一种采用RT-qPCR技术检测新型冠状病毒的方法与流程

本发明属于病毒分子诊断技术领域，具体涉及一种rt-qpcr技术检测新型冠状病毒的方法。

背景技术：

新型冠状病毒肺炎（coronavirusdisease2019，covid-19），简称“新冠肺炎”，世界卫生组织命名为“2019冠状病毒病”，是指2019新型冠状病毒（sars-cov-2）感染导致的肺炎，其被鉴定为一种含单股正链rna(ssrna)的beta型冠状病毒（betacoronavirus），其结构与严重急性呼吸综合征sars极其相似，新型冠状病毒基因与sarsr-cov和mersr-cov有70%和40%左右序列相似性，与蝙蝠病毒tg13的全基因组序列一致性高达96%。核酸的主要序列包括有e(envelopeproteingene)，m(membraneproteingene)，n(nucleocapsidproteingene)，s(spikeproteingene)，orf(openreadingframe)和rdrp(rna-dependentrnapolymerasegene)。该病毒可借助飞沫，气溶胶，粪口等方式在人群间进行传播感染。新冠病毒（sars-cov-2）可通过其表面s-蛋白与人的ace2受体互作的分子机制，来感染人的呼吸道上皮细胞。

目前针对冠状病毒的临床诊断方法有很多，胸部ct扫描，分子诊断技术，免疫层析法等。ct扫描技术方便但特异性不够，可辅助确诊；免疫层析法操作简单，但特异性和灵敏度很差，易造成结果假阴性和假阳性，不适用临床确诊；分子诊断技术相比较而言，灵敏度高，特异性强，适用于新型冠状病毒的临床确诊及诊断。rt-qpcr技术，结合了荧光定量技术qpcr(quantitativereal-timepcr,qpcr)的反转录pcr技术。在pcr过程中可添加与双链dna结合的非特异性染料或特异性探针，对目标dna扩增过程进行实时监测。常见的一个参数为ct值，也称阈值循环，指在pcr循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。每个模板的ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，ct值越小。荧光标记探针为一寡核苷酸，其两端分别标记报告荧光基团和猝灭荧光基团，探针完整时，报告基团发出的荧光信号可以被猝灭基团吸收，从而无荧光信号产生，探针与任意一条dna单链结合，当pcr开始扩增时，taq酶将探针酶切降解，从而使报告基团与猝灭基团分离，荧光信号被荧光检测系统检测到。每扩增1条dna链就有1个荧光分子形成，从而实现了荧光信号与pcr产物的等比例增加，进而达到定量检测的目的。在pcr反应体系中，加入过量sybr荧光染料，sybr荧光染料特异性地掺入dna双链后，发射荧光信号，而不掺入链中sybr染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步。rt-qpcr技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，而被广泛应用于基础研究、疾病研究、肿瘤的诊断等方面，成为分子生物学研究中的重要工具。

技术实现要素：

发明目的：本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒的rt-qpcr检测方法，本检测方法具有很高特异性及灵敏度。

优选的，本发明根据新型冠状毒（sars-cov-2）基因组序列高度保守基因orf1ab和n基因设计2对效率高、特异性强的引物，设计2个不同的探针可以进行双色荧光标记（orf1ab基因和n基因），增加了检测结果的准确性和特异性。

优选的，本发明选择了高效的逆转录酶和dna聚合酶，大大增加了逆转录的效率和扩增效率，将检测时间最快缩短至45分钟内，减少了检测时间从而增加了检测效率。

优选的，本发明优化了试剂组合，在保证酶活性的情况下，搭配了反应缓冲液，减少了检测人员的操作步骤，降低了检测中由于操作失误导致检测结果有误。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：包括以下步骤。

第一步，引物、人工合成rna和阳性对照质粒的合成：针对新冠病毒的保守区n基因和orf1ab基因设计两对引物和探针。体外合成新型冠状病毒目的基因的rna片段和dna质粒。

第二步，分别以所述待测样品提取rna核酸、人工合成rna、阳性对照质粒为模板，使用特异性引物和探针进行qpcr扩增反应，仪器通道同时选择fam通道和hex通道进行实验：

(1)qpcr扩增反应的20μl反应体系为：rna5μl(0.01pg-1μg)，引物探针(10μm)2μl，反应液13μl；

(2)qpcr扩增参数为：50℃保持5min，94℃保持2min；94℃变性5s，55℃退火10s，共40个循环；

(3)鉴定结果判断：如果检测结果fam通道和hex通道检测ct值均<37，则可判断为新型冠状病毒（sars-cov-2）核酸阳性；如果fam通道和hex通道检测ct值均无数值或ct值=40，且阳性对照品检测结果为阳性，此次结果判断为新型冠状病毒（sars-cov-2）核酸阴性；如果待测样本ct值在37-40之间，建议此样本应重新提取核酸后再次进行检测。如重复检测结果显示ct值<40，扩增曲线有明显起峰，则判断为新型冠状病毒（sars-cov-2）核酸阳性；否则为阴性。

第三步，反应体系灵敏性试验：对阳性sars-cov-2核酸进行荧光pcr检测，当浓度以10倍的稀释梯度逐渐从1/10降低至1/10000时，其rfu结果达到阈值时的循环数（ct）均小于35。同时在阳性患者rna浓度初始值为9.5ng/ul的基础条件下，浓度稀释比例达到1000000倍，仍有循环数(ct)低于37的结果呈现，新型冠状得病毒的最低检测值可达到1/1000000，该方法具有良好的敏感性。

进一步地，所述第一步中特异性引物及探针序列如图5。

进一步地，所述第一步中合成重组阳性对照质粒dna序列为，

orf1ab基因：

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n基因：

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本发明有益结果是：检测sars-cov-2病毒的所用的rna样本的最小浓度可调至1/1000000（初始值设为9-10ng/ul）。用于检测sars-cov-2临床阳性样本适用性所测得循环值(cyclethreshold,ct)均低于37，灵敏性测试结果也表明该方法的敏感性好。本公司采用taqman探针的逆转录定量聚合酶链反应(rt-qpcr)技术比sybrgreen的特异性好，有特异性探针，结果特性强；采用一步法rt-qpcr，rna逆转录和pcr反应在全封闭状态下的同一管内完成，避免了对环境的污染和由此导致的假阳性。因此该检测方法适用于任何科研实验室高校以及医疗卫生单位等。综上所述，本发明提供的方法特异性强、灵敏度高、重复性好，操作简便，并且检测速度快。

附图说明

图1为荧光定量后的人工合成的新型冠状病毒(sars-cov-2)rna片段（130ng/ul）在7个不同稀释浓度下进行荧光qpcr检测结果；可以看出在进行梯度稀释后，曲线成等比例向后移动。

图2为阳性患者核酸rna定量浓度为9.5ng/μl，稀释比例如下：

a=1：1000，

b=1：10000，

c=1：100000，

d=1：1000000

qpcr结果显示，在梯度稀释至1/1000000时ct值仍然小于37。

图3为利用本发明的成品试剂盒检测两个阳性患者样本qpcr结果。每个患者的样本做2个实验重复，两个实验同时进行，同时做了阳性对照、阴性对照、患者1和患者2，可以看出每组实验的重复性很好，阳性对照很强，阴性对照没有读值。

图4为新冠病毒全基因组基因图谱。

图5为本发明使用的引物和探针的核苷酸序列、扩增片段长度及其所在病毒基因组的位置。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步描述。

一种快速检测新型冠状病毒的rt-qpcr方法，包括如下步骤。

（一）仪器与试剂

荧光光定量pcr仪（bio-radcfx96touch），

无核酸酶的并且pcr管盖透光性好的pcr管，

0-2μl移液枪（eppendorf），

1-10μl移液枪（eppendorf），

2-20μl移液枪（eppendorf），

10-100μl移液枪（eppendorf），

20-200μl移液枪（eppendorf），

200-1000μl移液枪（eppendorf），

病毒rna核酸提取试剂盒（qiagen），

本发明的核酸检测试剂盒。

（二）准备样本和核酸提取：对于临床样本，我们将采集的鼻、咽拭子等样本经病毒rna提取试剂盒提取纯化获得sars-cov-2病毒核酸rna（该步骤至少需要在p3实验室进行，减少污染源传播），并在-40℃~-80℃条件下保存备用。

（三）引物和标准品质粒的合成：针对新冠病毒的保守区n基因和orf1ab基因设计两对引物和探针。体外合成新冠dna序列合成标准品重组质粒。具体引物和探针信息如图5。

（四）以提取样本rna和阳性质粒为模板进行rt-qpcr反应。

1、按照所述体系进行加样，rt-qpcr扩增反应的20μl反应体系为：rna5μl(0.01pg-1μg)，引物探针(10μm)2μl，反应液13μl。先加阴性对照，再加样本和阳性对照。盖紧管盖，1800rpm离心5sec。加样结束后，立即将剩余试剂放入-20℃冰箱保存。

2、将各反应管按顺序放入pcr仪,按下列条件进行反应，仪器通道同时选择fam通道和hex通道进行实验。反应体积为20ul。qpcr扩增参数为：50℃保持5min，94℃保持2min；94℃变性5s，55℃退火10s，共40个循环。

3、鉴定结果判断：如果检测结果fam通道和hex通道检测ct值均<37，则可判断为新型冠状病毒（sars-cov-2）核酸阳性；如果fam通道和hex通道检测ct值均无数值或ct值＞40，且阳性对照品检测结果为阳性，此次结果判断为新型冠状病毒（sars-cov-2）核酸阴性；如果待测样本ct值在37-40之间，建议此样本应重新提取核酸后再次进行检测。如重复检测结果显示ct值<40，扩增曲线有明显起峰，则判断为新型冠状病毒（sars-cov-2）核酸阳性；否则为阴性。

(五）反应体系灵敏性试验：对阳性sars-cov-2人工合成的核酸进行荧光pcr检测，当浓度以10倍的稀释梯度逐渐从1/10降低至1/1000000时，其rfu结果达到阈值时的循环数（ct）均小于35。同时在阳性对照初始值设为9-10ng/ul的基础条件下，浓度稀释比例达到1000000倍，仍有循环数(ct)低于37的结果呈现，阳性病毒的最低检测值可达到1/1000000，该方法具有良好的敏感性。

本发明用于新型冠状病毒检测的rt-qpcr技术，采用了高灵敏稳定性好rna反转录及扩增反应液，所有反应集于一管，最大程度降低样本处理错误，缩短设置时间，可灵敏稳定地扩增rna靶点；特异性taqman探针，实现定量荧光信号的标准化，可快速简单地设置反应，1小时内获得检测结果。该技术特点节约时间，提高实验室的运作效率；同时方法灵敏度高，经济节约，性价比高。

序列表

<110>拜澳泰克（沈阳）生物医学集团有限公司

<120>一种采用rt-qpcr技术检测新型冠状病毒的方法

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<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>700

<212>dna

<213>未知(人工序列)

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