一种橡胶树白粉病抗性相关基因HbSGT1b及其应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种橡胶树白粉病抗性相关基因hbsgt1b及其应用。

背景技术：

橡胶树(heveabrasiliensis)在生长发育的过程中经常会受到各种生物和非生物胁迫的影响。由半知菌类粉孢属白粉菌(oidiumheveaesteinmmann)引起的橡胶树白粉病是一种常见的真菌性胁迫病害，在全球各个植胶区均有发现，主要侵染橡胶树的各幼嫩组织，使橡胶树叶片感病甚至造成大面积落叶现象，对天然橡胶的产量造成了很大影响。

sgt1(skp1g-2等位基因抑制子)的结构在所有真核生物中都高度保守。研究发现在植物、人和酵母中，sgt1蛋白质都是由5个结构域组成的：sgt1特异性基序(sgs)，四肽重复结构域(tpr)，两个不保守区(vr1和vr2)和cs基序(azevedoetal.,2002)。在植物中sgt1与各种蛋白质之间存在相互作用，包括分子伴侣(hsp70，hsp90)和某些scf泛素连接酶。其中sgt1在蛋白质折叠、蛋白质结构稳定性以及抗病性方面发挥作用，已有研究者发现sgt1参与了大麦对于白粉菌的抗病过程。sgt1中的cs基序与hsp90的atpase结构域结合。通过两基因的互作调节nb-lrr型r蛋白的稳定性。sgt1可以通过sgs结构域与hsp70相互作用。cs基序还可以与rar1的chord-ii结构域结合，sgt1、hsp90和rar1三者的结合可以提高r蛋白的稳定性以及调控部分r蛋白的抗性。sgt1的sgs基序在与mla1的lrr结构域的结合过程中起到调节作用。sgt1与scf泛素连接酶复合体之间存在相互作用，参与了蛋白降解的过程。sgt1与热休克蛋白的保守相互作用表明sgt1在分子伴侣介导的蛋白质的装配和不同蛋白质复合物的形成调节中发挥作用。然而，橡胶树中sgt1基因家族成员的结构与功能尚不清楚。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种橡胶树白粉病抗性相关基因hbsgt1b及其编码蛋白。

本发明的另一目的在于提供hbsgt1b基因在抗橡胶树白粉病中的应用；

本发明的第三目的在于提供hbsgt1b基因在促进植物花发育中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：本发明从巴西橡胶树品种热研73397叶片中克隆获得橡胶树白粉病抗性相关基因hbsgt1b基因，其cdna序列为以下(1)～(4)中任意所述的序列：

(1)seqidno:1所示的核苷酸序列；

(2)如seqidno:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

(3)在严格条件下与seqidno:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；其中，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；

(4)与(1)、(2)或(3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

测序结果表明，橡胶树hbsgt1b基因全长1161bp，其orf区长度为1068bp，编码355个氨基酸，所述基因编码的蛋白，其氨基酸序列如seqidno:2所示。等电点为5.34，亲水性平均值为-0.507。通过对hbsgt1b基因的生物信息学分析和受白粉菌侵染处理的表达模式判断，该基因参与橡胶树等植物白粉病和发育途径。

本发明还提供含有所述橡胶树白粉病抗性相关hbsgt1b基因的表达盒。

本发明还提供含有所述橡胶树白粉病抗性相关hbsgt1b基因的载体。

携带有所述目的基因的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(weissbach，1998，methodforplantmolecularbiologyviii，academypress，newyork，第411-463页；geiserson和corey，1998，plantmolecularbiology，2^ndedition)。

本发明还提供含有所述橡胶树白粉病抗性相关hbsgt1b基因的工程菌、转基因细胞系。

本发明还提供所述橡胶树白粉病抗性相关hbsgt1b基因在提高植物(例如，拟南芥、橡胶树等)抗白粉病和开花发育能力中的应用。

本发明还提供所述蛋白在制备抗橡胶树白粉病药物中的应用。

本发明还提供所述橡胶树白粉病抗性相关hbsgt1b基因在制备转基因植物中的应用。

本发明还提供一种转基因植株的构建方法，包括以下步骤：

(1)提取橡胶树叶片中的总rna，反转录得到cdna第一链；

(2)以cdna第一链为模板，hbsgt1b-f和hbsgt1b-r为引物，所述引物hbsgt1b-f的核苷酸序列如seqidno:3所示，hbsgt1b-r的核苷酸序列如seqidno:4所示，具体为：

hbsgt1b-f：5′-tacactctattctcttagcccaagc-3′

hbsgt1b-r：5′-aaccctagaagagcaaaaatctgac-3′

通过pcr扩增反应获得白粉病抗性相关hbsgt1b基因的cdna序列，并将其cdna片段连接至pmd18-t载体中并转化大肠杆菌dh5α菌株中进行克隆和测序验证，测序验证正确的质粒命名为hbsgt1b-18t；

(3)以hbsgt1b-18t质粒为模板，hbsgt1b-ecori-f和hbsgt1b-bamhi-r为引物扩增hbsgt1b基因的orf(序列如seqidno:9所示)，所述hbsgt1b-ecori-f的核苷酸序列如seqidno:5所示，hbsgt1b-bamhi-r的核苷酸序列如seqidno:6所示，具体为：

hbsgt1b-ecori-f：5′-ggaattcatggccagcgagttgg-3′(下划线为ecori酶切位点)

hbsgt1b-bamhi-r：5′-cgggatccatattcccatttgttc-3′(下划线为bamhi酶切位点)

扩增产物经ecori和bamhi双酶切后连接至经相同酶切后的表达载体，利用电击法将带有hbsgt1b基因orf的质粒转化农杆菌gv3101菌株；

(4)利用转基因技术将带有hbsgt1b基因的农杆菌转化目标植物拟南芥col-0，获得转基因稳定遗传植株。

本发明进一步提供橡胶树白粉病抗性相关hbsgt1b基因的荧光定量pcr检测引物，引物hbsgt1b-qf的序列如seqidno:7所示，引物hbsgt1b-qr的序列如seqidno:8所示，具体为：

hbsgt1b-qf：5′-tgttccactgagtgctacac-3′

hbsgt1b-qr：5′-ccagggacattgatggtaac-3′

分别检测橡胶树胶乳、花、树皮、茎和叶片五种组织，经过白粉病侵染后橡胶树叶片hbsgt1b基因的表达情况，结果表明，hbsgt1b基因在花中表达量最高，在白粉菌不同侵染级别叶片下调表达，在白粉菌侵染后6h表达量最高，随后下降。

本发明具有以下优点：本发明通过对hbsgt1b基因转化拟南芥进行该基因的功能研究，验证了转基因拟南芥具有恢复提早开花的能力。该基因可用于橡胶树和其他作物的白粉病抗性和成花发育转基因研究中。本发明与橡胶树白粉病抗性相关hbsgt1b基因来自橡胶树，不会产生基因漂移，对环境影响较小，为提高植物抗病性和开花发育提供新的基因资源。

附图说明

图1为本发明实施例1中hbsgt1b与大麦hvsgt1、拟南芥atsgt1a、atsgt1b、酿酒酵母scsgt1和水稻ossgt1保守区的氨基酸序列同源性比对结果；

图2为本发明实施例2中利用荧光定量pcr检测橡胶树不同组织、不同白粉病侵染叶片级别和白粉菌不同侵染时间处理后，hbsgt1b基因的表达情况；

图3为本发明实施例3中野生型(col-0)和hbsgt1b转基因拟南芥株系的表型比较。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1：橡胶树白粉病抗性相关hbsgt1b基因的克隆

利用rt-pcr技术从巴西橡胶树品种热研7-33-97叶片中克隆获得橡胶树白粉病抗性相关hbsgt1b基因，具体方法如下：

1、提取橡胶树叶片中的总rna，反转录得到cdna第一链。

2、以cdna第一链为模板，hbsgt1b-f和hbsgt1b-r为引物，通过pcr扩增反应获得白粉病抗性相关hbsgt1b基因的cdna序列。

引物序列如下：

hbsgt1b-f：5′-tacactctattctcttagcccaagc-3′

hbsgt1b-r：5′-aaccctagaagagcaaaaatctgac-3′

使用2×taqpcrmastermix(天根生化)进行pcr扩增，反应体系为：cdna模板2μl，引物f、r(10μmol/l)各1μl，2×pcrmastermix25μl，加ddh2o至50μl。

pcr扩增程序为：94℃变性3min；94℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

3、扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，凝胶回收纯化，并克隆到pmd18-t载体上，经菌落pcr检测，送上海立菲生物技术有限公司进行测序验证，测序验证正确的质粒命名为hbsgt1b-18t。测序结果表明，橡胶树白粉病抗性相关hbsgt1b属于植物sgt1家族成员，hbsgt1b基因cdna序列(seqidno:1)为1161bp；其orf(开放阅读框)为1068bp(seqidno:3)，编码由355个氨基酸组成的蛋白hbsgt1b(seqidno:2)。

hbsgt1b与与大麦hvsgt1、拟南芥atsgt1a、atsgt1b、酿酒酵母scsgt1和水稻ossgt1保守区的氨基酸序列同源性比对结果见附图1。

实施例2：hbsgt1b基因在橡胶树不同组织、受不同白粉病侵染叶片级别和白粉菌不同侵染时间处理表达分析

采用荧光定量pcr方法检测橡胶树胶乳、花、树皮、茎和叶片五种组织，经过不同白粉病侵染叶片级别和白粉菌不同侵染时间处理表达情况。

组织采样：海南大学儋州教学基地采集橡胶树品种reyan73397成龄无乙烯刺激的开割树采集其胶乳、树皮、根、茎、叶、花相关组织。

不同白粉病侵染叶片级别：海南大学儋州教学基地采集橡胶树品种reyan73397白粉病病级0、1、3、5和7级叶片。

白粉菌侵染处理：选取长势一致无病害无外伤的橡胶树reyan73397芽接苗稳定期叶片，隔离一周后，将白粉菌(ho-73)涂抹到橡胶树芽接苗嫩叶上，对照组与实验组隔离白粉菌。接种后在0、0.1、1、3、6、12、24、48、72h随机采集3片实验组叶片，对照组同步采样。

根据hbsgt1b基因序列设计如下荧光定量pcr检测引物：

hbsgt1b-qf：5′-tgttccactgagtgctacac-3′(序列如seqidno:7所示)

hbsgt1b-qr：5′-ccagggacattgatggtaac-3′(序列如seqidno:8所示)

hbactin-f：5′-gatgtggatatcaggaagga-3′(序列如seqidno:10所示)

hbactin-r：5′-catactgcttggagcaaga-3′(序列如seqidno:11所示)

以hbactin(genbank登录号：ho004792)为内参基因。使用biorad公司的cfx-96荧光定量pcr仪进行荧光定量pcr，反应程序为：95℃预变性30s；94℃5s，60℃20s，72℃20s，进行45个循环。扩增结束后绘制熔解曲线，从50℃逐渐升温至95℃，升温速度0.2℃/s，全过程检测荧光信号。hbsgt1b基因的表达量采用公式qt＝2-ct(hbactin)-ct(hbsgt1b)计算，ct表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

荧光定量pcr检测结果表明，结果表明，hbsgt1b基因在花中表达量最高，在白粉菌不同侵染级别叶片下调表达，在白粉菌侵染后6h表达量最高，随后下降，见附图2。

实施例3：转hbsgt1b基因拟南芥植株的获得及表型鉴定

以实施例1制备的hbsgt1b-18t质粒为模板，hbsgt1b-ecori-f：5′-ggaattcatggccagcgagttgg-3′(下划线为ecori酶切位点)与hbsgt1b-bamhi-r：5′-cgggatccatattcccatttgttc-3′(下划线为bamhi酶切位点)为引物，扩增hbsgt1b基因的orf，扩增产物经hindiii和bamhi双酶切后连接至经相同酶切后的表达载体，构建好的重组质粒命名为hbsgt1b-oe-gfp，利用电击法将重组质粒hbsgt1b-oe-gfp转化农杆菌gv3101菌株；通过农杆菌介导法将hbsgt1b基因转化到野生型拟南芥植株col-0和atsgt1b突变体中进行过表达，对转基因阳性植物进行鉴定，对含目标基因的t3代阳性植株进行筛选及表型分析，结果表明过表达hbsgt1b基因的转基因拟南芥可以部分缓解atsgt1b突变体提早开花表型，为hbsgt1b基因在其他植物上的应用提供良好的基础，见图3。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>海南大学

<120>一种橡胶树白粉病抗性相关基因hbsgt1b及其应用

<130>1

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1161

<212>dna

<213>橡胶树(未知)

<400>1

tacactctattctcttagcccaagcttcaacaatggccagcgagttggctgagaaggcaa60

aagaagcaatcatcgatgatgatttcgaactggccttggatttatattccaaagccatcg120

aattggaccccaccaacgctgattacttcgccgaccgagctcaggcctatattaaactca180

ataacttcactgaggccgttgctgatgctaacaaggctattgagttggcttcttcgtttg240

ccaaggcatatttgcgtaaaggtactgcctgtatgaagcttgaagaatatcatacagcca300

agagagcccttgaaatcggtgcatctttggctccagatgattccagatttaccaagttga360

tcaaagaatgtgatctgcacatagcagaggagttttatgatcaaaggaagtccttggcac420

caaatgttccactgagtgctacacctgcatctgttggttcctgtaagaatgaaacaatct480

cttcagaaaaaccaaaatacagacatgaatactaccagaagccagaggaagtggttttaa540

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<210>2

<211>355

<212>prt

<213>橡胶树(未知)

<400>2

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151015

aspphegluleualaleuaspleutyrserlysalailegluleuasp

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130135140

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210215220

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225230235240

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260265270

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290295300

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325330335

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340345350

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355

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<400>3

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<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<400>4

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<213>人工序列(未知)

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<212>dna

<213>人工序列(未知)

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<213>橡胶树(未知)

<400>9

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<213>人工序列(未知)

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<213>人工序列(未知)

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