RPN1基因cg008843506位点甲基化在诊断哮喘中的用途的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及rpn1基因cg008843506位点甲基化在诊断哮喘中的用途。

背景技术：

支气管哮喘(以下简称哮喘)是一种呼吸道的慢性炎症，在发作时可出现喘息、咳嗽等症状，病情多在夜间或清晨加重。随着对哮喘知识的普及，人们对哮喘的认识的提高，哮喘的治疗和预防工作取得了一定的的进展。但是到目前为止哮喘仍然不能根治，治疗效果不理想，给患者造成了极大的经济负担和心理负担。有调查发现成人哮喘和儿童哮喘在30年来其死亡率和发病率呈递增趋势，占全球疾病总负担1％。其发病机制尚不明确，因此，对于哮喘的研究还是十分有意义和必要的。

中医学很早就有关于“哮喘”方面的记载。哮喘这一病名在《黄帝内经》中虽然未明确提出，但有哮喘症状相类似的记载。汉代的张仲景《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证并治》篇曰:“咳而上气，喉中水鸡声，射干麻黄汤主之”。指出哮喘发病时喉中发出类似于蛙叫声，与西医的哮喘发作时有哮鸣声相似，并提出治疗的方药，其中指出的症状与现代医学的支气管哮喘急性期发作时的症状相类似。元代的朱丹溪第一次提出哮喘的病名，随着研究的深入，后世医家在对其病因病机深入了解的基础上逐步区分出哮与喘的区别。中医学中哮喘属于“哮病”的范畴，其在大发作时咽喉中会发出哮鸣音，感到呼吸急促并兼有呼吸困难，甚至喘息而不能平卧。其病因为外邪侵袭，饮食不当，情志刺激，体虚病后。中医学认为其发病是由于脏腑功能失调，导致津液的聚集而形成痰，伏痰藏于肺中，这成为发病的根本原因。肺为哮病的主要病位，并且与脾肾的关系密切。在缓解期时也感觉气短，疲乏，伴有哮病的症状，但是较轻，让这些症状全部消失很困难。哮病一但急性发作，病情错综复杂，可以邪实与正气虚并见，可发生“喘脱”危候。哮病是一种复杂性疾病，其可以反复发作，病程缠绵难愈的，病情症状较复杂。哮病最先发的部位是肺，最后影响到脾、肾，反复发作影响其肺功能，最终可能形成肺胀重症，可由早期单纯的局部病变发展为多个脏腑病变的全身的复杂性疾病。其病情复杂，因此从古至今医家们从未间断的在对其进行研究。

dna甲基化是指基因组cpg二核苷酸的胞嘧啶5号碳原子上共价结合一个甲基基团，其主要参与基因的表达调控。许多基因的甲基化被证明与各种临床疾病密切相关，有些甚至可以被确定为疾病致病的独立因素。dna甲基化异常与肿瘤等疾病密切相关。因此，甲基化基因不仅可作为疾病分子诊断的标志物，同时也可作为分子治疗的靶标(参考文献：dna甲基化标志物在分子诊断与治疗中的价值，分子诊断与治疗杂志2009年9月第1卷第3期)。

本申请意在研究与哮喘相关的dna甲基化，以期挖掘可用于临床诊断的生物标志物。

技术实现要素：

本发明的研究思路如下：根据课题组前期甲基化芯片结果，筛选出位于rpn1基因启动子区cg008843506位点为目的基因位点进行扩大样本量的methyltarget定量检测，并与患者临床数据进行相关性分析。结果显示，健康对照和哮喘患者之间rpn1基因启动子区cg008843506位点的甲基化水平存在显著差异，故可以根据cg008843506位点的甲基化状态判断受试者是否患有哮喘。

具体地，本发明提供了如下技术方案：

第一个方面，本发明提供了一种用于检测哮喘的试剂盒，所述试剂盒包括：检测rpn1基因启动子区cg008843506位点甲基化水平的试剂。

所述试剂包括检测dna甲基化的方法中使用的试剂。

作为试剂的具体实例，所述试剂包括针对rpn1基因的引物和/或探针。

进一步，所述试剂盒还包括检测内参基因的试剂。

所述检测内参基因的试剂包括针对内参基因的引物和/或探针。

试剂盒中应用内参来指示dna提取和修饰的质量。

更进一步，所述试剂盒还包括：dna聚合酶、dntps、mg²⁺离子。

更进一步，所述试剂盒还包括：亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐或肼盐。

更进一步，所述的试剂盒中还包括(但不限于)：质控品、阴性对照和/或说明书。

第二个方面，本发明提供了rpn1基因启动子区cg008843506位点在制备诊断哮喘的试剂中的用途。

进一步，所述试剂包括引物和/或探针。

第三个方面，本发明提供了检测rpn1基因启动子区cg008843506位点甲基化水平的试剂的用途，用于制备诊断哮喘的试剂盒。

所述试剂盒是前面所述的试剂盒。

第四个方面，本发明提供了体外非诊断性地检测rpn1基因的dna甲基化的方法，所述方法包括：

(1)将待测样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理，获得经修饰的待测样品；

(2)利用前面所述的试剂盒对步骤(1)的经修饰的待测样品进行检测，获得rpn1基因的dna甲基化情况。

如本文所用，“待测样品”是指待检测的核酸样本，其中含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标核酸。本发明中，所述的待测样本可以是组织或体液。

如本文所用，“目标核酸”是指感兴趣的核酸片段，其是rpn1基因甲基化dna特异性片段。

如本文所用，“探针”是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸，其具有与目标核酸基本上互补的核苷酸序列结构，可以与“目标核酸”形成双链。所述的“探针”可以携带标记物。例如，标记物可以连接在探针的5’末端或3’末端。

检测探针标记的荧光基团可以是vic、rox、fam、cy5、hex、tet、joe、ned等；淬灭基团可以是tamra、bhq、mgb、dabcyl。以适用于目前临床检测常用的多通道pcr检测系统，实现在一个反应管中进行多色荧光检测。

用于评估dna甲基化的方法是公知的。例如，laird(2010)naturereviewsgenetics11:191-203提供关于dna甲基化分析的综述。在一些实施方案中，评估甲基化的方法包括将基因组dna随机剪切或随机片段化，用甲基化依赖性或甲基化敏感性限制酶切割dna，随后选择性鉴定和/或分析切割或未切割的dna。选择性鉴定可包括例如，分离切割和未切割的dna(例如通过大小)并量化感兴趣的切割或未切割的序列。参见例如，美国专利no.7,186,512。在一些实施方案中，所述方法可涵盖在限制酶消化后扩增完整的dna，由此仅扩增在扩增区域中未被限制酶切割的dna。参见例如，美国专利申请no.10/971,986；11/071,013；和10/971,339。在一些实施方案中，扩增可使用基因特异性的引物进行。或者，可将接头添加到随机片段化的dna的端，所述dna可用甲基化依赖性或甲基化敏感性限制酶消化，完整dna可使用与接头序列杂交的引物扩增。在一些实施方案中，可实施第二步骤来测定dna的扩增池中特定基因的存在、缺失或量。在一些实施方案中，使用实时定量pcr来扩增dna。

用于检测dna甲基化的其他方法可牵涉在用亚硫酸氢盐处理dna之前和之后的基因组测序。参见例如，frommer,proc.natl.acad.sci.usa89:1827-1831(1992)。当将亚硫酸氢钠与dna接触时，未甲基化的胞嘧啶被转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不被修饰。

在一些实施方案中，将从亚硫酸氢盐转化后的dna扩增的pcr产物的限制酶消化用于检测dna甲基化。参见例如，sadri&hornsby,nucl.acidsres.24:5058-5059(1996)；xiong&laird,nucleicacidsres.25:2532-2534(1997)。

在一些实施方案中，单独或与其他方法组合地使用methylight测定法来检测dna甲基化(参见eads等,cancerres.59:2302-2306(1999))。

在一些实施方案中，单独或与其他方法组合地使用ms-snupe(甲基化敏感性单核苷酸引物延伸，methylation-sensitivesinglenucleotideprimerextension)来检测dna甲基化(参见gonzalgo&jonesnucleicacidsres.25:2529-2531(1997))。

在一些实施方案中，单独或与其他方法组合地使用甲基化特异性pcr(“msp”)反应来检测dna甲基化。msp测定法必须首先通过亚硫酸氢钠来修饰dna，将所有未甲基化的而非甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，随后使用特异于甲基化相对于未甲基化dna的引物进行扩增。参见，herman,proc.natl.acad.sci.usa93:9821-9826,(1996)；美国专利no.5,786,146。

在一些实施方案中，使用高通量dna甲基化分析来测定基因甲基化状态。简言之，从细胞或组织样品(例如组织样品或血液样品)分离基因组dna并在亚硫酸氢钠反应中转化(亚硫酸氢盐方法将未甲基化的胞嘧啶残基转化成尿嘧啶)，其使用本领域中的标准测定法。将经亚硫酸氢盐转化的dna产物扩增、片段化并与含有来自整个基因组的cpg位点的阵列杂交，其使用本领域中的标准测定法。杂交后，将阵列成像，并使用本领域中的标准测定法处理用于分析dna甲基化状态。

在一些实施方案中，使用亚硫酸氢盐测序pcr(bsp)鉴定基因甲基化状态。简言之，从细胞或组织样品(例如组织样品或血液样品)分离基因组dna并在亚硫酸氢钠反应中转化(该亚硫酸氢盐方法将未甲基化的胞嘧啶残基转化成尿嘧啶)，其使用本领域中的标准测定法。将经亚硫酸氢盐转化的dna产物用设计为特异于经亚硫酸氢盐转化的dna的引物(例如亚硫酸氢盐特异性引物)扩增并连接到载体中用于转化到宿主细胞中，其使用本领域中的标准测定法。在选出含有pcr扩增的、经亚硫酸氢盐转化的、感兴趣的dna产物的宿主细胞之后，分离dna产物并测序以确定甲基化的位点，其使用本领域中的标准测定法。

在一些实施方案中，使用定量甲基化特异性pcr(qmsp)来鉴定基因甲基化状态。简言之，从细胞或组织样品分离基因组dna并在亚硫酸氢钠反应中转化(该亚硫酸氢盐方法将未甲基化的胞嘧啶残基转化成尿嘧啶)，其使用本领域中的标准测定法。

附图说明

图1显示rpn1基因cg008843506甲基化水平统计图；

图2显示roc曲线图；

图3显示rpn1基因cg008843506甲基化与临床症状相关性分析图；

图4显示rpn1基因cg008843506甲基化与肺功能相关性分析图；

图5显示rpn1基因cg008843506甲基化与血清总ige相关性分析图。

具体实施方案

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1哮喘相关甲基化位点研究

1、研究人群

本申请的研究人群是由2017年9月至2019年9月期间收集的的哮喘患者(n＝13)和健康对照(n＝13)组成。

患者纳入标准包括：(1)当前(过去12个月)呼吸道症状；(2)先前医生对哮喘的诊断；(3)哮喘发作期间肺活量测定表明肺功能下降。

排除标准：最近(过去一个月)发生呼吸道感染；合并症，例如癌症或其他呼吸道疾病，包括但不限于copd；自身免疫病史；糖尿病和其他潜在疾病。

收集血液。同时收集以下信息：临床特征，全血细胞计数结果，血清总ige和哮喘控制。所有参与者均提供了书面知情同意书，该研究获得了江苏大学附属医院人类研究伦理委员会的批准。

2、dna提取和dna甲基化测定

使用ebioscience^tm1xrbc裂解缓冲液(thermofisherscientific，中国上海)从外周血中分离白细胞并离心。

使用通用基因组dna提取试剂盒(solarbio，北京，中国)从白细胞中提取基因组dna，然后根据制造商的规程使用ezdnamethylation^tm-gold试剂盒(zymoresearch，ca，美国)将亚硫酸氢盐转化。pcr扩增(hotstartaq聚合酶试剂盒，takara，日本东京)并构建文库后，根据制造商指南，使用配对末端测序方案对样品进行测序(illuminamiseqbenchtopsequencer，ca，美国)。通过甲基靶标测序(geneskybiotechnologiesinc.，shanghai，china)确定了特定cpg位点的dna甲基化水平，该方法采用了基于下一代测序的多目标cpg甲基化分析方法。

3、统计分析

在统计分析之前，对所有变量进行正态分布调查。正态分布的连续变量以平均值±标准差表示，并通过独立样本t检验进行分析。异常分布的连续变量表示为中位值。使用kruskal-wallis检验和mann-whitneyu检验对连续变量进行单变量分析，以计算组间甲基化差异。spearman关联分析用于分析rpn1启动子甲基化与肺功能和ige水平变化之间的关系。使用ibmspssstatisticsversion23(ibmcorp，armonk，ny)进行统计分析，所有统计分析都是双向的。对于上述统计方法，p值<0.05被认为具有统计学意义。

4、结果

(1)特征

表1列出了哮喘患者和健康对照的特征。哮喘患者和健康对照者之间在年龄、体重指数(bmi)和白细胞计数方面并无差异。但是其他指标，包括血清总ige，fev1％pred和fev1/fvc，在两组之间存在显著差异(p<0.001)。

表1研究人群的基本资料

(2)甲基化差异

本研究检测到相比健康对照，rpn1基因cg008843506在哮喘患者中低甲基化(p<0.05，图1)。利用受试者工作曲线(roc曲线)分析cg008843506对哮喘的诊断效能，auc值为0.817，cutoff值为0.3084时，敏感度为76.9％，特异性为76.9％，详细结果见表2和图2。

表2roc曲线统计结果

(3)症状相关性分析

由于入组的13例患者中共有7例患者主诉有明显胸闷、喘息等呼吸道症状，6例患者近期无明显呼吸道症状。因此，本研究根据患者有无明显呼吸道症状，将其分为有症状组(s)及无症状组(ns)，分别比较其甲基化水平差异。图3显示cg008843506的甲基化变化与临床症状的存在无关(p>0.05)。

(4)肺功能相关性分析

以spearman相关分析分别比较哮喘组患者cg008843506位点甲基化水平与第1秒用力呼气容积占预计值百分比(fev1％prep)及第一秒用力呼气量占用力肺活量比值(fev1/fvc)间的相关性。具体相关性数值如下：rpn1基因中的cg008843506位点中fev1％pred相关系数rs＝0.731，p＝0.005；fev1/fvc相关系数rs＝0.599，p＝0.031；上述结果表明，cg008843506甲基化水平与肺功能呈明显正相关(图4)。

(5)血清总ige水平相关性分析

以spearman相关分析分别比较哮喘组患者cg008843506位点甲基化水平与血清总ige水平间的相关性。具体相关性如下：rpn1基因中的cg008843506位点中相关系数rs＝-0.599，p＝0.031；上述结果表明，cg008843506甲基化水平与血清总ige水平呈明显负相关(图5)。

本发明通过对目的区域甲基化水平测序，验证了rpn1基因相关位点在哮喘患者中出现差异性甲基化，并通过与患者临床数据进行相关性分析，提示上述基因可能作为协助哮喘诊断的dna甲基化分子标志物。