基于共享性引物探针检测基因多态性的试剂盒、方法及应用与流程

本分案申请是基于申请号为201911055308.5，申请日为2019年10月31日，发明名称为“基于共享性引物探针检测基因多态性的试剂盒、方法及应用”的中国专利申请的分案申请。本申请涉及基因检测领域，具体涉及一种基因多态性的pcr检测。技术背景目前用于检测基因多态性的方法主要有以下几种：测序分型法、高分辨率熔解曲线分型法、基因芯片分型法、taqman探针分型法和mgb探针分型法等。测序分型法是该领域检测的金标准，但受限于操作繁琐性和设备特殊性，没有广泛推广；而其余方法都是基于pcr扩增技术衍生而来，使用相对广泛。其中，测序分型法检测过程包含pcr扩增、测序，操作繁琐，检测时间一般长达4～5个小时，而且操作过程中需要打开pcr反应管，容易带来pcr产物的污染；高分辨率熔解曲线分型法的特征是利用多态性位点的碱基不同而带来的tm值差别，通过识别不同的tm值而进行检测，往往野生型和突变型位点的tm值差别不到1℃，所以需要精准识别温度的设备，这类设备比较少，而且大多属于进口，价格昂贵；基因芯片分型法检测过程包含pcr扩增、探针杂交，操作繁琐，检测时间一般长达4～5个小时，而且操作过程中需要打开pcr反应管，容易带来pcr产物的污染；taqman探针分型法是利用arms引物识别多态性位点，该方法学检测一个多态性位点需要2个反应孔，通量相对较低；mgb探针分型利用mgb标记的探针识别多态性位点，mgb探针设计难度大，价格高，且寻找一条合适的mgb探针需要筛选很多条，成本较高。cyp2c19酶的编码基因为cyp2c19基因，位于人类10号染色体上，是细胞色素酶(cyp450酶)第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢酶，在肝脏中有很多表达。cyp2c19的基因多态性与药物的个体差异密切相关，通过检测患者cyp2c19基因型，可判断患者代谢速率类型，合理调整用药剂量，是提高相关疾病治愈率，减少毒副作用的有效途径，尤其像氯吡格雷、伏立康唑、抗抑郁类药物、抗癫痫药物等。现有技术中对人cyp2c19基因多态性检测手段主要是上述5种方法。可见上述方法仍存在诸多缺陷，有必要寻求一种新的检测方法，使检测效果更特异、灵敏度更高、通量更高、结果更客观等，同时还保证设计简单、成本低廉、操作简便、检测时间短等。基于此，特提出本申请。技术实现要素：本申请的第一目的在于提供一种基因多态性检测的共享性arms引物探针制备方法；本申请的第二目的在于提供一种基于共享性引物探针检测基因多态性的方法；本申请的第三目的在于提供一种基于共享性引物探针检测基因多态性引物体系、试剂盒及其应用。为实现上述目的，本申请采用的技术方案如下：本申请提供一种用于基因多态性检测的探针性arms引物制备方法，所述方法包括针对野生型位点和突变型位点同向设计野生型arms引物和突变型arms引物，所述野生型arms引物和突变型arms引物5′端最后一个碱基通过不同报告基团的标记，引物和探针共享同一条核苷酸序列，制备具有探针性质的探针性arms引物(见图1-3)；优选的，所述报告基因选自fam、rox、tet、vic、joe、hex、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、tamra、texasred、lcred640或lcred705；在一些实施方式中，进一步包括筛选高扩增效率引物作为制备探针性arms引物；在一些实施方式中，进一步包括淬灭探针和下游引物的设计；在一些实施方式中，所述淬灭探针是针对野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物设计互补核苷酸序列，并对互补核苷酸序列的3′端进行非荧光淬灭基团的标记；在一些实施方式中，所述淬灭探针的碱基数比野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物碱基数少3-9个；优选的，少4-7个；更优选的少5-6个；在一些实施方式中，进一步包括野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物错配基因的引入；在一些实施方式中，所述错配基因靠近野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物的3′端；在一些实施方式中，所述野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物在靠近3′端第2-4个碱基上引入错配碱基，相同序列位置引入的错配碱基不同，不同序列位置引入的错配碱基可以相同，也可以不同。例如：野生型探针性arms引物在靠近3′端第2个碱基引入错配碱基a，则突变型探针性arms引物在靠近3′端第2个碱基可引入除a之外的错配碱基t、g或c，在靠近3′端第3个或第4个碱基可引入含a的错配碱基a、t、g或c；在一些实施方式中，所述野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物的tm值为65～70℃；在一些实施方式中，所述野生型位点检测和突变型位点检测在同一个反应体系中进行pcr扩增；在一些实施方式中，所述基因多态性检测是针对cyp2c19多态性检测；优选的，针对cyp2c19*2和cyp2c19*3；更优选的，还针对cyp2c19*17；在一些实施方式中，所述cyp2c19*2的野生型探针性arms引物5′端标记fam荧光基团，cyp2c19*2的突变型探针性arms引物5′端标记tet荧光基团，cyp2c19*2的淬灭探针3′端标记bhq2淬灭基团；所述cyp2c19*3野生型探针性arms引物5′端标记rox荧光基团，cyp2c19*3的突变型探针性arms引物5′端标记cy5荧光基团，cyp2c19*3的淬灭探针3′端标记bhq2淬灭基团；在一些实施方式中，所述cyp2c19*2的野生型探针性arms引物、突变型探针性arms引物、淬灭探针和下游引物序列分别如seqidno.1-4所示；所述cyp2c19*3的野生型探针性arms引物、突变型探针性arms引物、淬灭探针和下游引物序列分别如seqidno.5-8所示；在一些实施方式中，所述cyp2c19*17野生型探针性arms引物5′端标记fam荧光基团，cyp2c19*17的突变型探针性arms引物5′端标记tet荧光基团，cyp2c19*17的淬灭探针3′端标记bhq2淬灭基团；在一些实施方式中，所述cyp2c19*17的野生型探针性arms引物、突变型探针性arms引物、淬灭探针和下游引物序列分别如seqidno.9-12所示；本申请提供一种基于共享性引物探针检测基因多态性的检测方法，所述检测方法包括用于基因多态性检测的探针性arms引物制备的步骤；所述步骤包括针对野生型位点和突变型位点同向设计野生型arms引物和突变型arms引物，所述野生型arms引物和突变型arms引物5′端最后一个碱基通过不同报告基团的标记，引物和探针共享同一条核苷酸序列，制备具有探针性质的探针性arms引物；优选的，所述报告基因选自fam、rox、tet、、vic、joe、hex、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、tamra、texasred、lcred640或lcred705；在一些实施方式中，进一步包括筛选高扩增效率引物作为制备探针性arms引物；在一些实施方式中，进一步包括淬灭探针和下游引物的设计；在一些实施方式中，所述淬灭探针是针对野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物设计互补核苷酸序列，并对互补核苷酸序列的3′端进行非荧光淬灭基团的标记；在一些实施方式中，所述淬灭探针的碱基数比野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物碱基数少3-9个；优选的，少4-7个；更优选的少5-6个。在一些实施方式中，进一步包括野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物错配碱基的引入；在一些实施方式中，所述错配碱基在靠近野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物的3′端；在一些实施方式中，所述野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物相同序列位置引入的错配碱基不同，不同序列位置引入的错配碱基可以相同，也可以不同；在一些实施方式中，所述野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物的tm值为65～70℃。在一些实施方式中，所述野生型位点检测和突变型位点检测在同一个反应体系中进行pcr扩增；在一些实施方式中，所述基因多态性检测是针对cyp2c19多态性检测；优选的，针对cyp2c19*2和cyp2c19*3；更优选的，还针对cyp2c19*17；在一些实施方式中，所述cyp2c19*2的野生型探针性arms引物5′端标记fam荧光基团，cyp2c19*2的突变型探针性arms引物5′端标记tet荧光基团，cyp2c19*2的淬灭探针3′端标记bhq2淬灭基团；所述cyp2c19*3野生型探针性arms引物5′端标记rox荧光基团，cyp2c19*3的突变型探针性arms引物5′端标记cy5荧光基团，cyp2c19*3的淬灭探针3′端标记bhq2淬灭基团；在一些实施方式中，所述cyp2c19*2的野生型探针性arms引物、突变型探针性arms引物、淬灭探针和下游引物序列分别如seqidno.1-4所示；所述cyp2c19*3的野生型探针性arms引物、突变型探针性arms引物、淬灭探针和下游引物序列分别如seqidno.5-8所示；在一些实施方式中，所述cyp2c19*17野生型探针性arms引物5′端标记fam荧光基团，cyp2c19*17的突变型探针性arms引物5′端标记tet荧光基团，cyp2c19*17的淬灭探针3′端标记bhq2淬灭基团；在一些实施方式中，所述cyp2c19*17的野生型探针性arms引物、突变型探针性arms引物、淬灭探针和下游引物序列分别如seqidno.9-12所示；在一些实施方式中，所述基于共享性引物探针检测基因多态性的检测方法还包括样本处理步骤、检测体系配制步骤、反应参数设置步骤和结果判读及分析步骤；在一些实施方式中，检测体系配制步骤中，检测时用于扩增多态性位点的pcr混合液中，所述探针性arms引物和下游引物的浓度介于400～600nm，优选500nm；所述淬灭探针的浓度介于1.2～1.8μm，优选1.5μm；在一些实施方式中，检测体系配制步骤中，检测时阴性质控品由tris-hcl缓冲液组成；在一些实施方式中，检测体系配制步骤中，检测时阳性质控品由cyp2c19*2野生型质粒，cyp2c19*2突变型质粒，cyp2c19*3野生型质粒，cyp2c19*3突变型质粒，cyp2c19*17野生型质粒，cyp2c19*17突变型质粒组成；优选的，所述的质粒为人工克隆环状质粒，用tris-hcl(ph8.0)进行稀释至2000拷贝；所述的试剂盒中taq酶为热启动酶；在一些实施方式中，所述反应参数设置步骤中，反应参数设置为95℃3分钟预变性，1个循环；95℃15秒变性，60℃1分钟，收集荧光信号，40个循环；荧光信号采集通路设置fam、tet、rox、cy5；在一些实施方式中，所述结果判读及分析步骤为①阳性质控品fam、tet、rox、cy5荧光有扩增曲线，阴性质控品无扩增曲线，检测数据有效；②用扩增cyp2c19*2、cyp2c19*3的pcr混合液中fam和tet荧光信号判断cyp2c19*2的多态性，fam有扩增曲线而tet无扩增曲线，判断结果为cyp2c19*2纯合野生型；fam无扩增曲线而tet有扩增曲线，判断结果为cyp2c19*2纯合突变型；fam、tet均有扩增曲线，判断结果为cyp2c19*2杂合型；③用扩增cyp2c19*2、cyp2c19*3的pcr混合液中rox和cy5荧光信号判断cyp2c19*3的多态性，rox有扩增曲线而cy5无扩增曲线，判断结果为cyp2c19*3纯合野生型；rox无扩增曲线而cy5有扩增曲线，判断结果为cyp2c19*3纯合突变型；rox、cy5均有扩增曲线，判断结果为cyp2c19*3杂合型；④用扩增cyp2c19*17的pcr混合液中fam和tet荧光信号判断cyp2c19*17的多态性，fam有扩增曲线而tet无扩增曲线，判断结果为cyp2c19*17纯合野生型；fam无扩增曲线而tet有扩增曲线，判断结果为cyp2c19*17纯合突变型；fam、tet均有扩增曲线，判断结果为cyp2c19*17杂合型。本申请提供一种检测cyp2c19基因多态性的引物组(或引物体系)，所述引物组(或引物体系)是由基因多态性检测的共享性arms引物探针制备方法制备；所述步骤包括针对野生型位点和突变型位点同向设计野生型arms引物和突变型arms引物，所述野生型arms引物和突变型arms引物5′端最后一个碱基通过不同报告基团的标记，引物和探针共享同一条核苷酸序列，制备具有探针性质的探针性arms引物；优选的，所述报告基因选自fam、rox、tet、vic、joe、hex、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、tamra、texasred、lcred640或lcred705；在一些实施方式中，进一步包括筛选高扩增效率引物作为制备探针性arms引物；在一些实施方式中，进一步包括淬灭探针和下游引物的设计；在一些实施方式中，所述淬灭探针是针对野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物设计互补核苷酸序列，并对互补核苷酸序列的3′端进行非荧光淬灭基团的标记；在一些实施方式中，所述淬灭探针的碱基数比野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物碱基数少3-9个；优选的，少4-7个；更优选的少5-6个；在一些实施方式中，进一步包括野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物错配碱基的引入；在一些实施方式中，所述错配碱基靠近野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物的3′端；在一些实施方式中，所述野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物相同序列位置引入的错配碱基不同，不同序列位置引入的错配碱基可以相同，也可以不同；在一些实施方式中，所述野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物的tm值为65～70℃；在一些实施方式中，所述野生型位点检测和突变型位点检测在同一个反应体系中进行pcr扩增；在一些实施方式中，所述基因多态性检测是针对cyp2c19多态性检测；优选的，针对cyp2c19*2和cyp2c19*3；更优选的，还针对cyp2c19*17；在一些实施方式中，所述cyp2c19*2的野生型探针性arms引物5′端标记fam荧光基团，cyp2c19*2的突变型探针性arms引物5′端标记tet荧光基团，cyp2c19*2的淬灭探针3′端标记bhq2淬灭基团；所述cyp2c19*3野生型探针性arms引物5′端标记rox荧光基团，cyp2c19*3的突变型探针性arms引物5′端标记cy5荧光基团，cyp2c19*3的淬灭探针3′端标记bhq2淬灭基团；在一些实施方式中，所述cyp2c19*2的野生型探针性arms引物、突变型探针性arms引物、淬灭探针和下游引物序列分别如seqidno.1-4所示；所述cyp2c19*3的野生型探针性arms引物、突变型探针性arms引物、淬灭探针和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.5-8所示；具体如下：cyp2c19*2野生型探针性arms引物：5′-fam-ttttaagtaatttgttatgggttgcc-3′seqidno.1cyp2c19*2突变型探针性arms引物：5′-tet-ttttaagtaatttgttatgggtgcct-3′seqidno.2cyp2c19*2淬灭探针：5′-cccataacaaattacttaaaa-bhq2-3′seqidno.3cyp2c19*2下游引物：5′-aattttcccactatcattgattatttcc-3′seqidno.4cyp2c19*3野生型探针性arms引物：5′-rox-aaaaaacttggccttacctgaatc-3′seqidno.5cyp2c19*3突变型探针性arms引物：5′-cy5-aaaaaacttggccttacctgtatt-3′seqidno.6cyp2c19*3淬灭探针：5′-aggtaaggccaagtttttt-bhq2-3′seqidno.7cyp2c19*3下游引物：5′-gaaaacatcaggattgtaagcacc-3′seqidno.8在一些实施方式中，所述cyp2c19*17野生型探针性arms引物5′端标记fam荧光基团，cyp2c19*17的突变型探针性arms引物5′端标记tet荧光基团，cyp2c19*17的淬灭探针3′端标记bhq2淬灭基团；在一些实施方式中，所述cyp2c19*17的野生型探针性arms引物、突变型探针性arms引物、淬灭探针和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.9-12所示；具体如下：cyp2c19*17野生型探针性arms引物：5′-fam-aatttgtgtcttctgttctcagagc-3′seqidno.9cyp2c19*17突变型探针性arms引物：5′-tet-aatttgtgtcttctgttctcaaggt-3′seqidno.10cyp2c19*17淬灭探针：5′-gagaacagaagacacaaatt-bhq2-3′seqidno.11cyp2c19*17下游引物：5′-gcgcattatctcttacatcagag-3′seqidno.12。一种检测cyp2c19基因多态性的引物组(或引物体系)，所述引物序列如1-12所示；在一些实施方式中，所述引物的荧光标记分别为：所述cyp2c19*2的野生型探针性arms引物5′端标记fam荧光基团，cyp2c19*2的突变型探针性arms引物5′端标记tet荧光基团，cyp2c19*2的淬灭探针3′端标记bhq2淬灭基团；所述cyp2c19*3野生型探针性arms引物5′端标记rox荧光基团，cyp2c19*3的突变型探针性arms引物5′端标记cy5荧光基团，cyp2c19*3的淬灭探针3′端标记bhq2淬灭基团；所述cyp2c19*17野生型探针性arms引物5′端标记fam荧光基团，cyp2c19*17的突变型探针性arms引物5′端标记tet荧光基团，cyp2c19*17的淬灭探针3′端标记bhq2淬灭基团。上述引物组(或引物体系)在制备用于检测cyp2c19基因多态性的试剂盒中的应用。一种检测cyp2c19基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物组(或引物体系)。在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包括阴性质控品和阳性质控品，以及常规组分，比如pcr缓冲液、dntp、mg2+、taq酶等；在一些实施方式中，所述的阴性质控品由tris-hcl缓冲液组成；所述的阳性质控品由cyp2c19*2野生型质粒，cyp2c19*2突变型质粒，cyp2c19*3野生型质粒，cyp2c19*3突变型质粒，cyp2c19*17野生型质粒，cyp2c19*17突变型质粒组成；在一些实施方式中，所述的质粒为人工克隆环状质粒；在一些实施方式中，所述试剂盒中taq酶为热启动酶；上述试剂盒用于检测cyp2c19基因多态性的方法，包含如下步骤：⑴样本处理：采用血液基因组dna提取试剂盒提取人外周血基因组dna，作为待测样本；⑵检测体系配制：向反应管中加入18μlpcr混合液和2μl待测样本，同时设置阴性质控体系和阳性质控体系，反应管放入荧光定量pcr仪中；⑶反应参数设置：95℃3分钟预变性，1个循环；95℃15秒变性，60℃1分钟，收集荧光信号，40个循环；荧光信号采集通路设置fam、tet、rox、cy5；⑷结果判读及分析：①阳性质控品fam、tet、rox、cy5荧光有扩增曲线，阴性质控品无扩增曲线，检测数据有效；②用扩增cyp2c19*2、cyp2c19*3的pcr混合液中fam和tet荧光信号判断cyp2c19*2的多态性，fam有扩增曲线而tet无扩增曲线，判断结果为cyp2c19*2纯合野生型；fam无扩增曲线而tet有扩增曲线，判断结果为cyp2c19*2纯合突变型；fam、tet均有扩增曲线，判断结果为cyp2c19*2杂合型；③用扩增cyp2c19*2、cyp2c19*3的pcr混合液中rox和cy5荧光信号判断cyp2c19*3的多态性，rox有扩增曲线而cy5无扩增曲线，判断结果为cyp2c19*3纯合野生型；rox无扩增曲线而cy5有扩增曲线，判断结果为cyp2c19*3纯合突变型；rox、cy5均有扩增曲线，判断结果为cyp2c19*3杂合型；④用扩增cyp2c19*17的pcr混合液中fam和tet荧光信号判断cyp2c19*17的多态性，fam有扩增曲线而tet无扩增曲线，判断结果为cyp2c19*17纯合野生型；fam无扩增曲线而tet有扩增曲线，判断结果为cyp2c19*17纯合突变型；fam、tet均有扩增曲线，判断结果为cyp2c19*17杂合型。相比于现有技术，本申请的有益效果在于：1)本申请对arms引物和taqman或mgb探针设计进行改良，将taqman或mgb探针上的报告基团直接标记在amrs引物5′端最后一个碱基上，引物探针共享同一条核苷酸序列，制备具有探针性质的探针性arms引物，相对于普通arms引物，tm值高，特异性及灵敏度大大提高，检测结果更加准确(见图1-3)；2)探针性arms引物，共享同一条核苷酸序列、具有引物和探针双重功能，不另外设计taqman探针、mgb探针或其它探针，节省了taqman或mgb探针的设计和成本，设计简单，成本低廉；3)探针性amrs引物和淬灭探针互补配对，报告基团与淬灭基团彼此接触，相对于taqman探针、mgb探针，本底信号更低，检测结果更加客观；4)本申请针对cyp2c19多态性位点设计方法，野生型探针性arms引物和突变型探针性arms引物为同向设计，优势在于，带有错配碱基的野生型探针性amrs引物扩增野生型模板，pcr产物在相同的位置会发生碱基突变，导致野生型pcr产物与突变型探针性arms引物错配碱基数量增加，进而降低了突变型探针的非特异性扩增几率，因此提高了突变型探针性arms引物的扩增特异性；同理，野生型探针性arms引物也会提高特异性；6)本申请通过优化筛选出适于cyp2c19多态性检测的探针性arms引物组，经验证其检测灵敏度高、特异性强，且可在同一反应体系中实现多种类型多态性的检测。7)本申请采用fam标记cyp2c19*2野生型arms引物、tet标记cyp2c19*2突变型arms引物、rox标记cyp2c19*3野生型arms引物、cy5标记cyp2c19*3突变型arms引物，可实现在同一个反应孔检测2个基因多态性位点，通量显著提高；8)本申请cyp2c19*2的野生型和突变型检测体系、cyp2c19*3的野生型和突变型检测体系可设置在同一个pcr混合液，cyp2c19*17的野生型和突变型检测体系设置在同一个pcr混合液，根据一个样本仅纯合野生型、纯合突变型、杂合型三种型别原则，不需设置内标体系；9)本申请可采用预混合液的形式，预先将检测所需的arms引物、淬灭探针、下游引物、pcr缓冲液、dntp、mg2+、taq酶进行混合，使用时不需要配制，仅分装加入模板dna上机检测，操作简便，时间短；10)本申请根据荧光定量pcr仪收集的荧光信号判读结果，不需要统计ct值，结果分析简单；11)本申请的检测方法和试剂盒填补该领域的市场空白，市场反馈良好，适于产业化应用。附图说明图1本申请所述的基因多态性检测方法原理图a；图2本申请所述的基因多态性检测方法原理图b；图3本申请所述的基因多态性检测方法原理图c；图4本申请cyp2c19*2突变型arms引物的标记优化结果；图5本申请cyp2c19*3突变型arms引物的标记优化结果；图6本申请cyp2c19*17突变型arms引物的标记优化结果；图7本申请cyp2c19*2淬灭探针序列优化结果；图8本申请cyp2c19*3淬灭探针序列优化结果；图9本申请cyp2c19*17淬灭探针序列优化结果；图10本发明所述的cyp2c19*2纯合野生型检测结果；图11本发明所述的cyp2c19*2纯合突变型检测结果；图12本发明所述的cyp2c19*2杂合型检测结果；图13本发明所述的cyp2c19*3纯合野生型检测结果；图14本发明所述的cyp2c19*3纯合突变型检测结果；图15本发明所述的cyp2c19*3杂合型检测结果；图16本发明所述的cyp2c19*17纯合野生型检测结果；图17本发明所述的cyp2c19*17纯合突变型检测结果；图18本发明所述的cyp2c19*17杂合型检测结果。具体实施方式下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。实施例1引物的设计优化、标记的优化筛选一、野生型、突变型探针性arms引物的设计和筛选，具体步骤如下：1)针对cyp2c19*2、cyp2c19*3、cyp2c19*17野生型和突变型位点初步设计一系列arms引物，tm值为58～62℃，序列如下表1：表1、初步设计cyp2c19*2、cyp2c19*3、cyp2c19*17野生型和突变型arms引物2)cyp2c19*2野生型arms引物、下游引物、sybr-premix缓冲液配制pcr反应液，分别检测5000copy/μl的cyp2c19*2野生型质粒和突变型质粒；cyp2c19*2突变型arms引物、下游引物、sybr-premix缓冲液配制pcr反应液，分别检测5000copy/μl的cyp2c19*2野生型质粒和突变型质粒；cyp2c19*3野生型arms引物、下游引物、sybr-premix缓冲液配制pcr反应液，分别检测5000copy/μl的cyp2c19*3野生型质粒和突变型质粒；cyp2c19*3突变型arms引物、下游引物、sybr-premix缓冲液配制pcr反应液，分别检测5000copy/μl的cyp2c19*3野生型质粒和突变型质粒；cyp2c19*17野生型arms引物、下游引物、sybr-premix缓冲液配制pcr反应液，分别检测5000copy/μl的cyp2c19*17野生型质粒和突变型质粒；cyp2c19*17突变型arms引物、下游引物、sybr-premix缓冲液配制pcr反应液，分别检测5000copy/μl的cyp2c19*17野生型质粒和突变型质粒；反应参数设置如下：表2、pcr扩增参数设计统计cyp2c19*2野生型pcr反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增ct值及△ct值，统计cyp2c19*2突变型pcr反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增ct值及△ct值，统计cyp2c19*3野生型pcr反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增ct值及△ct值，统计cyp2c19*3突变型pcr反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增ct值及△ct值，统计cyp2c19*17野生型pcr反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增ct值及△ct值，统计cyp2c19*17突变型pcr反应液检测5000copy/μl的野生型质粒和突变型质粒的扩增ct值及△ct值，以上△ct值＝|野生模板ct值-突变模板ct值|，见下表：cyp2c19*2野生型pcr反应液中优选扩增野生型质粒模板ct值相对小且△ct值相对大的野生型arms引物，cyp2c19*2突变型pcr反应液中优选扩增突变型质粒模板ct值相对小且△ct值相对大的突变型arms引物；cyp2c19*3野生型pcr反应液中优选扩增野生型质粒模板ct值相对小且△ct值相对大的野生型arms引物，cyp2c19*3突变型pcr反应液中优选扩增突变型质粒模板ct值相对小且△ct值相对大的突变型arms引物；cyp2c19*17野生型pcr反应液中优选扩增野生型质粒模板ct值相对小且△ct值相对大的野生型arms引物，cyp2c19*17突变型pcr反应液中优选扩增突变型质粒模板ct值相对小且△ct值相对大的突变型arms引物。同时考量引物的扩增特异性。具体优化的备选引物序列见下表。表3、优化筛选的arms引物二、备选arms引物报告基团标记的优化、筛选，具体步骤如下：1)对上述备选amrs引物5′端尝试进行fam、vic、hex、tet、ned、cy3、rox、cy5等不同类型的标记，fam和rox为常用探针标记，性能稳定，因此作为野生型位点基团标记，主要进行突变型arms引物不同报告基团标记的筛选，报告基团的标记由上海生工完成，具体标记情况如下：表4、备选arms引物的标记与筛选2)cyp2c19*2突变型不同报告基团tet、vic、hex标记的arms引物分别与淬灭探针、下游引物、pcr-premix缓冲液配制pcr反应液，检测5000copy/μl的cyp2c19*2突变型质粒；cyp2c19*3突变型不同报告基团cy3、cy5、ned标记的arms引物分别与淬灭探针、下游引物、pcr-premix缓冲液配制pcr反应液，检测5000copy/μl的cyp2c19*3突变型质粒；cyp2c19*17突变型不同报告基团tet、vic、hex标记的arms引物分别与淬灭探针、下游引物、pcr-premix缓冲液配制pcr反应液，检测5000copy/μl的cyp2c19*17突变型质粒。表5、pcr反应参数设置3)结果分析cyp2c19*2突变型arms引物标记优选tet标记，测试结果如图4；cyp2c19*3突变型arms引物标记优选cy5标记，测试结果图5；cyp2c19*17突变型arms引物标记优选tet标记，测试结果如图6。三、淬灭探针序列的设计、优化和筛选，具体步骤如下：1)根据探针性arms引物的序列，设计与之完全互补的一系列不同长度的淬灭探针，3′端进行bhq2标记，具体情况如下表。表6、淬灭探针标记序列2)cyp2c19*2野生型和突变型探针性arms引物，分别与不同长度的淬灭探针、下游引物、pcr-premix缓冲液配制pcr反应液，检测5000copy/μl的cyp2c19*2野生型质粒和突变型质粒；cyp2c19*3野生型和突变型探针性arms引物，分别与不同长度的淬灭探针、下游引物、pcr-premix缓冲液配制pcr反应液，检测5000copy/μl的cyp2c19*3野生型质粒和突变型质粒；cyp2c19*17野生型和突变型探针性arms引物，分别与不同长度的淬灭探针、下游引物、pcr-premix缓冲液配制pcr反应液，检测5000copy/μl的cyp2c19*17野生型质粒和突变型质粒；反应参数设置如下表：表7、pcr反应参数3)结果分析cyp2c19*2优选扩增ct值相对小，荧光信号值相对高的淬灭探针，测试结果如图7所示；cyp2c19*3优选扩增ct值相对小，荧光信号值相对高的淬灭探针，测试结果如图8所示：cyp2c19*17优选扩增ct值相对小，荧光信号值相对高的淬灭探针，测试结果如图9所示。最终优选后的淬灭探针序列如下：cyp2c19*2淬灭探针5′-cccataacaaattacttaaaa-bhq2-3′；cyp2c19*3淬灭探针5′-aggtaaggccaagtttttt-bhq2-3′；cyp2c19*17淬灭探针5′-gagaacagaagacacaaatt-bhq2-3′。实施例2引物制备和试剂盒组装一、本申请探针性arms引物、淬灭探针、下游引物的合成和荧光标记根据实施例1优化筛选到的探针性arms引物、淬灭探针、下游引物以及标记，进行引物合成和荧光标记，具体标记为cyp2c19*2野生型探针性arms引物5′端标记fam、cyp2c19*2突变型探针性arms引物5′端标记tet、cyp2c19*2淬灭探针3′端标记bhq2、cyp2c19*2下游引物；cyp2c19*3野生型探针性arms引物5′端标记rox、cyp2c19*3突变型探针性arms引物5′端标记cy5、cyp2c19*3淬灭探针3′端标记bhq2、cyp2c19*3下游引物；cyp2c19*17野生型探针性arms引物5′端标记fam、cyp2c19*17突变型探针性arms引物5′端标记tet、cyp2c19*17淬灭探针3′端标记bhq2、cyp2c19*17下游引物。具体序列如下：cyp2c19*2野生型探针性arms引物：5′-fam-ttttaagtaatttgttatgggttgcc-3′seqidno.1；cyp2c19*2突变型探针性arms引物：5′-tet-ttttaagtaatttgttatgggtgcct-3′seqidno.2；cyp2c19*2淬灭探针：5′-cccataacaaattacttaaaa-bhq2-3′seqidno.3；cyp2c19*2下游引物：5′-aattttcccactatcattgattatttcc-3′seqidno.4；cyp2c19*3野生型探针性arms引物：5′-rox-aaaaaacttggccttacctgaatc-3′seqidno.5；cyp2c19*3突变型探针性arms引物：5′-cy5-aaaaaacttggccttacctgtatt-3′seqidno.6；cyp2c19*3淬灭探针：5′-aggtaaggccaagtttttt-bhq2-3′seqidno.7；cyp2c19*3下游引物：5′-gaaaacatcaggattgtaagcacc-3′seqidno.8；cyp2c19*17野生型探针性arms引物：5′-fam-aatttgtgtcttctgttctcagagc-3′seqidno.9；cyp2c19*17突变型探针性arms引物：5′-tet-aatttgtgtcttctgttctcaaggt-3′seqidno.10；cyp2c19*17淬灭探针：5′-gagaacagaagacacaaatt-bhq2-3′seqidno.11；cyp2c19*17下游引物：5′-gcgcattatctcttacatcagag-3′seqidno.12。二、用于基因多态性检测的pcr混合液配制1.用于扩增cyp2c19*2、cyp2c19*3的pcr混合液配制，包括cyp2c19*2野生型探针性arms引物、cyp2c19*2突变型探针性arms引物、cyp2c19*2淬灭探针、cyp2c19*2下游引物、cyp2c19*3野生型探针性arms引物、cyp2c19*3突变型探针性arms引物、cyp2c19*3淬灭探针、cyp2c19*3下游引物，序列为seqidno.1～seqidno.8，pcr缓冲液、dntp、mg2+、taq酶，具体成分如下。表8、cyp2c19*2和cyp2c19*3的pcr混合液组分和含量2.用于扩增cyp2c19*17的pcr混合液配制，包括cyp2c19*17野生型探针性arms引物、cyp2c19*17突变型探针性arms引物、cyp2c19*17淬灭探针、cyp2c19*17下游引物，序列为seqidno.9～seqidno.12，pcr缓冲液、dntp、mg2+、taq酶。具体成分如下表：表9、cyp2c19*17的pcr混合液组分和含量组分含量pcr缓冲液1×dntp150μmmg2+2mmtaq酶1ucyp2c19*17野生型探针性arms引物500nmcyp2c19*17突变型探针性arms引物500nmcyp2c19*17淬灭探针1.5μmcyp2c19*17下游引物500nm去离子水至18μl3.阴性质控品的配制，配制包括tris-hcl(ph8.0)的常规缓冲液。4.阳性质控品的配制，配制包括cyp2c19*2野生型质粒、cyp2c19*2突变型质粒、cyp2c19*3野生型质粒、cyp2c19*3突变型质粒、cyp2c19*17野生型质粒、cyp2c19*17突变型质粒，具体成分如下表：表10、野生型质粒成分种类拷贝数cyp2c19*2野生型质粒2000拷贝cyp2c19*2突变型质粒2000拷贝cyp2c19*3野生型质粒2000拷贝cyp2c19*3突变型质粒2000拷贝cyp2c19*17野生型质粒2000拷贝cyp2c19*17突变型质粒2000拷贝三、试剂盒组装试剂盒包括4种试剂：用于扩增cyp2c19*2、cyp2c19*3的pcr混合液，用于扩增cyp2c19*17的pcr混合液，阴性质控品，阳性质控品，具体成分如下：表11、试剂盒组成用于扩增cyp2c19*2、cyp2c19*3的pcr混合液450μl用于扩增cyp2c19*17的pcr混合液450μl阴性质控品100μl阳性质控品100μl实施例3检测灵敏度使用实施例2中制备的基于共享性引物探针检测人类cyp2c19基因多态性的试剂盒a与基于arms引物+taqman探针检测cyp2c19基因多态性试剂盒b、基于mgb探针检测cyp2c19基因多态性试剂盒c对比测试，具体对比测试步骤如下：步骤一、制备灵敏度模板，包括cyp2c19*2纯合野生型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl，cyp2c19*2纯合突变型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl，cyp2c19*2杂合型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl；cyp2c19*3纯合野生型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl，cyp2c19*3纯合突变型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl，cyp2c19*3杂合型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl；cyp2c19*17纯合野生型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl，cyp2c19*17纯合突变型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl，cyp2c19*17杂合型2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl；步骤二、根据说明书配制试剂盒a、试剂盒b、试剂盒c，加入模板，每个反应孔20个重复，混合均匀，置于荧光定量pcr仪设备中；步骤三、反应参数的设置，具体如下表：表12、pcr反应参数步骤四、检测结果分析见下表表13、灵敏度检测结果基于共享性引物探针检测人类cyp2c19基因多态性的试剂盒a、基于arms引物+taqman探针检测cyp2c19基因多态性试剂盒b、基于mgb探针检测cyp2c19基因多态性试剂盒c检测2ng/μl、1ng/μl的灵敏度模板，检出率均为100％，在检测更低浓度的0.5ng/μl时，本发明的基于共享性引物探针检测人类cyp2c19基因多态性的试剂盒a有更高的检出率，可见，通过共享性引物探针制备的试剂盒检测灵敏度更高。实施例450例样本检测使用实施例2中制备的人类cyp2c19基因多态性检测试剂盒检测50例待测样本静脉全血，具体检测步骤如下：步骤一、样本处理：外购全血基因组dna提取试剂盒对50例样本进行核酸dna提取，od260/280介于1.8～2.0，od260/230在1.8～2.2，浓度大于5ng/μl；步骤二、检测试剂配制：将实施例2中制备的用于扩增cyp2c19*2、cyp2c19*3的pcr混合液、用于扩增和cyp2c19*17的pcr混合液平衡至室温，颠倒混匀，分别取18μl的pcr混合液至pcr反应管中，然后加入步骤一中纯化的2μl核酸dna样本、2μl阴性质控品、2μl阳性质控品，混合均匀，置于荧光定量pcr仪设备中；步骤三、反应参数的设置，具体如下：表14、pcr反应参数步骤四、检测结果分析：1.结果判读标准见下表：表15、结果判读标准注：阳性代表有s型扩增曲线；阴性代表没有s型扩增曲线2.根据结果判读标准分析50例样本分析结果，见下表：表16、50例样本检测结果3.如下是50例样本第三方测序结果，作为结果参照。表17、50例样本的第三方测序结果纯合野生型杂合型纯合突变型cyp2c19*228157cyp2c19*34073cyp2c19*174721可见，本申请的方法与第三方测序结果对比，上述50例待测样本分析结果，符合率100％。以上结果表明：本发明所设计的试剂盒可用于检测人类cyp2c19基因多态性，其结果准确可靠，特异性强，达到了测序检测效果；同时该方法操作简便、检测时间短、结果分析简单、成本低。以上对本申请具体实施方式的描述并不限制本申请，本领域技术人员可以根据本申请作出各种改变或变形，只要不脱离本申请的精神，均应属于本申请所附权利要求的范围。序列表<110>北京安智因生物技术有限公司<120>基于共享性引物探针检测基因多态性的试剂盒、方法及应用<130>2019<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列()<400>1ttttaagtaatttgttatgggttgcc26<210>2<211>26<212>dna<213>人工序列()<400>2ttttaagtaatttgttatgggtgcct26<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列()<400>3cccataacaaattacttaaaa21<210>4<211>28<212>dna<213>人工序列()<400>4aattttcccactatcattgattatttcc28<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列()<400>5aaaaaacttggccttacctgaatc24<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列()<400>6aaaaaacttggccttacctgtatt24<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列()<400>7aggtaaggccaagtttttt19<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列()<400>8gaaaacatcaggattgtaagcacc24<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列()<400>9aatttgtgtcttctgttctcagagc25<210>10<211>25<212>dna<213>人工序列()<400>10aatttgtgtcttctgttctcaaggt25<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列()<400>11gagaacagaagacacaaatt20<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列()<400>12gcgcattatctcttacatcagag23当前第1页12