植物乳酸杆菌单宁酶基因及其应用的制作方法

文档序号：21452973发布日期：2020-07-10 17:46阅读：467来源：国知局

本发明涉及一种基因及其应用，具体涉及植物乳酸杆菌单宁酶基因及其应用。

背景技术：

单宁酶又称单宁酰水解酶，属于丝氨酸水解酶，具有酯酶与缩酚酸酶活性，能降解单宁中的缩酚酸键与酯键，释放出五倍子酸和葡萄糖，使单宁酶被广泛应用于食品、动物饲料、酿酒、化工以及制药行业。

不同的单宁酶对酯键及缩酚酸键具有不同的催化活性，传统方法生产单宁酶主要是通过液态深层发酵和固态发酵两种方法，这两种方法生产的单宁酶耗时较长，成本较高，不利于纯化，而且生产出的单宁酶对酯键及缩酚酸键的催化活性不明确，催化效率低，导致单宁酶的应用受到很大局限。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是目前现有的单宁酶纯度低，对酯键及缩酚酸键的催化活性低，目的在于提供植物乳酸杆菌单宁酶基因，解决如何定向生产出高纯度、高产量并对酯键及缩酚酸键的催化活性高的单宁酶。

本发明通过下述技术方案实现：

植物乳酸杆菌单宁酶基因，所述植物乳酸杆菌单宁酶基因tg的核苷酸序列如seqidno.1所示。

利用本发明所述的植物乳酸杆菌单宁酶基因tg结合基因重组方法及蛋白纯化方法可定向获得高纯度的植物乳酸杆菌单宁酶，基因重组方法及蛋白纯化方法是现有技术，操作简单，生产的植物乳酸杆菌单宁酶便于纯化，对酯键及缩酚酸键的催化活性明确、稳定并高于现有的单宁酶，解决了目前现有的单宁酶纯度低、产量低、对的问题。

基于上述的植物乳酸杆菌单宁酶基因的突变基因，其特征在于，突变基因mtg的核苷酸序列如seqidno.2所示，通过定点突变技术将所述植物乳酸杆菌单宁酶基因tg的基因片段进行改造得到所述突变基因mtg。

本发明基于植物乳酸杆菌单宁酶基因tg，对其进行定点突变改造获得突变基因mtg，突变基因mtg表达产物对酯键及缩酚酸键的催化活性高，显著地提高了植物乳酸杆菌单宁酶对酯键及缩酚酸键的催化活性。

基于植物乳酸杆菌单宁酶基因tg的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示。

基于物乳酸杆菌单宁酶基因tg的突变基因mtg的重组蛋白，其特征在于，所述突变基因的重组蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示。

基于物乳酸杆菌单宁酶基因tg和植物乳酸杆菌单宁酶基因的突变基因mtg的应用，其特征在于，包括以下步骤：

a、从植物乳酸杆菌中克隆植物乳酸杆菌单宁酶基因tg；

b、通过定点突变技术对植物乳酸杆菌单宁酶基因tg进行改造，得到植物乳酸杆菌单宁酶基因的突变基因mtg；

c、将植物乳酸杆菌单宁酶基因tg或是植物乳酸杆菌单宁酶基因的突变基因mtg通过表达载体转入宿主进行表达获得重组蛋白，并且利用亲合层析、离子交换层析对表达后的重组蛋白进行纯化。

本发明中植物乳酸杆菌单宁酶基因tg及其突变基因可以实现单宁酶高产、高纯度的定向生产应用；通过基因重组表达的方法实现植物乳酸杆菌单宁酶的快速、高效表达；通过亲合层析，离子交换等方法获得高纯度的植物乳酸杆菌单宁酶；用定点突变技术，对植物乳酸杆菌单宁酶基因进行改造，使其能够同时高效率的降解酯键与缩酚酸键。

通过亲合层析，离子交换等方法获得高纯度的植物乳酸杆菌单宁酶；

利用定点突变技术，对植物乳酸杆菌单宁酶进行改造，使其能够同时高效率的降解酯键与缩酚酸键。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明植物乳酸杆菌单宁酶基因通过基因重组表达的方法能够实现植物乳酸杆菌单宁酶的快速、高效表达；

2、本发明植物乳酸杆菌单宁酶基因及其突变基因可以实现单宁酶高产、高纯度的定向生产应用，突变基因表达产物对酯键与缩酚酸键的催化活性高；

3、本发明植物乳酸杆菌单宁酶基因表达产物，利用现有的蛋白纯化方法可进行产物的纯化，纯化简单，利于纯化，可提高单宁酶的纯度。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

植物乳酸杆菌单宁酶基因tg及其突变基因mtg的获取：以乳酸杆菌菌液为模板进行pcr，克隆得到植物乳酸杆菌单宁酶基因tg的全长序列(如序列表中seqidno.1所示)；以克隆得到的植物乳酸杆菌单宁酶基因tg的全长序列，采用pcr技术进行定点突变，获得突变基因mtg的全长序列(如序列表中seqidno.2所示)。

实施例2

植物乳酸杆菌单宁酶基因tg及其突变基因mtg在单宁酶生产中的应用：

1)植物乳酸杆菌单宁酶基因tg在单宁酶制备中的应用：

通过基因重组的方法使植物乳酸杆菌单宁酶基因tg在大肠杆菌中快速表达，并且利用亲合层析、离子交换层析对表达后的单宁酶进行了纯化，获得了高产量、高纯度的植物乳酸杆菌单宁酶；以1升lb液体培养基为例，纯化后的单宁酶产量>80mg，纯度>95％，对单宁酶的活性测定显示：植物乳酸杆菌单宁酶对酯键的催化活力为204u/mg，对缩酚酸键的活力为：25u/mg。

2)植物乳酸杆菌单宁酶突变基因mtg在单宁酶制备中的应用：

1、重组表达质粒的构建

通过化学合成的方法合成改造后的植物乳酸杆菌单宁酶突变基因mtg，并将其克隆至原核表达质粒pet32a上；

2、单宁酶的表达与纯化

将构建好的载体转化大肠杆菌bl21-de3感受态，涂含有卡那霉素的lb平板，挑取单克隆接种于lb培养基中，于37℃，200rpm培养至od600值为1.0左右时，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，20℃诱导过夜，6500rpm离心15min收菌；将收集的菌体用缓冲液a(20mmtris-hcl,ph8.0+100mmnacl+10mm咪唑，ph8.0)重悬，用高压均质机(avestin)13000psi破3-4遍，4℃条件下20000rpm离心20min，收集上清，过膜(5μm)；表达载体pet32a，带有n末端组氨酸标签。过膜后上清，用蛋白纯化仪(aktaexplorer100，gehealthcare)过5mlhistraphp亲和层析柱(gehealthcare)，用缓冲液(20mmtris-hcl+ph8.0+100mmnacl+300mm咪唑，ph8.0)梯度洗脱；

3、tev酶切去除n末端组氨酸标签

为了去除组氨酸标签对单宁酶活性以及结晶的影响，用tev酶切去除组氨酸标签。将亲和层析后的单宁酶透析，将缓冲液中的咪唑去除，然后与tev按照25：1的比例混合，与4℃条件酶切过夜；经酶切后的单宁酶溶液(加入10mm咪唑)再次过组氨酸亲和层析柱纯化，tev由于自身带有组氨酸标签，可以结合亲和层析柱，将与酶切后产生的组氨酸标签以及酶切不完全的单宁酶一起结合到组氨酸亲和层析柱上，而酶切后的单宁酶不能结合组氨酸亲和层析柱，将以穿透的形式存在，将收集的穿透用缓冲液换20mmtris-hcl+ph8.0+50mmnacl，ph8.0透析，将透析后的单宁酶利用阴离子交换柱纯化，用缓冲液换20mmtris-hcl+ph8.0+500mmnacl，ph8.0梯度洗脱，将洗脱液用20mmtris-hcl+50mmnacl+50mmmgcl2+1mmedta，ph8.0透析，使单宁酶保存在该缓冲液中。

4、酶活性的测定

酶活性单位的定义u：在温度为30℃，ph为8的条件下，每分钟内水解底物生成1μmol产物五倍子酸所需要的酶量，定义为一个酶活性单位u。

单宁酶可以水解没食子酸甲酯以及单宁酸，释放出五倍子酸。通过绕单宁和五倍子酸的特异反应，我们可以测定单宁酶的活性，利用浓度为25mm没食子酸甲酯(酯键底物)或者浓度为2.5mm的单宁酸(缩酚酸键底物)作为底物，单宁酶可以水解没食子酸甲酯(mg)与单宁酸(ta)，生成五倍子酸，五倍子酸(ga)可以与绕单宁反应，用naoh终止反应，测520nm的吸光度。在700ul的反应缓冲液(20mmtris-hcl+50mmnacl+50mmmgcl2+1mmedta，ph8.0)中加入0.1ug的单宁酶与浓度40ul浓度为25mm的没食子酸甲酯或者1.0ug的单宁酶与40ul浓度为2.5mm的单宁酸，在30℃条件下温育5min，然后加入150ul浓度为0.667％w/v的绕单宁溶液再次在30℃下温育5min，加入100ul浓度为0.5m的naoh反应5min终止反应，用分光光度计检测酶解液在520nm下的吸光度值。

标准曲线制备：用浓度为0.125-1mm的标准的五倍子酸溶液与绕单宁反应，测520nm的吸光度，以五倍子酸的浓度为横坐标对纵坐标吸光度值作出标准曲线。

相较于上述改造前的植物乳酸杆菌单宁酶，改造后的植物乳酸杆菌单宁酶对酯键的催化活力为194u/mg，但是对缩酚酸键的活力提高4.7倍，达到118u/mg，酶活性得到显著的提升。

本发明中改造前的植物乳酸杆菌单宁酶基因、改造后的植物乳酸杆菌单宁酶基因采用的是相同的基因重组表达方法及蛋白纯化方法，基因重组表达方法及蛋白纯化方法均为现有技术，再在此不做过多解释，改造前的植物乳酸杆菌单宁酶、改造后的植物乳酸杆菌单宁酶的酶活性测定方式相同。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>四川省危险化学品质量监督检验所

<120>植物乳酸杆菌单宁酶基因及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1410

<212>dna

<213>植物乳酸杆菌单宁酶(lactobacillusplantarumtannase)

<400>1

atgagtaaccgattgatttttgatgctgactggctggtgccggaacaggtccaagttgcc60

gggcaggctattcaatattatgctgcccgtaatattcagtacgttcagcatccagtcgca120

gcgattcaggtcctaaacgtttttgtaccagccgcatacttgcatggcagttcagtcaat180

ggttatcagcgggcaacggcgccaattctgatgccgaatacggtcggcggttatttgcca240

ggaccggcggatgatccgcaacgtgtcacttggccgacgaatgcagggacgattcaacag300

gcacttaaacgcggttacgttgtggtggccgctggaattcgcggtcgtacgacggttgat360

aagtctgggcaacgggtcgggcaagcgccggcttttatcgtagatatgaaggcggcaatc420

cgttacgttaagtataatcagggccggctgccaggtgacgcgaaccggatcatcacgaat480

ggaacgagtgctgggggtgccacttcggctttagcgggtgcgagtggcaattcggcttat540

tttgaaccagccttaactgcgctcggggcagcaccggcgactgacgatatctttgcggtg600

tcagcttactgcccgattcataatctggaacacgcagacatggcctacgagtggcagttt660

aatggtattaatgactggcaccgttatcagcctgttgcggggacgaccaagaatgggcga720

ccaaaatttgaaccggttagtggtcagctcacagttgaagaacaggccctttcgttggcg780

ttaaaagcccagttcagtacctacttgaaccagttgaaactcacggccagtgacgggacg840

cacttgacgcttaatgaggcgggaatgggttcatttcgtgatgttgttcgccaattattg900

atatcatctgctcagacggcattcgatcaagggacggatattcataagtacgcaggcttt960

gtcgttactggaaatcaggtgacggacttggatttatcagcttatttgaagtcgttaact1020

cgcatgaaagccgtcccggcgtttgaccaattagatttgacgagtccagagaataattta1080

tttggcgatgcaacggcgaaagccaagcactttacggccttggcacagacgcgaagtacg1140

gtgactgcacaactagcggacgctgagctgattcaggcgattaatccgctcagttactta1200

acgacaacttcgtcacaagttgctaagcactggcggattcgccacggtgcggccgaccga1260

gatacgagttttgcaatcccgattattctagcaataatgttagaaaatcatggttatggc1320

attgattttgcgctaccgtgggatattccccacagtggtgactatgatttaggcgattta1380

ttttcctggattgatggcttgtgccaatga1410

<210>2

<211>1341

<212>dna

<213>植物乳酸杆菌单宁酶(lactobacillusplantarumtannase)

<400>2