一种嗜热菌BV-2及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种嗜热菌bv-2及其应用。

背景技术：

我国是食用菌生产大国，食用菌年产量约为4000万吨，占世界食用菌总产量的70％以上，是我国农业的重要支柱产业之一。食用菌中蘑菇的栽培基质出菇率约为5：1，也就是每年产4000万吨的食用菌其基质用量约为2亿吨。目前无论使用食用菌的生料栽培基质还是熟料栽培基质，食用菌基质都需要进行高温灭菌处理后再接种食用菌菌种。这个过程需要消耗大量的热量，不仅增加了食用菌的生产成本，也增加了环境压力。

在畜禽粪便等有机物中添加微生物菌剂能够使堆体升温，实现有机物料的腐熟，并抑制其中的病原微生物，实现有机物料的资源化和无害化。但是若将微生物发酵的方法应用于食用菌基质的腐熟发酵，还达不到可以免去加热高温灭菌的步骤，无法实现腐熟发酵后的基质直接进行食用菌接种。

技术实现要素：

针对现有微生物发酵方法中公开的微生物无法实现通过腐熟发酵可使食用菌基质直接进行食用菌的接种，无法避免高温灭菌处理步骤，能源消耗大以及处理成本高的问题，本发明提供一种嗜热菌bv-2及其应用。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种嗜热菌bv-2，菌株保藏号为cgmccno.18652，该菌株属于贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)，于2019年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

相对于现有技术，本发明提供的嗜热菌bv-2具有高温适应性强、适宜生长的温度范围广(适宜在25-75℃的范围内生长，在85℃下依然可以生长)且能够分泌大量高活性纤维素酶的特性，同时具有杀死并抑制其它病原菌的能力。将嗜热菌bv-2接种到食用菌基质中在24h之内即可使食用菌基质升温至50℃以上，其在食用菌基质中的腐熟温度最高温度达到85℃，并在5d内即可降至常温，具有升温速率快、腐熟发酵时间短、成本低的特点。且经本申请嗜热菌bv-2腐熟发酵处理后的食用菌基质染菌率低，可以直接进行食用菌接种，可以完全免去食用菌基质的高温蒸汽灭菌处理工艺过程。另一方面，经本申请嗜热菌bv-2腐熟发酵处理的食用菌基质营养成分高，能够显著增加食用菌的出菌率，具有极高的经济效益。

本发明还提供所述的嗜热菌bv-2在食用菌基质的腐熟发酵中的应用。

食用菌基质接种嗜热菌bv-2后，最高温度可达85℃，达到高温期的时间为发酵后第2d，超过50℃的高温期为4d，超过65℃的高温期为2d。可明显促进食用菌基质升温，提高物料的温度、缩短腐熟时间、使病原菌去除更彻底。

本发明还提供利用所述嗜热菌bv-2制备的腐熟菌剂，包括菌体吸附基质和嗜热菌bv-2菌粉。

优选的，所述菌体吸附基质为轻质碳酸钙。

轻质碳酸钙作为菌体吸附基质可使嗜热菌bv-2活菌的冷冻保存时间达到一年以上。

优选的，所述腐熟菌剂中所述嗜热菌bv-2的活菌数≥2×10⁸cfu/g。

本发明还提供所述腐熟菌剂的制备方法，包括如下工艺步骤：

a、活化菌种；

b、种子培养；

c、二级种子发酵；

d、扩大培养；

e、添加吸附基质并进行干燥；所述干燥方法为喷雾干燥。

相对于现有技术，本发明提供的腐熟菌剂的制备方法，得到的腐熟菌剂可快速适应不同温度环境并在食用菌基质中快速生长，加快食用菌基质的腐熟速度。

优选的，步骤a中，所述活化菌种的方法为：将冷冻保存的嗜热菌bv-2菌株划线接种于lb平板上，40-50℃培养20-30h。

优选的，步骤b中，所述种子培养的方法为：将步骤a中活化的嗜热菌bv-2菌苔接种于装有lb液体培养基的三角瓶中，40-50℃、150-250r/min摇床培养20-30h。

优选的，步骤c中，所述二级种子发酵的方法为：将步骤b得到的种子培养液接种于装有lb液体培养基的种子罐中，40-50℃、150-250r/min发酵培养1-2d；所述种子培养液的接种体积占lb液体培养基体积的5-10％。

优选的，步骤d中，所述扩大培养的方法为：将步骤c中得到的嗜热菌bv-2二级种子发酵液接种于装有lb液体培养基的发酵罐中，45-50℃、150-200r/min发酵2-3d；所述二级种子发酵液的接种体积占lb液体培养基体积的2-5％。

附图说明

图1是本发明实施例中嗜热菌bv-2菌株的菌落形态图；

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

1.1样品与培养基

1.1.1样品

从中国台湾文山温泉区采集温泉样品，温泉温度72℃。

1.1.2培养基

zobell2216e固体培养基、刚果红羧甲基纤维素培养基、lb固体培养基和lb液体培养基。

1.2嗜热菌的筛选

从中国台湾文山温泉区采集温泉样品，温泉温度72℃。将样品逐渐稀释，分别取原始温泉水样、稀释10倍和稀释100倍的样品100μl涂布于zobell2216e固体培养基上，将平板置于密封袋中密封后置于60℃的鼓风干燥箱中培养。挑取生长迅速的菌落在lb平板上进行5次划线分离纯化获得嗜热菌纯培养菌株。将菌株进行5次平板传代后，每个菌株挑取5个单菌落在60℃培养，确定菌株高温生长特性的遗传稳定性，获得稳定遗传的嗜热菌株。

1.3降解纤维素嗜热菌的筛选

将筛选获得的嗜热菌株在lb培养基上、60℃培养箱中活化培养24h，之后分别接种于刚果红羧甲基纤维素培养基平板上，测量60℃恒温培养3天后嗜热菌的菌落直径和水解圈直径。测量发现bv-2菌株在刚果红羧甲基纤维素平板上培养3天时菌落直径为0.42cm、水解圈直径1.04cm，d/d值为2.47，具有高温分泌纤维素酶的能力。

1.4嗜热菌bv-2菌株的鉴定

将筛选得到的bv-2菌株在lb固体培养基上50℃培养2天。菌落呈圆形、表面光滑，质地粘稠，菌落直径1.45mm；细胞短杆状或梭状、稍弯、单个、成对或成短链状，g+，如图1所示；微碱，化能异养，好氧；接触酶阳性；高丝氨酸营养缺陷型菌株；产l-赖氨酸。

以bv-2菌株的dna为模版，以16srrna通用引物的上游引物27f：5’-agagtttgatcctggctc-3’和下游引物1492r:5’-ggttaccttgttacgactt-3’进行pcr，pcr反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸8min。电泳检测扩增产物纯度和大小，将扩增长度正确的pcr产物送上海生工进行测序，并在ncbi进行blast，根据blast结果，该菌株与bacillusvelezensis菌株的16srrna基因序列的相似性高达99％。

综合菌落形态及生理特征和16srrna序列，可以确定本发明菌株bv-2属于bacillusvelezensis，命名为b.velezensisbv-2，并于2019年10月10日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.18652。

1.5利用上述嗜热菌bv-2制备腐熟菌剂的方法

具体方法为：

(1)菌种活化：将-80℃保存的bv-2菌株划线接种于lb平板上，50℃培养24h。

(2)种子培养：用接种环刮去lb平板上的bv-2菌株的菌苔并接种于装有lb液体培养基的三角瓶中，50℃、200rpm/min摇床培养24h。

(3)二级种子发酵：将上述种子培养液按5％的接种量接种于装有10llb液体培养基的种子罐中，50℃、200rpm/min发酵培养24h。

(4)扩大培养：得到的嗜热菌bv-2二级种子发酵液按3％的接种量接种于装有lb液体培养基的发酵罐中，50℃、200rpm/min发酵2d。

(5)喷雾干燥：向扩大培养的发酵液中加入轻质碳酸钙，再对发酵液进行喷雾干燥，获得含有嗜热菌bv-2的腐熟菌剂。

(6)产品质量检测：参照农用微生物菌剂标准(gb20287-2006)的方法进行嗜热菌bv-2腐熟菌剂的检测，检测结果表明，上述菌剂有效活菌数≥2×10⁸cfu/g，符合农用微生物菌剂标准(gb20287-2006)的规定。

1.6嗜热菌bv-2腐熟菌剂在平菇栽培基质的腐熟发酵中的应用

将平菇栽培基质按平菇生长要求进行配制，并将物料含水量调整至60％，按0.5％接种量添加上述制备的嗜热菌bv-2腐熟菌剂，进行堆垛发酵，堆垛底部宽度1.5米，高度1.2米，顶部呈龟背型。以不接种腐熟菌剂的平菇栽培基质为对照。每天测量堆垛温度，接种腐熟菌剂后24h后堆体温度升高至50℃，最高温度达到85℃，之后开始降温。堆肥接种嗜热菌bv-2腐熟菌剂后，最高温度可达85℃，达到高温期的时间为发酵后第2d，超过50℃的高温期为4d，超过65℃的高温期为2d。而不接种菌剂的对照组的发酵的最高温度64℃，超过50℃的高温期为3天。说明bv-2腐熟菌剂可明显促进平菇栽培基质发酵升温，并提高物料的温度、加快物料的熟化和灭菌。

1.7经嗜热菌bv-2腐熟菌剂发酵处理的平菇栽培基质的出菇率和染菌率检测

将经过嗜热菌bv-2腐熟菌剂处理、不加菌剂处理(对照)及高温蒸汽灭菌处理的三种平菇栽培基质进行装袋后接种平菇，接种方法和接种量相同，测定了不同处理后的基质物料的出菇率和染菌率，结果见表1。其中染菌率是染菌平菇栽培基质袋数占试验总袋数的百分比，出菇率是平菇栽培基质上所生长的平菇的重量占平菇栽培基质干料的重量百分比。

表1不同处理方法的基质的染菌率和出菇率

其中经过嗜热菌bv-2腐熟菌剂处理的基质的染菌率为2.5％，低于高温灭菌处理(4.2％)和对照(10.4％)。说明嗜热菌bv-2腐熟菌剂的处理能够有效杀死和抑制平菇栽培基质中的杂菌，降低平菇的染菌率。

从出菇情况进行统计，其中嗜热菌bv-2腐熟菌剂处理的基质的出菇率为118.2％，高于高温灭菌(108.6％)和空白对照(94.8％)的出菇率。说明嗜热菌bv-2能够有效改善平菇栽培基质的出菇情况。

对比例

用公开的专利cn109609412a，发明名称为“一种嗜热菌bacillussmithiiths1及其应用”中的嗜热菌bacillussmithiiths1制备的接种剂，代替本发明实施例中的嗜热菌bv-2腐熟菌剂进行平菇栽培基质的发酵腐熟，嗜热菌bacillussmithiiths1接种剂接种到平菇栽培基质中的用量接种方法与本发明实施例中的相同。

检测经嗜热菌bacillussmithiiths1接种剂发酵腐熟处理的平菇栽培基质的出菇率和染菌率，检测结果如表2所示。

表2平菇栽培基质的染菌率和出菇率

其中嗜热菌bacillussmithiiths1接种剂处理的基质的染菌率为6.7％，高于本发明实施例中嗜热菌bv-2腐熟菌剂处理的基质的染菌率。说明本发明的嗜热菌bv-2腐熟菌剂能够有效杀死和抑制平菇栽培基质中的杂菌，降低平菇的染菌率。

从出菇情况进行统计，其中嗜热菌bacillussmithiiths1接种剂处理的基质的出菇率为103.3％，高于空白对照(94.8％)的出菇率。但其处理的基质染菌率较高，且低于本申请中嗜热菌bv-2腐熟菌剂处理的基质的出菇率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>沧州旺发生物技术研究所有限公司

<120>一种嗜热菌bv-2及其应用

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