本发明涉及一种生物柴油及其制备工艺，尤其是涉及一种采用微生物发酵技术生产生物柴油的方法。
背景技术：
生物柴油具有不含硫、可再生和含氧量高等特点，是一种优良的石化柴油替代品。传统的生物柴油大多以大豆、菜籽、棉籽等草本植物，以及棕榈、文冠果等木本植物为原料进行制备，存在“与民争地、与人争粮”的问题，使得生物柴油的产量受到限制。相对传统生物柴油生产方法，微生物生产生物柴油的优势在于廉价环保再生、易于大规模连续化生产等。因此，利用微生物油脂制备生物柴油具有良好的发展前景和广阔的应用价值。
微生物油脂，又称单细胞油脂(singlecelloil，sco)，是由许多产油微生物在一定条件下将碳水化合物转化而成并贮存在菌体内的油脂。产油微生物分布广泛、种类繁多，包括藻类、霉菌、酵母、细菌。其中常用的是酵母菌和霉菌。浅白色隐球酵母(cryptococcusalbidus)、茁芽丝孢酵母(trichospironpullulans)、胶粘红酵母(rhodotorulagiutinis)等是常见用来生产生物柴油的酵母菌，土霉菌(aspergillusterreus)、紫瘫麦角菌(clavicepspurpurea)、深黄被孢霉(mortierellaisabellina)等是常见的产油霉菌。微生物油脂的合成是一个生化过程，即从乙酰-coa羧化酶催化羧化反应开始，经过多次链的延长，或再经过去饱和作用等得到微生物油脂。若微生物要在体内积累油脂，除了氮源匿乏之外，还需要两个必备条件：一是充足的乙酰-coa，作为脂肪酸合成的前体；二是充足的nadph，在脂肪酸链延长中发挥重要的还原作用。微生
现有技术有人用生物酶单独或者共同催化酵母油脂合成脂肪酸甲酯作为生物柴油。然而酶的价格很高，生产成本高难以在产业化上应用。
技术实现要素：
针对上述生物柴油燃烧的不足之处，本发明利用微生物技术对生酵母油脂进行改性，通过直接发酵法进行一步改性，成本大大降低，并且还会产生一些额外的成分如表面活性剂等，从而进一步改善油品的品质。成本低，适合工业化生产
为实现上述目的，本发明提供一种生物柴油组成物及其制备工艺。
脂肪酸甲酯是一种和石化柴油溶解性能较强的溶剂。可在燃烧室内壁金属表面形成一层油膜，阻隔湿气，防止生锈。十六烷值：55-60，氧含量：10％，各种性能与国五石化柴油接近，是一种高十六烷值含氧生物柴油。
脂肪酸甲酯是用动物油脂或植物油脂经甲醇酯化或转酯化等一系列加工处理而制成的一种液体。由c12-c18为主要馏分的脂肪酸甲酯。本发明气温＞20℃时可使用动物油或和植物油混合加工的脂肪酸甲酯，密度：(20℃)0.88kg/升，冷凝点：＞8℃，十六烷值：57，是一种黄色澄清透明液体，具有一种温和的特有气味，结构稳定，没有腐蚀性，性能和石化柴油相接近，是一种可再生资源。在国五柴油中分别添加5％，10％、15％、20％，30％称为b5生物柴油，b10生物柴油，b15生物柴油、b20生物柴油，b30生物柴油五个型号。冬季必须使用植物大豆油脂肪酸甲酯，环境温度20℃以上才能使用动物油脂或餐厨废弃油脂酯化反应的脂肪酸甲酯。
中国专利200810204495公开了一种产油酵母菌株及其制备生物油脂的方法，涉及菌种为皮状丝孢酵母(trichosporoncutaneumcx1)，保藏号为cgmccno.2527。该菌株可以利用玉米秸杆水解液低成本发酵产生生物油脂。本发明将此菌株作为研究起点，但是本发明的复合菌剂可以用于任何酵母油脂的生物转化。
本发明提供一种直接用于对生物柴油发酵改性的复合菌剂，其特征在于：
包括黑曲霉(aspergillusniger)pasp0501以及长孢被孢霉cgmccno.5070。
所述黑曲霉(aspergillusniger)pasp0501由中国专利2005100109414公开，保藏日期：2005年5月16日，保藏号：cgmccno.1373。已知用途是对普洱茶的品质进行改进。
所述长孢被孢霉cgmccno.5070由中国专利201210004558.8公开，该菌株已在中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)申请了专利菌种保藏，保藏编号为cgmccno.5070。
本发明团队发现，黑曲霉(aspergillusniger)pasp0501具有直接将酵母油脂生物转化成脂肪酸甲酯的作用，但是效率很低。在后续的研究中，我们意外发现，和长孢被孢霉cgmccno.5070共发酵，可以大大提高转化效率，得到较高的脂肪酸甲酯得率。并且，我们设计的反应体系是油水不稳定体系在搅拌中发酵，反应结束后，只需要静置分层即可。经检测，因为发酵的油状物中杂质并不多，并且很可能还含有能优化油品品质的油溶代谢物，因此分层后的油层甚至不需要再次精炼，可以直接使用即可作为品质较好的燃料。
本发明的优点：
本发明的微生物共发酵直接对生物油脂，尤其是酵母油脂进行生物转化改性成为高品质的生物柴油。其成本低，便于产业化操作，并且对环境非常友好，从油脂到甲酯化全部都是生物改性过程，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1皮状丝孢酵母(trichosporoncutaneumcx1)发酵产生油脂
种子培养：从平板上选取一环菌落接入种子培养基，30℃，180rpm，培养24小时。种子培养基组份质量百分比为，葡萄糖5％，酵母粉0.1％，硫酸铵2％，磷酸二氢钾4％；七水硫酸镁0.5；ph6.0，摇瓶装液量10％，培养温度为30℃，培养转速200转/分钟，培养时间为24小时得到种子液；
发酵培养：以10％的上述种子液接种量接入酶水解液，摇床培养，培养时间为3天。所述酶水解液为：利用玉米秸秆，经过稀硫酸在200℃下，预处理45min，获得的预处理后的秸秆，再经过纤维素酶的酶水解生成水解液，经过碱性物质调节ph，ph为5.0～6.0；所用的酶为accellerase；其中纤维素酶活是67.8fpu，纤维二糖酶活为152iu。
反应结束后，将培养液于8000r/min离心5min，收集湿菌体，用蒸馏水洗涤2次，并于105℃烘至恒重，得到用于油脂提取的干菌体.
实施例2：酵母油脂的分离
按照下述比例：按1g干菌体加入4mol/盐酸10ml的比例配制好，于78℃水浴处理h，冷却后加入2倍体积的氯仿:甲醇(1:1)提取液，充分振荡后离心，取氯仿层，加等体积0.1％氯化钠溶液，混匀，离心，取氯仿层，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发除去氯仿即得酵母油脂。
实施例3：生物改性酵母油脂甲酯化成为生物柴油
种子培养：黑曲霉(aspergillusniger)pasp0501以及长孢被孢霉cgmccno.5070分别进行种子液培养，方法均为：从平板上选取一环菌落接入种子培养基，30℃，180rpm，培养24小时。种子培养基组份质量百分比为，葡萄糖5％，酵母粉0.1％，硫酸铵2％，磷酸二氢钾4％；七水硫酸镁0.5；ph6.0，摇瓶装液量10％，培养温度为30℃，培养转速200转/分钟，培养时间为24小时左右得到108cfu/ml的种子液。
按照如下重量份数，将28份实施例2所得的酵母油脂，1份甲醇，30份无机盐葡萄糖溶液在搅拌状态下，分别均按照5％的接种量接种黑曲霉(aspergillusniger)pasp0501以及长孢被孢霉cgmccno.5070的种子液，保持搅拌，32℃条件下发酵处理36小时以充分反应，其中在第12和第24小时的时候，分别再次补入1重量份的甲醇。
所述无机盐葡萄糖溶液组份质量百分比为，葡萄糖6％，氯化钠1％，硫酸铵2％，磷酸二氢钾2％。
在实践中发现，甲醇对菌株具有毒性，所以分3次加入以降低其对发酵的影响。此外，虽然菌株可以利用酵母油脂作为碳源，但是本发明的目的在于生物转化，在培养体系中加入一定葡萄糖以让菌株更高效进行生物转化。
36小时反应结束后，静置2小时等待水油分离，取油状部分，即为成品，并准备进行色谱分析。
实施例4：
对比例1：制备生物柴油：
将28份实施例2所得的酵母油脂，1份甲醇，30份无机盐葡萄糖溶液在搅拌状态下，但是不接种黑曲霉(aspergillusniger)pasp0501以及长孢被孢霉cgmccno.5070的种子液，保持搅拌36小时，其中在第12和第24小时的时候，分别再次补入1重量份的甲醇。
其他步骤同实施例3。
对比例2：制备生物柴油过程中仅单独黑曲霉(aspergillusniger)pasp0501，其他步骤同实施例3。
对比例3：制备生物柴油过程中仅单独孢被孢霉cgmccno.5070，其他步骤同实施例3。
实施例5：
将实施例3-4中制备好的取油状部分5ul与300ul0.6g/l十七碳酸甲酯-正己烷(内标)溶液混匀，再加入无水乙醇300ul，振荡混匀，取该混合液2ul作为色谱分析样品，进行色谱分析。
色谱条件：gc-14b气相色谱仪，supelcowaxtm-10毛细管柱，fid检测器，n2载气流速1ml/min，分流比50:1，进样口温度245℃，检测器温度250℃，程序升温，初温180℃，保持时间30s,10/min℃升至250℃，保持时间4min。
计算实施例3组、对比例1-3在的甲醇醇解后最终得率，每个实验组重复3次，结果如表1所示。
表1不同组别最终甲酯得率
从表1我们可以看到，和对照组比，实施例1的最终甲酯得率大大增加；对照组中，对比例1组和对比例3组未测出甲酯，说明单独孢被孢霉cgmccno.5070或者不发酵，并不能得到甲酯。单独的黑曲霉(aspergillusniger)pasp0501具有能够直接利用酵母油脂，转化成脂肪酸甲酯，但是效率很低，当共培养单独孢被孢霉cgmccno.5070时候效果大大增强。推测该两种菌可能具有特定的代谢通道，能够加强黑曲霉中代谢酵母油脂的酶活性。
实施例6：
将制备得到的生物柴油送到润英蓝地计量检测(上海)有限公司进行检测，结果如下：
闭口闪点：＞80℃，十六烷值：＞55，运动黏度：1.9-6mm2/s，密度(20℃)：0.843，热值：和国标柴油相接近。废气污染物排放比普通国标柴油ch减少20％，co：减少12％，pm2.5：减少12％，so2：减少20％，多环芳烃：减少13％，硝化多环芳烃：减少50％，酸值：0.5-5mg，koh/g，氧含量：0.5-3.3％。
可见，是一种节能、环保产品。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例。
若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。