一种草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型弱毒株及其应用的制作方法

本发明属于疫苗制备技术领域，具体为一种草鱼呼肠孤病毒ⅱ型弱毒株及其应用。

背景技术：

草鱼(ctenopharyngodonidella)是我国重要的淡水养殖鱼类，在我国已有超过60年的养殖历史，也是世界上重要的淡水鱼品种之一。2018年，淡水鱼总产量2959.83万吨,其中草鱼产量为534.5万吨，占淡水养殖品种总产量的18.4％，产值达50亿以上，居淡水鱼养殖品种首位，具有重要的经济地位。由草鱼呼肠孤病毒(grasscrapreovirus，gcrv)引起的草鱼出血病(grasscarphemorrhagedisease，gchd)是造成草鱼死亡的最主要的病原，其流行广泛、发病率高、死亡率高，严重威胁着草鱼养殖业。gcrv隶属呼肠孤病毒科(reoviridae)，水生动物呼肠孤病毒属(aquareovirus)，呈正二十面体对称球形颗粒，直径为65～72nm，无囊膜，具有双层衣壳，gcrv基因组由11条分节段的双链rna(dsrna)组成。根据基因序列的不同将gcrv大致分为i、ii和iii3个基因型。目前以gcrv-ii型为主要流行株，对草鱼的致病性强，致死率高，大约占了95％以上。因此，目前开发针对流行基因型gcrvii型的疫苗具有积极的意义，对草鱼养殖过程中不断发生的草鱼出血病的预防具有明显优势。

针对由gcrv-ii引起的草鱼出血病，目前仍没有有效的治疗措施，在生产养殖上，主要以预防为主。有关gcrv疫苗的研究，目前主要集中在全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗三个方面，基因工程疫苗又包括亚单位疫苗、dna疫苗等。最早用于预防草鱼出血病的灭活疫苗是在20世纪60年代研发的“组织浆灭活疫苗”。随后，通过细胞培养获得的gcrv灭活疫苗的研制取得显著的成就。但灭活疫苗在灭活过程中可能会损害或改变有效的抗原决定簇，产生的免疫效果维持时间短，不产生局部抗体，需要多次免疫等缺点。基因工程疫苗具有抗体出现早、滴度高、持续时间长等优点，但是在使用过程中容易被动物体降解，稳定性弱，制备过程复杂，存在基因突变的风险，虽然针对gcrv-ii的基因工程疫苗种类繁多，但目前仍处于实验室研究阶段。

弱毒疫苗病原可在免疫动物体内繁殖，免疫原性好，免疫期长，成本低，使用方便。因此。在实际生产过程中，主要免疫的多为减毒疫苗，细胞弱毒疫苗的应用，对减少草鱼出血病的发生起到了积极的作用。而市面上获得法规许可的草鱼出血病疫苗均是针对gcrv-ⅰ型病毒。而主要流行则为ii型gcrv，现有疫苗已难于满足当前草鱼出血病防控的需求，急需要针对流行株型开发相应的免疫防控产品。

弱毒疫苗病原可在免疫动物体内繁殖，免疫原性好，免疫期长，成本低，使用方便。因此。自然弱毒株是在自然界中存在的，非人为改造的菌株，比目前以基因工程手段构建的缺失弱毒菌株更加稳定，不易产生毒力返强。

目前关于ii型gcrv弱毒疫苗的报道较少，高彩霞等人报道分离获得了一个ii型gcrv弱毒株，该弱毒株命名为草鱼呼肠孤病毒ii型cq180701(高彩霞等，两株ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的分离、鉴定及生物学特性比较，水产学报，2020；《两株ⅱ型草鱼呼肠孤病毒新分离株生物学特性的比较》，2018年中国水产学会学术年会论文摘要集，高彩霞等)，这两篇中涉及到的cq180701为同一株弱毒株。针对上述弱毒株，依然存在问题，一是该弱毒株可以导致稀有鮈鲫10％左右的死亡率，存在一定的毒力；二是，其对草鱼强度毒株攻击的免疫保护率为81％，保护力还有待提高。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒ii型弱毒株，所述毒株已于2018年11月30日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：草鱼呼肠孤病毒gcrv-gd1108，保藏编号：cctccno：v201867，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒ii型(本发明或称为gcrvii-gd1207)的应用，该毒株为ii型草鱼呼肠孤病毒的自然分离弱毒株，利用该毒株可用于制备草鱼呼肠孤病毒ii型的弱毒活疫苗，制得的疫苗无致病性、免疫原性好、刺激抗体迅速，保护力强。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

草鱼呼肠孤病毒ii型的分离、筛选和鉴定：

申请人自广东省佛山市三水区一草鱼养殖场健康草鱼肾脏组织中分离一株病毒，经细胞分离、电镜观察、全基因组带型分析、pcr扩增和部分基因节段序列测定鉴定证明为ii型草鱼呼肠孤病毒。所述毒株已于2018年11月30日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：草鱼呼肠孤病毒ii型，保藏编号：cctccno：v201867，地址：中国武汉武汉大学。

本发明提供的草鱼呼肠孤病毒ii型的生物学特性鉴定如下：

该病毒在ph2.6-8.0的广泛酸碱范围内较为稳定，病毒在56℃左右30min和在4℃保存1个月仍保存其传染性，对有机溶剂(如氯仿、乙醚)、非离子去污剂等具有很大的抵抗力；病毒提纯后分别经dna酶、rna酶和绿豆核酸酶消化，证实为双链rna(dsrna)病毒。病毒在cik、co等细胞上传代培养不产生cpe，超薄切片在电镜下观察，细胞胞浆中有大量病毒粒子呈散在分布，无囊膜，近球形，平面图像呈六边形或近圆形、直径约70nm。用该病毒细胞培养液感染草鱼不能导致其发病，也没有任何明显的临床症状，但病毒可以在草鱼体内复制并诱导感染草鱼产生较强的免疫应答反应。采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析其基因组带型显示，病毒基因组按分子量大小分为大、中、小三组，共有11个dsrna组成，呈现典型水生呼肠孤病毒基因组特征。对其s2节段编码的rna依赖性rna聚合酶(rna-dependentrnapolymerase,rdrp)基因序列进行分析发现，与其它gcrvii分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性均在94％以上。

一种草鱼呼肠孤病毒ii型的应用，包括利用该病毒制备由草鱼呼肠孤病毒ⅱ型引起的疾病的疫苗，制备成治疗或预防草鱼出血病的疫苗，或者与其他有效成分制备成联合疫苗。

优选的，上述应用中，所述疫苗的保护剂为明胶甘氨酸保护剂，即疫苗中明胶的终含量为1-3wt.％，甘氨酸含量为1-3wt.％，疫苗的稀释液为20％(g/ml)氢氧化铝胶生理盐水。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本疫苗所用毒株对草鱼无致病性，能较快的刺激机体产生针对同基因型的抗体。

2.本疫苗可以预防草鱼呼肠孤病毒ii型引起的疾病，对于同因型的免疫保护效果注射使用时达到95％以上，浸泡免疫是达到65％以上，口服免疫时达到40％以上，且不会对机体产生应激反应，也不存在毒力返强的风险，可应用于由于草鱼呼肠孤病毒ii型引发的出血病，特别是草鱼、青鱼病毒性草鱼出血病的预防，降低草鱼、青鱼草鱼出血病的发病率，提高草鱼、青鱼存活率。

3.本发明与已报道的草鱼呼肠孤病毒ii型cq180701弱毒株相比，本发明中的弱毒株作为制备弱毒疫苗具用更为显著的优势，一是本发明中涉及的ii型gcrv弱毒株对强度毒株攻击的免疫保护率在95％以上，而cq180701仅为81％；二是本发明中的弱毒株对草鱼和稀有鮈鲫均没有任何毒性，而cq180701可以导致稀有鮈鲫10％的死亡率，存在一定的毒力，安全性是弱毒疫苗株最需要考虑。

附图说明

图1草鱼呼肠孤病毒ii型分离的pcr鉴定结果示意图；

其中：泳道p1-p4分别为分离病毒盲传第1、2、3和4代病毒原液，nc为未感染病毒的cik阴性对照，m为dna分质量标准。

图2草鱼呼肠孤病毒ii型的电镜鉴定结果。

图3草鱼呼肠孤病毒ii型基因组的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

图4各组免疫鱼igm特异性抗体水平。

图5各组免疫鱼免疫相关基因相对表达量。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的实施例。结合实施对本发明做进一步的描述和论证。但是该实施例不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

草鱼呼肠孤病毒ii型的分离培养：

申请人从广东省佛山市三水区一养殖场购买的试验用健康草鱼，采用常规的pcr方法以排除试验鱼是否携带gcrv病原时，从其中一尾鱼中检测出grcvⅱ病毒(该病毒在本发明中或称为gcrvii-gd1207)。采取gcrv阳性鱼的肝、肾和脾，用pbs(ph7.2)将漂洗2次，称取重量，将组织剪成小块，用组织匀浆器磨碎，用m199培养基制成1:10的组织匀浆液,反复冻融3次后，依次经3000rpm/min、6000rpm/min和10000rpm/min，每次离心10min，去沉淀，上清液经滤膜孔径为0.22μm的微孔滤器过滤除菌备用。将长成致密单层的cik细胞去掉培养液后，用灭菌的pbs液洗2次，将上述过滤除菌的组织病毒液接种于细胞培养瓶内，28℃吸附1h，之后加入含5μg/ml胰酶的m199维持培养基，28℃恒温培养，每日观察细胞形态。病毒传代时，将病毒细胞培养物反复冻融2次，再按上述接种方法做传代培养。

病料接种cik细胞后，连续观察7d，没有出现明显的细胞病变，盲传至第4代，连续观察仍未出现明显的细胞病变。取第1、2、3和4代病毒原液进行rt-pcr检测(检测上游引物为：gcrv-ⅱ-f:5’-gctgatgctgcagacggctaaac-3’，下游检测引物为：gcrv-ⅱ-r:5’-taattgcctgctgcgctgact-3’)，均能扩增出特异性目的条带，大小为200bp左右，pcr产物经测序表明与gcrv-hz08、gd108、106、109等grcvⅱ分离株的同源性较高，而未感染病毒的cik细胞未能扩增出目的条带(图1)。

收集盲传至第二代病毒感染五天后的细胞，用戌二醛和四氧化锇双固定，梯度乙醇中脱水，苯二甲酸二丙烯酯包埋，制备超薄切片，在jem-100cxii透射电镜下观察和拍片。新分离株gd1207感染cik细胞超薄切片电镜观察：透射电镜下cik细胞胞浆中有大量病毒粒子呈散在分布，直径大约为70nm，平面图像呈六边形或近圆形，无囊膜结构，中央有一电子密度致密区域。病毒呈典型呼肠孤病毒粒子形态,大小及排列方式(图2)

病毒s2节段基因序列分析

分析gcrvii-gd1207与其它ⅱ型gcrv的s2基因序列和氨基酸序列同源性：

gcrvii-gd1207的s2节段核苷酸序列如seqidno.1所示。gcrvii-gd1207的s2节段核苷酸序列与ⅱ型gcrv的s2核苷酸序列同源性在95.79％至99.2％之间，氨基酸序列的同源性在94.49％至99.37％之间，其中与nh14的同源性最低，分别为95.79％和94.49％，核苷酸序列与106的同源性最高，为99.2％，氨基酸序列与jx02的同源性最高，为99.37％。与其它基因型gcrv分离株的s2节段核苷酸序列同源性在45.5％至52.5％之间。

gcrvii-gd1207rna的sds-page电泳分析

纯化病毒的rna提取按照trizol’srna抽提试剂盒说明书进行。sds-page分离胶浓度为10％，在80v条件下电泳15h，硝酸银染色后拍照。

结果显示，病毒rna样品经sds-page10h后，硝酸银染色结果显示，病毒基因组按节段大小分为三组，跑出11条条带，其中s1和s2由于分子量接近，存在共移现象，两条带不能完全分开，与文献中描述的hz08株、109株等ⅱ型gcrv的基因组带型分布比较相似(图3)。

综上，本发明的筛选出的病毒为草鱼呼肠孤病毒ii型弱毒株，该毒株已于2018年11月30日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：草鱼呼肠孤病毒ii型，保藏编号：cctccno：v201867，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

gcrvii-gd1207在制备成草鱼出血病活疫苗的安全性：

将制备好的cik细胞病毒液过滤除菌处理后稀释至gcrvii-gd1207病毒滴度为80copies/μl，然后注射平均体长为10-15cm(体重为20-25g)的草鱼和平均体长4±0.5cm(体重为5±0.5g)的稀有鮈鲫，同时均设注射无菌pbs的阴性对照组，草鱼每尾腹腔注射0.2ml，稀有鮈鲫每尾腹腔注射0.05ml，每组试验鱼均为20尾。试验期间水温控制在28℃左右，每天观察各组试验鱼的发病和死亡情况，连续3周。同时在试验过程中，对攻毒2w后未死亡或者发病的鱼分别采用rt-pcr进行gcrv病毒检测。

结果表明，感染病毒的草鱼和稀有鮈鲫及对照组均没有明显的临床症状，也无一例死亡。取感染病毒的的鱼内脏组织进行rt-pcr检测，能够扩增出一段200bp大小的条带，而对照组的草鱼和稀有鮈鲫则不能扩增出特异性目的条带，说明病毒可以在草鱼和稀有鮈鲫体内增值和复制。制备感染病毒鱼的组织液再一次感染cik细胞进行病毒分离后，rt-pcr检测均为gcrv阳性。

实施例3：

gcrvii-gd1207在制备成草鱼出血病活疫苗中的应用：

将健康未携带gcrv病毒的草鱼(平均体长为10-15cm，体重为20-25g)随机分为4组，注射免疫组，浸泡免疫组、口服免疫组和对照组，每组60尾。将弱毒疫苗病毒含量稀释至80copies/μl，注射免疫组每尾注射200μl，浸泡免疫组浸泡疫苗病毒终浓度液为10copies/μl，加1％的nacl浸泡1小时，口服疫苗先用含1×10³copies/μlgcrvii-gd1207病毒液通过喷雾的形式喷洒在常规的鱼饲料的表面，按每kg饲料喷洒100ml的病毒液，在室温下晾干1-2h，然后再用适量鱼肝油与喷洒有病毒液的饲料相拌，使鱼肝油包裹在饲料的最外层表面，保护病毒在饲料投入水中时不会立即释放到水体中，按照2％的鱼体重进行饲料投喂，连续投喂口服疫苗2周之后投喂正常饲料。对照组投喂日常饲料。免疫后在1week，2week，4week，8week四个时间点，分别从各个免疫组中随机取5尾草鱼，收集各组的血清、肝脏、脾脏及肾脏等组织，血清样品用于血清igm特异性抗体水平检测，内脏组织进行细胞内免疫相关基因相对表达量分析。

采用纯化的vp6蛋白作为抗原包被聚苯乙烯酶标板，4℃包被过夜；弃蛋白包被液，pbst清洗液洗涤5次，置于200r/min摇床中，清洗时间每次3～5min；使用50g/l脱脂牛奶37℃封闭2h，弃封闭液，加入1:200比例稀释的草鱼血清，每个血清样品设置3个重复孔，37℃孵育1.5～2h，反应结束后回收血清；加入1:10000稀释的hrp标记的鼠抗草鱼igm抗体，用pbs按比例，37℃反应1h；反应结束后，弃每孔中的抗体反应液，并加入90μltmb显色液，避光显色5-10min，加入显色终止液，并于5分钟内在酶标仪上读取od450nm的数值。以上每步反应结束后均使用pbst洗液洗涤每个反应孔，洗涤步骤为200r/min摇床中洗5次，每次3-5min。使用graphpadprism7.0软件进行数据分析并绘图。间接elisa测定血清中特异性抗体水平的高低，如图所示(图4)，免疫一周后，各免疫组草鱼特异性抗体较对照相比显著升高(p<0.001)，注射免疫组和浸泡免疫组特异性抗体水平在第二周时呈上升趋势，并到第8周时仍保持较高的特异性抗体水平。口服免疫组在第1周时特异性igm达到最高，之后逐渐下降。在2weeks之后，注射免疫组和浸泡免疫组特异性抗体水平均比口服免疫组高，具有显著的统计学差异(p<0.01)。

参照trizolreagent试剂盒使用说明书，提取上述采集的肝脏、脾脏、肾脏组织总rna。根据takaraprimescriptrt试剂盒操作说明反转录获得总cdna，将获得的cdna样品保存于-20℃。参照所用引物检测细胞免疫因子，引物序列由英潍捷基生物公司合成。所用引物序列如下(表1)，对实验草鱼机体中免疫相关因子的mrna表达水平进行检测，定量反应程序为95℃10min，(95℃30s，60℃40s)40循环，反应体系为：2×tbpremixextaqtm10μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，cdna2μl，ddh2o7.2μl，共20μl反应体系。测定结果使用δδct算法进行分析。

表1用于免疫相关基因相对表达量检测的引物信息

相对荧光定量pcr测定草鱼体内各种免疫基因表达情况，如图所示(图5)，在免疫1周后，各免疫相关基因在细胞内的表达较对照相比没有显著升高，从第2周开始，各免疫组草鱼的脾脏、肾脏内ifn,igm,mx,tlr3,tlr7等免疫相关基因mrna相对表达水平与对照相比差异极显著(p<0.001)，呈明显升高趋势，而肝脏内，除了igm表达量显著升高外(p<0.001)，其他免疫相关基因没有显著性的升高。4周时，肝脏内的ifn,mx,tlr3,tlr7免疫相关基因mrna相对表达量升高(p<0.001)，但igm表达量则下降。脾脏、肾脏内各免疫基因表达量依然维持在较高水平，到8周时，各免疫基因表达量出现下降趋势，其中ifn在脾脏，肾脏中显著下降，igm,mx,tlr3,tlr7虽有下降趋势，但与对照组相比，仍呈显著升高(p<0.001)。总体而验，注射免疫和浸泡免疫组的免疫相关基因的相对表达水平高于口服免疫组。以上结果表明，采用三种不同的免疫途径对草鱼进行弱毒疫苗的免疫，均可诱导草鱼机体产生适应性免疫反应。

将ⅱ型gcrv强毒株180404用m199培养基稀释至10³copies/μl，在免疫8weeks后，对各实验组及对照组的草鱼每组取30尾进行致死性攻击感染，腹腔注射稀释后的病毒悬液，每尾注射剂量为200μl，28℃水温下饲养试验鱼，每天观察并草鱼的活动情况，统计并记录草鱼的发病率和死亡率，计算攻毒14天后的相对免疫保护率，结果如表2所示。

根据公式：相对免疫保护率＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)x100％，计算各实验组的相对保护率(relativepercentsurvival,rps)。

表2各免疫组对gcrv-zh180404强毒株攻击感染的死亡率和相对保护率

实施例4：

弱毒株毒力返强研究

为检验弱毒疫苗的毒力及其稳定性,取病毒细胞培养液(滴度为10³copies/μl)，经腹腔注射30尾草鱼，每尾注射0.2ml，感染7d后随机解剖5尾，无菌取内脏组织，组织匀浆器磨碎，用m199培养基制成1:9(10％)的组织匀浆液,反复冻融3次后，依次经由4000rpm/min、8000rpm/min和12000rpm/min离心，每次离心5min，去沉淀，上清液经滤膜孔径为0.22μm的微孔滤器过滤除菌，滤液再经腹腔注射感染30尾草鱼，剩余草鱼继续观察发病情况。如此连续传代10次确定弱毒疫苗是否出现毒力返强。

对首次注射免疫的草鱼取内脏组织，采用pcr及qpcr检测方法检测鱼体内病毒载量，pcr结果显示，在200bp处有特异性目的条带(图1)，qpcr结果显示，组织的病毒载量为10²copies/μl，说明该弱毒疫苗能在鱼体内定植但不增殖，取第一代感染后的草鱼内脏来感染第二代草鱼之后，同样采用pcr及qpcr的方式检测gcrv-ii病毒，此时则检测不到相应的病毒。连续传代10代感染的草鱼均未出现死亡及明显的发病情况，这个弱毒株在鱼体内连续传代没有毒力返强的现象，具有较好的安全性。

序列表

<110>广东富伦德生物科技有限公司

<120>一种草鱼呼肠孤病毒ⅱ型弱毒株及其应用

<160>13

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<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggatgatgaaattgccgcactgg23

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

accgaccatgacgccctgatgt22

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gcaggggacaaaaagagattataga25

<210>5

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<212>dna

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<400>5

agccaacttaggaatagtagcaaaac26

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tctacctccaactccaccacc21

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ccagtagagaacacagcgaggt22

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tctccaagaatatcaggacgataa24