一种评估蜕膜NK细胞分泌功能的方法与流程

本发明具体涉及一种评估蜕膜nk细胞分泌功能的方法。

背景技术：

正常妊娠期间，母体免疫系统在母胎界面会做出一系列免疫调节机制，从而使母体对类半异体同种移植物的胎儿产生免疫耐受，但若是母胎界面免疫调节功能失衡，则会发生自然流产。与同一配偶连续发生2次或2次以上的自然流产者称为复发性流产(rsa)，rsa严重影响育龄女性的身心健康。近年来，自发流产的发生率在人群中呈现上升趋势。rsa的病因则是多种多样的，包括：生殖道解剖异常、配偶的染色体异常、母体血栓形成障碍、母体免疫功能异常以及各种内分泌紊乱等。然而，仍有40％-50％的rsa患者找不到明显的原因，称为不明原因的复发性流产(ursa)。

文献报道显示，在这类患者中，绝大多数都存在蜕膜nk细胞分泌功能下降的情况。蜕膜nk细胞是早期妊娠蜕膜中的优势淋巴细胞，在孕早期其比例最多可占到所有蜕膜淋巴细胞的70％。与外周血中的nk细胞不同，蜕膜nk细胞的主要功能就是分泌因子，以达到促进血管新生、胚胎生长的效果。

之前文献报道的衡量蜕膜nk细胞分泌功能的方法主要是qpcr法测蜕膜nk细胞分泌因子基因表达和elisa法测蜕膜nk细胞上清分泌因子含量。

但是qpcr法原理是在pcr反应体系中，将荧光染料特异性地掺入dna双链与双链dna结合后，发射荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不会发射任何荧光信号。从而保证与pcr产物的增加完全同步。但是，由于荧光染料可与所有的双链dna相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的准确性。qpcr法具有以下缺点：1.实验容易产生假阳性；2.对引物特异性要求较高；3.灵敏度相对较低；4.在提取蜕膜nk细胞dna时不能避免其他细胞dna的污染。

elisa法原理是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，再进行定量测定。但其缺点也是相当明显的：1.elsa实验步骤繁多，从而造成干扰因素众多，实验重复性不好；2.elisa众多步骤均需要手工操作，并且一次实验仅能测一种因子的表达量，费事费力；3.在收集蜕膜nk细胞上清时不能避免其他细胞分泌的细胞因子的混杂。

技术实现要素：

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种评估蜕膜nk细胞分泌功能的方法。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种评估蜕膜nk细胞分泌功能的方法，包括以下步骤：

1)提取患者原代蜕膜淋巴细胞；

2)将所获得的蜕膜淋巴细胞进行分选，获得蜕膜nk细胞；

3)将获得的蜕膜nk细胞在含有100ng/mlil-15的rpmi-1640培养基中培养三天，第三天晚上加入细胞内刺激因子；

4)第四天收集蜕膜nk细胞，并用cd3、cd56、ifn-γ、vegfα的流式抗体将其染色；

5)在流式细胞分析仪上圈出cd3—cd56⁺的细胞群体，分析该细胞群中ifn-γ、vegfα的表达。

进一步地，步骤1)具体为：

1.1)在不明原因复发性流产(ursa)患者清宫当天，收集蜕膜，用ph＝7.4的无菌磷酸盐缓冲液漂洗；

1.2)将蜕膜组织剪碎成1立方毫米的小碎片，用pbs重悬为组织混合液，再利用1mg/ml的胶原酶和0.01mg/ml的dna酶对组织混合液消化40分钟；

1.3)消化后的组织液用70μm的无菌滤器过滤，然后将过滤后的组织液加入等体积的淋巴细胞分离液ficoll上，保持液面分界清晰，再用离心机离心，转速为500g，离心30分钟；离心完成后吸取中间的细胞层，即为所获得的蜕膜淋巴细胞。

进一步地，步骤2)具体为：

2.1)将macs分选试剂盒的分选缓冲液加入细胞沉淀，300g，离心5min；

2.2)去上清，沉淀细胞计数，每1×10⁷个细胞加入40μl分选缓冲液和10μlmacs分选试剂盒生物素化抗体，重悬，4℃放置5min；

2.3)再加入30μl分选缓冲液和20μlmacs分选试剂盒磁珠每1×10⁷个细胞，重悬，4℃放置10min；

2.4)用500μl分选缓冲液先润洗磁柱，再将步骤2.3)得到的细胞悬液加入磁柱，最后再用500μl分选缓冲液冲洗一遍；

2.5)沿磁柱留下的细胞悬液中的细胞即为nk细胞，再加入分选缓冲液，300g，5min清洗一遍即可。

进一步地，步骤3)具体为：将获得的蜕膜nk细胞在含有100ng/mlil-15、体积分数为10％胎牛血清和体积分数为1％的链霉素/青霉素双抗的rpmi-1640培养基中培养3天，于第3天晚上加入细胞刺激因子混合物即佛波醇酯12-十四酸酯13-乙酸酯和离子霉素。

进一步地，步骤4)具体为：

第4天收集蜕膜nk细胞，400g，离心5min，pbs清洗，向沉淀中加入100μlpbs和荧光标记的流式抗体：cd3-pecy7、cd56-apc，混匀，室温下孵育30min；pbs清洗后加入固定破膜液，室温孵育1小时，pbs清洗；向沉淀中加入100μlpbs重悬再加入荧光标记的胞内细胞因子流式抗体：ifn-γ-fitc、vegfα-pe，混匀，室温下孵育30min。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提取出人原代蜕膜nk细胞后通过流式抗体cd3、cd56的标记，确定出蜕膜nk细胞群，再观察分析群体中细胞分泌细胞因子ifn-γ和vegfα的表达，从而检测蜕膜nk细胞分泌功能。本发明检测方法操作简便快捷，省时省力；圈定的细胞群里可以明确是蜕膜nk细胞，避免了其他细胞对实验结果的影响；而且还可以同时进行多种细胞因子的测定，速度更快，精度更高。

(2)本发明采用流式细胞仪进行检测，因为不同的流式抗体可以带多种不同荧光，流式细胞仪可以同时接收多种经荧光素染色的细胞所发射的荧光，经计算机分析处理可以得到各种信息参数，且十分迅速；可以准确得到蜕膜nk细胞群体并同时检测蜕膜nk细胞分泌的多种细胞因子的水平。

(3)本发明检测时所需要的蜕膜一般为无痛清宫后的丢弃物，提高了样本的利用率；相比较而言，本发明需要的组织量较少，这样就避免了由于组织量少做不出检测而造成的人力物力浪费。

附图说明

图1是本发明评估方法的流程图。

图2是将过滤后的组织液加入等体积的淋巴细胞分离液ficoll的示意图，其中，图2(a)是过滤后的组织液加入等体积的淋巴细胞分离液ficoll初始状态的示意图，图2(b)过滤后的组织液加入等体积的淋巴细胞分离液ficoll之后出现分层的示意图。

图3是本发明采用的macs人蜕膜nk细胞分选的分选装置。

图4是本发明采用的beckman流式细胞分析仪。

图5是正常流产患者和不明原因复发性流产患者蜕膜nk细胞中vegfα和ifn-γ阳性比例的数据统计图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。以下实施例中所用到的试剂，试剂盒，仪器等均能够通过商业途径获得；其中，1m＝1mol/l；pbs指的是：ph＝7.4的无菌磷酸盐缓冲液。

一种评估蜕膜nk细胞分泌功能的方法，包括以下步骤：

(1)提取患者原代蜕膜淋巴细胞：

1.1)在不明原因复发性流产(ursa)患者清宫当天，收集蜕膜，用ph＝7.4的无菌磷酸盐缓冲液(pbs)漂洗2遍；

1.2)将蜕膜组织用灭菌过的剪刀剪碎成1立方毫米的小碎片，用pbs重悬为组织混合液，再利用1mg/ml的胶原酶iv(购自sigma–aldrich)和0.01mg/ml的dna酶(购自sigma–aldrich)对组织混合液消化40分钟；

1.3)消化后的组织液用70μm的无菌滤器过滤，然后将过滤后的组织液小心的加入等体积的淋巴细胞分离液ficoll上，如图2(a)所示，注意要保持液面分界清晰，再用离心机离心，转速为500g，升降速均为1，离心30分钟；离心完成后吸取中间的细胞层，即为所获得的蜕膜淋巴细胞，如图2(b)所示；

1.4)将所获得的蜕膜淋巴细胞用无菌pbs清洗2遍；

(2)分选出蜕膜淋巴细胞中的nk细胞：

2.1)将macs分选试剂盒的分选缓冲液加入细胞沉淀，300g，离心5min；

2.2)去上清，沉淀细胞计数，每1×10⁷个细胞加入40μlmacs分选试剂盒中的分选缓冲液和10μlmacs分选试剂盒生物素化抗体，重悬，4℃放置5min；

2.3)再加入30μl分选缓冲液和20μlmacs分选试剂盒磁珠每1×10⁷个细胞，重悬，4℃放置10min；

2.4)用500μl分选缓冲液先润洗磁柱，再将步骤2.3)得到的细胞悬液加入磁柱，最后再用500μl分选缓冲液冲洗一遍磁柱；

2.5)沿磁柱留下的细胞悬液中的细胞即为nk细胞，再加入分选缓冲液，300g，离心5min，清洗一遍即可；

(3)培养原代nk细胞并流式检测其胞内生长因子：

3.1)将获得的蜕膜nk细胞在含有100ng/mlil-15(il-15能够使蜕膜nk细胞处于活化状态)、体积分数为10％胎牛血清和体积分数为1％的链霉素/青霉素双抗的rpmi-1640培养基中培养3天，于第3天晚上加入细胞刺激因子混合物(产品编号00-4970-03；invitrogen)即佛波醇酯12-十四酸酯13-乙酸酯(pma)(使其终浓度为81nm)和离子霉素(使离子霉素终浓度为1.34μm，m即为浓度单位mol/l的缩写)以诱导蜕膜nk细胞产生大量细胞因子，并保留在细胞内；

3.2)第4天收集蜕膜nk细胞，400g，离心5min，pbs清洗2次，向沉淀中加入100μlpbs和流式抗体：cd3-pecy7(5μl/test；货号300420；biolegend)，cd56-apc(5μl/test；产品编号17-0567-42；invitrogen)，混匀，室温下孵育30min；本发明也可以使用其他荧光标记的流式抗体，但要保证每个抗体的荧光标记颜色是不一样的，便于区分。流式抗体使用量：每100μl细胞混悬液中加入5μl流式抗体；若抗体量加入不足则不能保证所有抗原均能与抗体反应；若抗体加入过量则会造成浪费。

3.3)pbs清洗后加入固定破膜液500μl，室温孵育1小时，pbs清洗一次；

3.4)向沉淀中加入100μl无菌pbs重悬再加入胞内细胞因子流式抗体：ifn-γ-fitc(5μl/test；货号502507；biolegend)、vegfα-pe(5μl/test；ic2931p；r&dsystems)，混匀，室温下孵育30min；也可使用其他荧光标记的流式抗体，但要保证所需每个抗体间的荧光标记颜色是不一样的，便于区分。以上抗体使用量：每100μl细胞混悬液中加入5μl流式抗体；若抗体量加入不足则不能保证所有抗原均能与抗体反应；若抗体加入过量则会造成浪费。

3.5)pbs清洗2次，向沉淀中加入300μlpbs重悬后加至流式管中，上机，利用流式检测技术圈出cd3—cd56⁺的细胞群体，分析该细胞群中ifn-γ、vegfα的平均荧光强度以明确蜕膜nk细胞分泌功能。

据报道，绝大多数ursa的患者都存在蜕膜nk细胞分泌功能下降的情况即蜕膜nk细胞分泌功能异常，因此，蜕膜nk细胞分泌功能异常，有可能是不明原因复发性流产(rsa)的病因之一。

收集的蜕膜nk细胞分泌因子数据如图5所示，由图5a可知，与健康女性、胚胎染色体异常的rsa患者相比，ursa患者蜕膜nk细胞中ifn-γ阳性比例最小；ursa患者蜕膜nk细胞中ifn-γ阳性比例的平均值m1为：9.80％，标准差sd1为1.93％，故而推断出蜕膜nk细胞分泌功能异常时胞内因子ifn-γ阳性比例的截断值为：m1+2sd1＝13.66％；由图5b可知，与健康女性、胚胎染色体异常的rsa患者相比，ursa患者蜕膜nk细胞中vegfα阳性比例最小；ursa蜕膜nk细胞中vegfα阳性比例的平均值m2为：53.13％，标准差sd2为6.01％，故而推断出蜕膜nk细胞分泌功能异常时胞内因子vegfα阳性比例的截断值为：m2+2sd2＝65.15％。即利用上述流式法测蜕膜nk细胞分泌功能时，若蜕膜nk细胞中ifn-γ阳性比例低于13.66％或者vegfα阳性比例低于65.15％时，则蜕膜nk细胞存在分泌功能障碍。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。