3bmgdh的表达与活力测定
将重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28a-bmgdh接种至含50μg/ml卡那霉素的4mllb培养基中，37℃摇床振荡培养过夜后以1％的接种量将菌液接种到含有50mllb液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)的250ml三角摇瓶中37℃培养2-3h。然后将50ml的菌液接种到含有600mltb液体培养基的2l三角摇瓶中，于37℃培养2-3h后加入0.2mm的iptg诱导剂进行诱导，于16℃再培养20-24h。诱导结束后用高速冷冻离心机(4℃,12000×g,10min)收集细胞。收集的湿菌体以过量的生理盐水重悬，4℃，12000×g，离心10min，并以相同的操作重复洗涤2-3次。将收集的湿菌体称重后按照每1g湿菌体加入10ml的pbs(10mm,ph6.5)缓冲液的比例进行重悬。重悬后的菌液经过100目的筛子过滤后置于冰上等待破碎。用高压匀浆破碎仪进行破碎，将收集的破碎酶液于-80℃冰箱冷冻过夜。将冷冻成固体的酶液通过冷冻干燥，最后得到的冻干酶粉称重后于4℃冰箱保存备用，获得的粗酶粉测定其比活力为4.8u/mg。
实施例4bmgdhm19的表达与活力测定
将实施例2中获得的表达突变体m19的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28a-bmgdhm19接种至含50μg/ml卡那霉素的4mllb培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接入装有100mllb培养基(含50μg/ml卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的od600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/l的iptg作为诱导剂，16℃诱导24h。将培养液以8000×g离心10min，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞。将100ml培养液中获得的细胞悬浮于10ml的磷酸钠缓冲液(100mm,ph7.0)中，冰水浴中进行如下超声破碎：400w功率，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下12000×g离心40分钟，收集上清粗酶液。将上清粗酶液采用镍柱亲和层析得到纯蛋白，测定其纯酶比活为240u/mg。
实施例5bmgdhm19的表达与活力测定
将实施例2中获得的表达突变体m19的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28a-bmgdhm19接种至含50μg/ml卡那霉素的4mllb培养基中，37℃摇床振荡培养过夜后以1％的接种量将菌液接种到含有50mllb液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)的250ml三角摇瓶中37℃培养2-3h。然后将50ml的菌液接种到含有600mltb液体培养基的2l三角摇瓶中，于37℃培养2-3h后加入0.2mm的iptg诱导剂进行诱导，于16℃再培养20-24h。诱导结束后用高速冷冻离心机(4℃,12000×g,10min)收集细胞。收集的湿菌体以过量的生理盐水重悬，4℃，12000×g，离心10min，并以相同的操作重复洗涤2-3次。将收集的湿菌体称重后按照每1g湿菌体加入10ml的pbs(10mm,ph6.5)缓冲液的比例进行重悬。重悬后的菌液经过100目的筛子过滤后置于冰上等待破碎。用高压匀浆破碎仪进行破碎，将收集的破碎酶液于-80℃冰箱冷冻过夜。将冷冻成固体的酶液通过冷冻干燥，最后得到的冻干酶粉称重后于4℃冰箱保存备用，获得的粗酶粉测定其比活力为7.8u/mg。
实施例6bmgdhm8的表达与活力测定
将实施例2中获得的表达突变体m8的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28a-bmgdhm8接种至含50μg/ml卡那霉素的4mllb培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接入装有100mllb培养基(含50μg/ml卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的od600达到0.6时，加入终浓度为0.2mm的iptg作为诱导剂，16℃诱导24h。将培养液以8000×g离心10min，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞。将100ml培养液中获得的细胞悬浮于10ml的磷酸钠缓冲液(100mm,ph7.0)中，冰水浴中进行超声破碎，离心收集上清酶液。将上清酶液通过镍柱亲和层析得到纯蛋白，测定其纯酶比活为570u/mg。
实施例7bmgdhm1的表达与t5060测定
将实施例2中获得的表达突变体m1的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28a-bmgdhm1接种至含50μg/ml卡那霉素的4mllb培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接入装有100mllb培养基(含50μg/ml卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的od600达到0.6时，加入终浓度为0.2mm的iptg作为诱导剂，16℃诱导24h。将培养液以8000×g离心10min，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞。将100ml培养液中获得的细胞悬浮于10ml的磷酸钠缓冲液(100mm,ph7.0)中，冰水浴中进行超声破碎，离心收集上清粗酶液。将上清粗酶液通过采用镍柱亲和层析得到纯蛋白，按照本发明技术方案六测定其t5060为80.2℃。
实施例8bmgdhm19的化学稳定性考查
将实施例4中得到的bmgdhm19纯酶与10％(v/v)不同有机溶剂或化合物混合，纯酶浓度控制在0.5mg/ml。并于30℃、1000r/min的振荡反应器中振荡，每隔一段时间取样测定残余活力，按照本发明技术方案四中所述的葡萄糖脱氢酶突变体活力测定方法测定残余酶活力，以初始酶的活力为100％，以此来衡量所述bmgdhm19对所测化合物的耐受性。结果表明所述bmgdhm19对于二甲基亚砜(dmso)、甲醇、乙醇和n,n-二甲基甲酰胺(dmf)都有很强的耐受性，温育48h后依然能保持90％以上的残余活力。
实施例9bmgdhm19偶联酮还原酶sscr的反应验证
在反应体积为20ml的夹套反应器中，依次加入终浓度1m的苯乙酮，1.5m的葡萄糖，0.5mmnadp+，sscr粗酶粉(600u)，10u如实施例5获得的重组bmgdhm19粗酶粉，100mmpbsbuffer(ph6.5)，10％dmso(v/v)。30℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加naoh溶液(1.0m)，维持反应液ph6.5，间歇取样检测反应转化率，取样分析时取200μl反应液加入到1ml乙酸乙酯(含有0.5mm正十二烷作为内标)中振荡萃取15min后，12000×g离心5min，取上层有机相100μl加入到400μl乙酸乙酯(含有0.5mm正十二烷作为内标)中，充分混匀后加入少量无水硫酸钠干燥8-12h除去残余水分，然后取样进行气相色谱分析，采用色谱柱cp-chirasil-dexcb进行反应的样品分析，具体的分析方法：110℃保留15min，检测器和进样口温度均为280℃。内标正十二烷、(r)-苯乙醇和(s)-苯乙醇的出峰时间分别是：6.15min，11.4min和12.4min。最终反应24h，转化率大于90％，而在同样的操作步骤和反应条件下，母本bmgdh参与的反应转化率仅48％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华东理工大学；苏州百福安酶技术有限公司
<120>化学耐受性的葡萄糖脱氢酶突变体及其在辅酶再生中的应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>786
<212>dna
<213>巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)
<400>1
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<213>巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)
<400>2
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<210>3
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
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<210>4
<211>27
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
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