一种轴突型腓骨肌萎缩症果蝇模型的构建方法及应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种轴突型腓骨肌萎缩症（cmt2）的果蝇模型的构建方法及应用。

背景技术：

腓骨肌萎缩症（charcot-marie-tooth，cmt）早在1886年被发现，又称为遗传性运动感觉神经病（hmsn）。cmt是遗传性外周神经系统疾病，以外围神经系统缺陷为特征，包括感觉和运动神经元的缺陷，常表现为肌肉组织和身体各部位的触觉进行性丧失。临床主要特征是四肢远端进行性的肌无力和萎缩伴感觉障碍。cmt的发病率约为1/2500，是最常见的遗传性外周神经病之一。根据临床和电生理特征，cmt分为原发性脱髓鞘性神经病（cmt1，cmt3和cmt4）和原发性轴突神经病（cmt2），多数呈常染色体显性遗传，也可呈常染色体隐性或x-连锁遗传。

cmt病通常是由神经元中某些蛋白质缺陷的突变引起的。神经信号由轴突传导，髓鞘包裹在其周围。cmt中的大多数突变影响髓鞘，比如常见的17号染色体短臂上包含基因pmp22的大区域的重复。有些突变影响轴突，比如影响编码线粒体蛋白的基因mfn2。细胞在其细胞核和线粒体中含有单独的基因组。在神经细胞中，线粒体沿长轴突传播。在某些形式的cmt中，突变的mfn2导致线粒体形成大的簇或凝块，其不能沿着轴突向突触移动。这可以防止突触发挥作用。至今为止，发现至少50个基因突变引起cmt。但是，直接利用患病的人类个体进行研究存在很大的局限性，所以用模型生物研究这些基因的功能显得尤其重要。

人类疾病的动物模型早已应用于医疗，制药等领域，并日渐展现出不可被替代的优势。黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)是生物学研究中最重要的模式昆虫之一，它在遗传的染色体理论建立中起到非常重要的作用。同时，人类基因组中含有2~3万个基因，超过60%的人源基因在果蝇中能找到其同源基因，这使得果蝇能成为研究人类疾病的重要模式生物。至今为止，研究发现50多个引起cmt的基因突变超过35个在果蝇中存在其同源基因。na⁺-k⁺-atpase是一种蛋白离子泵，负责对质膜上钠钾离子转运活性的反应，维持细胞内钠钾离子平衡。人类atp1a1编码na⁺-k⁺-atpase的α1亚基，在几乎所有组织中广泛表达，最近我们和其它人的研究同时揭示atp1a1突变能引发cmt2。但是，至今还没有合适的模拟atp1a1突变动物模型可用于该疾病机制的研究和相关药物的筛选。果蝇中的人类atp1a1同源基因为atpα，氨基酸水平具有高度的同源性。因此，本发明公布了一对优化的基于crispr/cas9基因组编辑技术的打靶位点，同时公布了一组构建供体dna的引物和一组鉴定基因编辑成功的引物。基于本发明公布的引物序列及操作方法，能够高效构建atpα跨膜区特定氨基酸突变的果蝇，模拟人类轴突型腓骨肌萎缩症（cmt2）。同时，我们建立了利用脑部钟神经系统回路和生物钟相关行为、寿命、运动能力的变化评估病理表型的方法。通过本发明建立的模型和病理评估手段，具有操作简单，可重复性强的优点，该atpα突变的cmt2果蝇模型可用于研究该病的病理进程及机制，也可用于大规模筛选延缓或治疗该疾病的药物，具有很好的应用前景。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是建立atpα突变的cmt2果蝇模型，并提供一种轴突型腓骨肌萎缩症（cmt2）的果蝇模型的构建方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

atpα突变位点的选择，我们同时选择了人源atp1a1对应的三个突变进行模拟，包括p.a597t、p.p600t、p.d601f，对应果蝇atpα基因的位点为p.a576t、p.p579t、p.d580f。

根据欲突变位点所处的基因组序列信息，优化设计了一对crispr/cas9基因组编辑靶点，靶点1：5’-gcacgtgggggatcaatca-3’和靶点2：5’-gtcggcacttggcaacggcat-3’。两个靶点序列分别构建到pu6-bbsi-grna（addgene：45946）载体上并测序鉴定，最后用中量dna提取试剂盒提取靶点质粒。

同时设计了一组构建基因编辑所需供体dna的引物，5’同源臂引物atpα-5arm-f：5’-cacatcgaccatctgctccgata-3’；atpα-5arm-r：5’-tgacggcggtacgtgggggatcggtcatggacataaggccgacgaaac-3’和3’同源臂引物atpα-3arm-f：5’-ccccacgtaccgccgtcacgttcgccgttgccaagtgccgatc-3’；atpα-3arm-r：5’-ttacctgcttggacacatcggaac-3’。5’同源臂和3’同源臂分别用pcr进行扩增，扩增产物胶回收后进行搭桥pcr连接，5’同源臂和3’同源臂连接产物胶回收后克隆到平末端克隆载体并测序鉴定，最后用中量dna提取试剂盒提取供体dna质粒。

两个连接到pu6-bbsi-grna的靶点质粒和供体dna质粒混合注射到任何内源生殖细胞表达cas9蛋白的果蝇胚胎（如：y[1]m{w[+mc]=nos-cas9.p}zh-2aw[*]）。f0代果蝇单只与任何系统平衡致死基因果蝇杂交，如ywr122（ywr122=yw122；sp/cyo（y+）；tm2/tm6b），后代用一组引物进行pcr鉴定基因编辑成功与否，所述引物为atpα-ki-f：5’-cacgtaccgccgtcacgttc-3’和atpα-ki-r：5’-cctaatggaaggccaattttggtg-3’。

构建好的果蝇模型进行脑部钟神经系统回路免疫染色和生物钟相关行为观察、寿命观察、运动能力观察评估病理表型。免疫染色用mouseanti-pdf抗体（1：200，dshb），激光共聚焦显微镜进行扫描观察pdf在lnvs钟神经元的背部投射，可发现模型果蝇的pdf钟神经回路背部轴突投射出现异常。生物钟相关行为观察采用果蝇行为监测仪（dam，drosophilaactivitymonitor），数据分析采用基于matlab的软件包，可发现模型果蝇的昼夜活动节律出现紊乱。寿命观察和运动能力观察可发现模型果蝇的寿命缩短和运动能力下降。

构建好的果蝇模型可用于大规模筛选验证延缓或治疗该cmt2疾病的药物。一般是将待筛选的药物掺在果蝇食物中进行饲喂，利用前面描述的病理表型评估手段对药效进行评价，可分为不同药系列和同种药的不同浓度系列进行比较。

本发明所构建的轴突型腓骨肌萎缩症果蝇模型的一个特点是果蝇具有很严重的病理表型。特点之二是该果蝇模型具有多种易于观察的表型，喂药方式简便，药物筛选工作相对快捷，可以快速地进行大量的药物筛选。

附图说明

通过以下实例结合附图所作的详细描述，可以更清楚地理解本发明的目的、优点及特征。实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

图1atpα果蝇基因编辑设计方案。

图2atpα果蝇基因编辑靶点克隆流程图。

图3atpα果蝇模型分子鉴定图。

图4atpα果蝇钟神经回路背部轴突投射异常。

图5atpα果蝇昼夜运动节律紊乱。

图6atpα果蝇模型寿命缩短。

图7atpα果蝇模型运动能力下降。

图8atpα果蝇模型的应用结果。

图9atpα果蝇模型筛选药物技术流程图。

具体实施方式

实施例1

果蝇atpα模拟人源atp1a1氨基酸突变的基因编辑及结果鉴定

atpα突变位点的选择，如图1所示，我们同时选择了人源atp1a1对应的三个突变进行模拟，包括p.a597t、p.p600t、p.d601f，对应果蝇atpα基因的位点为p.a576t、p.p579t、p.d580f。

根据欲突变位点所处的基因组序列信息，如图1所示，设计了一对crispr/cas9基因组编辑靶点，靶点1：5’-gcacgtgggggatcaatca-3’和靶点2：5’-gtcggcacttggcaacggcat-3’。如图2所示，两个靶点序列分别构建到pu6-bbsi-grna（addgene：45946）载体上。每个靶点根据模板合成两条靶点引物（正向:5’–cttc(靶点序列)–3’和反向：3’–(靶点序列)caaa–5’），正向引物的5'-cttc-3'和反向引物的3'-caaa-5'突出端序列与bbsi内切酶消化pu6-bbsi-grna载体产生的突出端互补。靶点正反向引物进行退火：1μl正向引物（100μm）、1μl反向引物（100μm）、1μl10xt4ligationbuffer、7μl去离子水，95˚c反应5min，然后以-0.1˚c/sec的速度降到25˚c。

用bbsi内切酶消化pu6-bbsi-grna载体：1μgpu6-bbsi-grna载体用bbsi内切酶（neb公司）酶切，酶切方案参考内切酶说明书，酶切产物进行胶回收纯化。

连接靶点引物退火产物与酶切过的pu6-bbsi-grna载体：1μlbbsi酶切过的pu6-bbsi-grna(50ng)、1μl靶点引物退火产物、1μl10xt4连接缓冲液、1μlt4dna连接酶(neb)、6μl去离子水，25˚c连接1小时后转化大肠杆菌感受态细胞，用t7或t3引物进行插入鉴定，最后用中量dna提取试剂盒提取质粒。

如图1所示，同时设计了一组构建基因编辑所需供体dna的引物，具体为5’同源臂引物atpα-5arm-f：5’-cacatcgaccatctgctccgata-3’；atpα-5arm-r：5’-tgacggcggtacgtgggggatcggtcatggacataaggccgacgaaac-3’和3’同源臂引物atpα-3arm-f：5’-ccccacgtaccgccgtcacgttcgccgttgccaagtgccgatc-3’；atpα-3arm-r：5’-ttacctgcttggacacatcggaac-3’。5’同源臂扩增：50μl的反应体系中加入25μl2xprimerstarmaxdnapolymerase（takara）、引物（10μm）各1.5μl、果蝇基因组1μl（100ng），其余为去离子水；98℃预变性10s后进入循环：98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环，最后72℃延伸10min；3’同源臂扩增同5’同源臂扩增。

扩增产物胶回收后进行搭桥pcr连接：50μl的反应体系中加入25μl2xprimerstarmaxdnapolymerase（takara）、atpα-5arm-f和atpα-3arm-r引物各1.5μl、5’同源臂扩增（100ng）和3’同源臂（100ng），其余为去离子水；98℃预变性10s后进入循环：98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸10min，pcr产物胶回收后连接到平末端克隆载体并测序鉴定，最后用中量dna提取试剂盒提取供体dna质粒。

两个连接到pu6-bbsi-grna的靶点质粒（各50ng/μl）和供体dna质粒（各50ng/μl）混合注射内源生殖细胞表达cas9蛋白的果蝇胚胎（y[1]m{w[+mc]=nos-cas9.p}zh-2aw[*]）。f0代果蝇单只与系统平衡致死基因果蝇ywr122杂交（ywr122=yw122；sp/cyo（y+）；tm2/tm6b），后代用一组引物进行pcr鉴定基因编辑成功与否，引物为atpα-ki-f：5’-cacgtaccgccgtcacgttc-3’和atpα-ki-r：5’-cctaatggaaggccaattttggtg-3’，20μl的反应体系中加入10μl2xdreamtaqgreenpcrmastermix（thermofisher）、引物各1.0μl、果蝇基因组1μl（100ng），其余为去离子水；95℃预变性3min后进入循环：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环，最后72℃延伸10min。如图3所示，pcr产物电泳并条带大小约521bp，最后进行测序确定，测序结果如图1所示。

实施例2

果蝇atpα模拟人源atp1a1氨基酸突变的cmt2模型病理评估

构建好的果蝇模型进行脑部钟神经系统回路免疫染色和生物钟相关行为观察评估病理表型。免疫染色方案：收集3-5天的果蝇成虫，在4%多聚甲醛固定液中室温固定2小时。用解剖用的尖头镊子解剖，将处理好的果蝇脑部从虫体上摘下，放入150μlpbst（pbs+0.5%teitonx-100）进行室温洗涤，连续3次，每次15min。然后转移至含有150μlpnt（pbst+10%封闭用羊血清）室温孵育2h进行封闭。之后用pnt对一抗（mouseanti-pdf1：200，dshb）进行稀释，把封闭完的脑转移到一抗中，4℃过夜。用pbst室温洗涤3次，每次15min。最后用pnt稀释的荧光标记二抗进行4℃过夜孵育。pbst室温洗涤3次，每次15min后进行封片。最后用激光共聚焦显微镜进行扫描观察pdf在lnvs钟神经元的背部投射，如图4所示，可发现模型果蝇的pdf钟神经回路背部轴突投射出现异常。

生物钟相关行为观察方案：采用果蝇行为监测仪（dam，drosophilaactivitymonitor），购于美国trikinetics公司，单只果蝇被装进一端含有饲料的小玻璃管（内径5mm，长6.5cm），然后插进行为监测仪后连接电脑记录信号，果蝇每从管子中间穿过一次，红外光束信号就被阻断一次并且记录下来。雄性果蝇在25℃条件下进行3-4天的12h光照：12小时黑暗行为实验，紧跟着转到全黑暗条件下进行6-7天的监测。行为数据每1min采集一次，数据分析采用基于matlab的软件包，如图5所示，可发现模型果蝇的昼夜活动节律出现紊乱。

构建好的果蝇模型还可进行寿命及运动能力的观察。寿命观察方案：每隔两天换一次新鲜食物，直到统计所有果蝇死亡为止，如图6所示，可发现模型果蝇的寿命明显缩短。运动能力的观察方案：将10只果蝇放置于空管中，人为往台面震动管子2-3次后，观察记录攀爬速度大于6mm/s的果蝇数，如图7所示，可发现模型果蝇的运动能力明显下降。

实施例3果蝇atpα模拟人源atp1a1氨基酸突变的cmt2模型应用

利用构建好的果蝇模型，我们对神经性药物奥卡西平进行了评估。具体方案：首先，配制含有药物的食物，来自sigma公司的神经性药物奥卡西平（o3764）溶于含1‰二甲基亚砜的溶液中配制成120mm的母液，然后以终浓度为120μm的量掺入含有0.75%大豆粉（g/ml）、4.5%玉米粉（g/ml）、1.5%酵母（g/ml）、0.5%丙酸（v/v）、0.1%尼泊金甲酯（g/ml）、0.02%玉米糖浆（v/v）、1.25%蔗糖（g/ml）、1.25%葡萄糖（g/ml）、0.5%琼脂（g/ml）的食物中。对照食物为正常食物掺入和药物食物对应浓度的二甲基亚砜配制。接着，收集羽化后2-3天的对照和病理果蝇模型放入含有药物的食物或对照食物进行处理，利用前面描述的运动能力观察方案进行观察，如图8所示，我们发现所用神经性药物能在一定程度上改善病理果蝇模型运动能力。

所以，将待筛选的药物掺在果蝇食物中进行饲喂，利用相关的病理表型评估手段对药效进行评价，按照图9的大致步骤和技术的关键特征可进行药物筛选，最终得到有效药品的方案是可行的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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