用于同步检测CYP3A4基因两个SNP位点多态性的方法与流程

本发明涉及基因检测
技术领域：
，尤其是涉及用于同步检测cyp3a4基因两个snp位点多态性的引物组及检测方法。
背景技术：
：细胞色素p450酶系存在于多种组织细胞的光面内质网上，它是一种具有混合功能的膜蛋白，隶属于氧化酶超级家族。p450酶系不仅参与了胆酸、脂肪酸、类固醇以及前列腺素类等内源性物质的代谢过程，还影响着药物、外毒素、致癌因素等外源性物质的体内过程。目前，人体中已有12种p450酶系亚型被报道，其中cyp1、cyp2与cyp3的代谢酶作用最强。cyp3a占据了人类肝脏内p450酶系总量的25％，重点分布在肝脏细胞或柱状空肠绒毛上皮细胞上。cyp3a4是cyp3a四种基因型之一，芬太尼即为其代谢产物。芬太尼自20世纪60年代人工合成以来，在分娩镇痛领域广泛应用，但是，在临床发现应用相同剂量的芬太尼后其镇痛效果及不良反应如恶心呕吐、呼吸抑制等方面，存在明显差异。有研究指出，芬太尼在产妇镇痛效果上的个体差异性与细胞色素p450cyp3a4*1g(rs2242480)的单核苷酸多态性(snp)密切相关。cyp3a4*1g(rs2242480)首次在日本发现，基因定位于第7号染色体q22.1，长约27kbp，其基因结构包括13个外显子及12个内含子。它是一个具有功能意义的突变，在中国人群中的分布率为22.1％。由于cyp3a4*1g(rs2242480)基因突变造成cyp3a4活性降低，减少对芬太尼代谢，进而镇痛效应增强。研究表明，gg型相较于ga、aa型，芬太尼镇痛效果有所减弱。cyp3a4*1g(rs2242480)基因的多态性对应用芬太尼分娩镇痛的患者个体化用药有一定的影响，临床上可以在分娩镇痛之前对产妇进行cyp3a4*1g(rs2242480)snp调查，根据不同分型定出芬太尼所需剂量，以提高镇痛效果，从而最终实现更好地保护新生儿与产妇健康的目的。环孢霉素，主要用于肾脏的抗排异反应。这种药物应用具有较窄的治疗指数，个体间表现出较大的药物代谢动力学差异。而这种差异与人体内cyp3a4*1b(rs2740574)的活性和表达差异有关。cyp3a4*1b(rs2740574)单核苷酸多态性位点位于基因的启动子上，它的突变更可能影响其蛋白的表达。研究表明，突变的cyp3a4在钙调磷酸酶的调节下，mrna转录水平增强，酶活性增强；携带有cyp3a4*1b(rs2740574)野生型aa(*1/*1)的肾移植手术后患者，环孢霉素在体内的代谢能力比纯合突变型低，所需剂量显著高于杂合突变型ag(*1/*1b)和纯合突变型gg(*1b/*1b)。因此手术前可对患者进行cyp3a4*1b(rs2740574)位点突变调查，根据不同基因型指导肾移植术后抗排斥反应。pcr(polymerasechainreaction，聚合酶链式反应)已被广泛应用于医学、遗传学、微生物学乃至整个生命科学中。目前，可针对cyp3a4基因的*1g(rs2242480)和*1b(rs2740574)位点分别设计pcr检测试验，以进行基因突变情况的检测。由于每个pcr反应只针对一个snp位点，故检测通量较低。多重pcr是在常规pcr基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对及两对以上的引物，同时扩增多个核酸片段。多重pcr在微生物、遗传病、肿瘤药物基因组学有着重要的应用。技术实现要素：为了解决上述缺陷，本发明的技术目的是提供一种同步检测cyp3a4基因两个snp位点多态性的引物组及检测方法，有益于检测通量的提高。为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：首先提供一种用于同步检测cyp3a4基因两个snp位点多态性的引物组，包含两组引物对：第一组引物对的上游引物的核苷酸序列由seqidno.1所示，下游引物的核苷酸序列由seqidno.2所示；第二组引物对的上游引物的核苷酸序列由seqidno.3所示，下游引物的核苷酸序列由seqidno.4所示。本发明的引物组尤其是针对cyp3a4基因的*1b(rs2740574)和*1g(rs2242480)位点的基因特异性扩增所特别设计的，第一组引物对是用于检测cyp3a4基因*1b(rs2740574)的引物对，第二组引物对是用于检测cyp3a4基因*1g(rs2242480)的引物对，采用多重pcr技术可以同时同步、高效率、高特异性、准确地扩增出所述基因在所述位点的特异性基因片段，再通过测序，检测其基因多态性。使用该引物组进行多重pcr扩增反应时，cyp3a4基因*1b(rs2740574)和*1g(rs2242480)位点同时在一个扩增体系中进行扩增，即同时扩增包含*1b(rs2740574)和*1g(rs2242480)两个snp位点。可以最大程度地提高检测通量。通常情况下，利用上游引物seqidno.1和下游引物seqidno.2来扩增cyp3a4基因*1b(rs2740574)时，相应扩增产物的片段长度为792bp；利用上游引物seqidno.3和下游引物seqidno.4来扩增cyp3a4基因*1g(rs2242480)时，相应扩增产物的片段长度为399bp。进而对该dna片段进行切胶回收，并进行序列的测定。经过多次试验证明，本发明提供的引物对具有较好的特异性和扩增准确性，可以应用于制备同步检测cyp3a4基因两个snp位点多态性的试剂盒，通过制备成成品试剂盒，可以在采集了样品试验后，快速准确地得出cyp3a4基因两个snp位点多态性的结果。所述试剂盒，主要是包括本发明提供的引物组，其中引物的终浓度优选为20-300nm。其他pcr试剂可以根据常规技术选择，例如优选的技术方案是，还包含dna聚合酶、pcr缓冲液、4种dntp(deoxy-ribonucleosidetriphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)的混合物和超纯水。其中dna聚合酶的用量为0.5-5u，每种dntp的终浓度均为50-500μm。dna聚合酶可以选用taq、kodfx等dna聚合酶，如此，pcr缓冲液即为与所选用dna聚合酶相对应的浓缩缓冲液，具体浓缩程度可选用2×、5×或10×。举例来说，选用kodfx这一dna聚合酶，且选用2×的浓缩缓冲液时，为配制上述pcr反应体系，体系中各个组分的用量可以为：dna聚合酶0.5～2μl、pcr缓冲液20～30μl、各种dntp的混合物5～30μl、2个引物对的混合物2-15μl、dna5～1000ng，以及适量超纯水，以补水至50μl。以及可以为按照相同比例配制的其他体积大小。在制作成品试剂盒时，还可以根据实际需要，选择性的配制用于提取样品dna的试剂或者专业的dna提取试剂盒；可以更方便快捷地得到待检测样品的dna，增强本发明的检测成品试剂盒的使用方便和快捷性。所述待测样品可以为任何含有基因组dna的血液、细胞、组织或口腔拭子样本。在本发明提供的引物组的基础上，本发明进一步提供一种用于同步检测cyp3a4基因两个snp位点多态性的检测方法，采用所述的引物对进行pcr检测。根据一种优选的实施方式，所述检测方法的具体步骤是：(1)从待测样品中提取基因组dna，作为扩增模板；(2)配制包含所述引物组和所述扩增模板的多重pcr反应体系；(3)对所述多重pcr反应体系进行多重pcr扩增反应，得到pcr产物；(4)根据所述pcr产物，测定cyp3a4基因两个snp位点多态性。其中pcr扩增反应的最优选的反应条件为：92-96℃：1～10min；93-98.5℃：5～40s；51～68℃：10～60s；67～72℃：10s～5min；共25～45个循环；68～72℃：0～30min。在上述方法和条件的基础上，本发明的检测方法可以快速、有效、方便地同时同步得到待检测样品的cyp3a4基因*1b(rs2740574)和*1g(rs2242480)位点突变情况，可用于非诊断目的。根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(4)测定基因多态性，包括：电泳检测所述pcr产物，以验证所述pcr产物的扩增片段大小；验证正确后对所述pcr产物进行序列测定，以获得所述待测样本的cyp3a4基因*1b(rs2740574)和*1g(rs2242480)位点突变情况。详细地，可用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳检测pcr扩增的片段。同现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：(1)提高检测通量：普通pcr每个反应只针对一个snp位点，而多重pcr可以同时检测2个以上snp位点，通过一次反应可以对cyp3a4基因*1b(rs2740574)和*1g(rs2242480)位点进行检测。如此，可以同时检测90多例样本，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。(2)降低成本：本发明可以将pcr反应体系由2个体系/程序缩减至1个体系/程序，故减少了dna聚合酶、dntp等试剂和耗材的使用量，可降低检测成本。附图说明图1是本发明一实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果；图2是本发明一实施例提供的pcr产物序列测定结果中针对*1b(rs2740574)位点突变的部分；图3是本发明一实施例提供的pcr产物序列测定结果中针对*1g(rs2242480)位点的突变部分。具体实施方式为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明。非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例1设计并合成引物组，包括以下步骤：步骤1.1：基于cyp3a4基因*1b(rs2740574)和*1g(rs2242480)位点，设计特异性扩增基因snp位点突变区域的上下游引物及相应测序引物。对于设计引物，采用primerquest和primerpremier5.0对引物进行设计及二聚体、茎环错配分析，在包含突变位点的两端设计引物，2对引物的退火温度基本保持一致。本实施例所提供的引物组覆盖了cyp3a4基因*1b(rs2740574)和*1g(rs2242480)位点突变区域。由于小的序列变化会导致引物扩增效率显著降低、特异性变差，故分别针对不同snp位点分别设计多重pcr引物组，并在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和位点包含情况，选取了如下述表1所示的扩增效果最佳的引物组。表1步骤1.2：合成1.1中设计好的引物组。实施例2从待测样本中提取基因组dna，包括如下步骤：步骤2.1：用口腔拭子收集口腔脱落细胞或用采血管收集新鲜外周血样本。本实施例中，样本来源为正常人体。步骤2.2：采用天根口腔拭子基因组dna提取试剂盒(dp322)，或，采用血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)，从样本中提取基因组dna，并采用np80-touch(德国implen)测定dna的浓度及纯度，保存基因组dna。实施例3同步检测cyp3a4基因*1b(rs2740574)和*1g(rs2242480)位点的多重pcr检测方法，包括以下步骤：步骤3.1：以步骤2.2中所得的基因组dna为扩增模板，并采用步骤1.2中合成的引物组，来配制多重pcr反应体系。本实施例采用东洋纺(toyobo)公司kodfx酶系(货号：kfx-101)中dna聚合酶及缓冲液为基本原料，在酶系说明书中扩增体系的基础上，通过调整引物浓度、dntp浓度、缓冲液浓度、酶用量，来配制多重pcr扩增体系，这一反应体系的具体组成如下述表2所示。当然，反应体系等比例放大/缩小均在本发明实施例的保护范围内；更换其他dna聚合酶系，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。表2试剂成分体积2×pcrbufferforfx25μl2mmdntp8μlprimermix5μlkodfx(1u/μi)1μldna1μl水补水至50μl各引物等摩尔混合，引物浓度是10微摩尔；dna模板量可调整，本实施例中基因组dna可采用20ng。步骤3.2：按照下述表3所示的多重pcr反应条件，设置pcr仪器的程序。表3步骤3.3：利用程序设好的pcr仪器，对步骤3.1中配制的多重pcr反应体系，进行多重pcr扩增反应，得到pcr产物。实施例4电泳检测，包括以下步骤：步骤4.1：琼脂糖凝胶电泳检测步骤3.3中得到的pcr产物，以验证pcr产物片段的大小。检测结果如图1所示，图1中所示出的jyk、zk、lxj等主要用于区分不同的待测样本，图1的最左侧列展示了标尺条，最右侧列展示了空白对照组的pcr产物的电泳结果，中间各列展示了不同样本的pcr产物的电泳结果。根据各个产物亮带所在位置与左侧标尺条的对比，可以识别出各个产物亮带所对应的是哪一个snp位点的扩增产物。比如，自上向下的2条亮带，通常是分别对应于cyp3a4基因*1b(rs2740574)和*1g(rs2242480)位点的pcr扩增产物。请参考图1，根据空白组的电泳结果可知，环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个待测样本的电泳结果可知，存在的2个亮带分别对应于cyp3a4基因*1b(rs2740574)和*1g(rs2242480)位点的pcr扩增产物，亮带数量与理论保持一致；2个亮带清晰且间隔明显，不同亮带间无重叠、无拖影等，亮带效果良好。如此，可以说明利用步骤1.1中设计的pcr扩增引物组进行pcr扩增时，仅生成了预期的目标产物，而未生成其他无关产物，引物组设计合理。步骤4.2：验证pcr产物片段的大小正确后，可针对pcr产物进行序列测定。实施例5序列测定，包括以下步骤：步骤5.1：步骤4.2中验证pcr产物片段的大小正确后，将步骤3.3中得到的pcr产物送至测序公司进行序列测定，得到.ab1格式的测序结果。步骤5.2：通过chromas序列分析软件分析步骤5.1中得到的测序结果，获得cyp3a4基因*1b(rs2740574)和*1g(rs2242480)位点突变情况。部分测序结果如图2-3所示。请参考图2，图2示出了cyp3a4基因*1b(rs2740574)位点处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图2中的框线部分，可知cyp3a4基因*1b(rs2740574)位点处的基因型为aa型。请参考图3，图3示出了cyp3a4基因*1g(rs2242480)位点处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图3中的框线部分，可知cyp3a4基因*1g(rs2242480)位点处的基因型为ga型。实施例6：试剂盒的配制根据上述实验结果，本实施例提供一种优选的用于同步检测cyp3a4基因*1b(rs2740574)和*1g(rs2242480)位点多态性的试剂盒，所述试剂盒中包含以下试剂：1、多重pcr引物组：第一组引物对：f上游引物(10μm)，r下游引物(10μm)；第二组引物对：f上游引物(10μm)，r下游引物(10μm)；2、kodfx(1u/μl)；3、2×pcrbufferforfx：4、dntp：5、样品dna提取试剂；6、样品dna采集收纳盒(如包含口腔拭子和拭子收纳盒)；7、超纯水。所述试剂在试剂盒中合理安放，再放入试剂盒的使用说明，所述使用说明包括待测样品dna的采集步骤，采集后放入收纳盒中，再进行dna提取步骤，最后按照上述的检测方法进行多重pcr扩增过程。需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。序列表<110>北京和合医学诊断技术股份有限公司<120>用于同步检测cyp3a4基因两个snp位点多态性的方法<130>ss191-209<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列()<400>1agtcagaagggatgacatgcaga23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列()<400>2agctctgtgttgctctttgctgg23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列()<400>3ttcccttagggatttgagggctt23<210>4<211>27<212>dna<213>人工序列()<400>4tcagagccttcctacatagagtcagtg27当前第1页12