一种富集和分离四氯乙烯脱氯菌的方法及应用与流程

本发明属于卤代有机污染原位微生物修复领域，具体涉及一种富集和分离四氯乙烯脱氯菌的方法及应用。

背景技术：

四氯乙烯(pce)因其良好的溶解性、挥发性，被广泛用作化工合成过程的溶剂和金属加工、干洗行业洗涤剂等。在生产使用时，由于操作和处理不当导致大量pce进入环境中，造成严重的环境污染，特别是土壤和地下水环境。同时pce因其较强的环境毒性和对人体的致癌效应，被列为2a类致癌物。目前针对pce污染的原位修复主要有原位物理修复(如原位热修复)、原位化学修复(过氧化氢、零价铁等)和原位微生物修复(如原位生物刺激和生物添加)等。其中原位生物修复法以其修复成本低，反应条件温和，无二次污染等优势，在修复领域备受关注。但现有的研究表明，仅投加电子供体和碳源，刺激原位生物天然衰减的效果不如高效生物添加的明显，所以高效的工程微生物对于原位生物修复十分重要。

针对pce污染严重的土壤和地下水厌氧环境的修复，厌氧微生物脱卤过程在原位微生物修复中起关键作用。pce的厌氧脱氯主要分为两个过程：pce逐步脱去两个氯原子产生二氯乙烯(dce)和dce进一步脱氯产生一氯乙烯(vc)，甚至是无毒的乙烯(ethene)。现发现许多种微生物参与第一阶段的pce脱氯过程，如dehalococcoides、dehalobacter、dehalobium、desulfitobacterium、sulfurospirillum、desulfuromonas、geobacter等；但这其中只有dehalococcoides可以进一步对dce进行完全脱氯至ethene，而且这个过程比较缓慢且受上游的pce、tce抑制。所以如果需要实现对pce的高效且完全脱毒，必须要获得高效的dehalococcoides菌剂。

原位环境中存在种类、功能丰富的dehalococcoides，作为仅能利用卤代有机物脱卤呼吸生长的专性厌氧脱卤微生物，广泛存在于各类土壤、水体沉积物厌氧环境中，但丰度较低，在干净的湖泊沉积物中仅1.0～5.0×10^-3％；在电子垃圾污染场地中，最高丰度仅达到0.43％，无法达到对污染高效修复的效果。而且dehalococcoides的脱氯速度较低(0.018～0.091mmcl^-/day)，脱卤呼吸除了需要电子受体(卤代有机物)外，还需要严格的厌氧环境，辅以醋酸盐、氢气和微量元素(特别是维他命b12)。同时高浓度pce对其有着毒害作用，所以如何有效的富集和培养dehalococcoides菌株，获得高效工程微生物也是亟待解决的问题之一。

为实现对专性厌氧脱卤菌的富集，需要为微生物提供卤代有机物作为电子受体，对于dehalococcoides可以使用氯代乙烯、氯代丙烯、氯苯和多氯联苯进行专性培养富集。对于使用多氯联苯进行的富集，效率很低，曾有研究者使用pcbs进行富集，在经过将近一年的富集，dehalococcoides丰度仅达到3.4～14.8％。现有研究常利用氯代乙烯(pce、tce)富集dehalococcoides，因为培养基并不能满足最利于厌氧脱卤过程，部分效果并不好。李海军曾利用tce(0.45mm)作为电子受体在以na2s和fe(ii)为还原剂的培养条件下进行研究，最后得到dehalococcoides丰度仅0.14％；pengetal.2019在仅投加无机还原剂na2s的培养基中进行研究，采用pce低浓度(0.25mm)逐步投加的方式，在大约45天后，dehalococcoides丰度<50％，低于geobacter；hermonetal.2019利用添加酵母提取物的厌氧盐培养基培养地下水样品，但因培养基中含有so4^2-，虽实现dehalococcoides丰度从11.8上升至40％，但培养过程中，参与硫酸盐还原的desulfovibrio丰度显著，一度达到56％；leeetal.,2016采用na2co3作为缓冲剂的培养基进行培养富集，最终得到dehalococcoides丰度仅为1％。

此外，现有的研究中利用主要脱氯功能菌群对pce进行完全脱氯时，其脱氯速度与效果不佳，如leeetal.,2016从污染河流沉积物获得的混菌体系在大约0.16mmpce浓度下需要80天才将pce完全脱氯产生ethene；kimetal.,2010同样来自沉积物的混菌amec-4p则需要超过120天才能完成对pce的完全脱氯；在amosetal.,2009研究中接种了相似混菌的反应器中则出现大量的cis-dce累积；而hermonetal.2019获得的混菌体系，在55天内pce(mol％)尚未达到100％，均无法达到十分理想的脱氯速度与效果。

因此，亟需实现pce完全脱氯的高效菌株的有效富集培养，对于卤代有机物厌氧微生物修复技术领域具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明针对原位环境中大部分dehalococcoides丰度较低，而传统的菌株分离技术无法对pce脱氯微生物实现高效富集分离的问题，旨在提供一种高效富集和分离四氯乙烯完全脱氯菌的方法及应用；本发明实现了四氯乙烯完全脱氯菌的高效富集培养，采用本发明富集方法得到的脱氯混合菌在第26天可将pce完全脱氯产生ethene，表现出优异的脱氯效果，且脱氯混合菌中dehalococcoides的丰度达到68.87％；并进一步利用生态学原理，从富集的脱氯混合菌中分离纯化获得高效pce脱氯菌：地杆菌geobacter。本发明为实现高效富集和分离卤代有机物脱卤功能微生物和获得工程菌剂提供了有利的技术指导，对于卤代有机物厌氧微生物修复技术领域具有重要的应用价值。

本发明的首要目的是提供一种高效富集四氯乙烯完全脱氯混合菌的方法。

本发明的另一目的是提供上述在富集四氯乙烯完全脱氯菌方面的应用。

本发明的另一目的是提供上述方法富集得到的四氯乙烯完全脱氯混合菌。

本发明的再一目的是利用上述富集得到的混合菌，提供一种分离纯化地杆菌geobacter的方法

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案实现的：

本发明提供了一种高效富集四氯乙烯完全脱氯混合菌的方法，是从四氯乙烯污染物中采集沉积物样品，接种至以0.5～1mm四氯乙烯为唯一电子受体的dl-乳酸钠厌氧脱氯液体培养基中完全厌氧培养，待培养液中四氯乙烯完全脱氯后，保持同等培养条件，进行2～3次传代至培养液中无沉积物残留；

所述dl-乳酸钠厌氧脱氯液体培养基包含盐、微量元素供体、ph调节剂、缓冲试剂、氧指示剂、有机还原剂、维他命、dl-乳酸钠和l-半胱氨酸；

所述缓冲试剂为nahco3和tris乙磺酸。

优选地，所述四氯乙烯污染物为pce污染土壤或pce污染地下水。

优选地，所述沉积物样品与dl-乳酸钠厌氧脱氯液体培养基的用量比为4～5：400～500。

优选地，所述培养温度为30～35℃。

优选地，所述盐为nacl、mgcl2·6h2o、kh2po4、nh4cl、kcl、cacl2·2h2o中的一种或几种。

优选地，所述盐的用量为2～3g/l。

优选地，所述微量元素供体选自fecl2·4h2o、cocl2·6h2o、mncl2·4h2o、zncl2、h3bo3、na2moo4·2h2o、nicl2·6h2o、cucl2·2h2o、na2seo3·5h2o、na2wo4·2h2o中的一种或几种。

优选地，所述微量元素供体用量为3～4g/l。

优选地，所述ph调节剂为盐酸和naoh；所述液体培养基的ph为7～7.5。

优选地，所述nahco3用量为2～3g/l；所述tris乙磺酸的用量为2～3g/l。

优选地，所述氧指示剂为0.1％的刃天青。

优选地，所述0.1％的刃天青的用量为0.2～0.3ml/l。

优选地，所述有机还原剂为二硫苏糖醇；所述有机还原剂的用量为0.05～0.1g/l。

优选地，所述维他命包含维生素h、维生素b、维生素b6、维生素b1、维生素b2、维生素b3、维生素b5、对氨基苯甲酸、硫辛酸、维他命b12；所述维他命的用量为0.4～0.5mg/l。

优选地，所述dl-乳酸钠的浓度为50～60％，在液体培养基中的加入量为1～2ml/l，dl-乳酸钠是作为培养基的电子供体和碳源。

优选地，所述l-半胱氨酸在液体培养基中的浓度为0.15～0.25mm，l-半胱氨酸作为生物解毒剂，缓解卤代有机物对生物体的毒性。

作为一种最优选的方案，上述富集四氯乙烯完全脱氯混合菌的方法，是从黑臭水体中采集沉积物样品，取5ml接种至500ml以1mm四氯乙烯为唯一电子受体的dl-乳酸钠厌氧脱氯液体培养基中，其配方如表1所示，保证培养环境的完全厌氧，培养温度为30℃，同时监测pce脱氯情况，观察其是否产生ethene，待培养液中四氯乙烯完全脱氯后，保持同等培养条件，进行3次传代至培养液中无沉积物残留。

表1

本发明采用pce作为唯一电子受体，选择性富集具有pce脱卤能力的菌群；表1所示dl-乳酸钠厌氧脱氯液体培养基中采用nahco3作为体系缓冲液，保持体系ph处于7～7.5，利于脱卤微生物的生长；微量元素和维生素可为脱卤酶提供合成必需的底物；另外添加的有机还原剂和过量的无机还原剂na2s，使得环境处于完全厌氧状态，保证脱卤微生物的存活，有利于脱卤过程的发生。

优选地，所述保证培养环境的完全厌氧是往培养基中加入na2s，na2s除了作为还原剂外，还是部分脱卤微生物的脱卤过程所需硫的重要来源。

上述方法获得的混合菌培养5天，pce(mol％)可以达到100％，并全部转化为cis-dce，仅产生少量的trans-dce(<0.2％)；在第6天过后，cis-dce逐渐开始被脱氯，产生vc和ethene，并在第26天基本将pce完全脱氯产生ethene。

因此，本发明还请求保护上述方法在富集四氯乙烯完全脱氯菌方面的应用。

本发明还请求保护上述方法富集得到的四氯乙烯完全脱氯混合菌。

进一步地，上述混合菌包含dehalococcoides。

在经过pce富集培养后，目标功能菌—dehalococcoides的丰度达到68.87％，其他具有pce脱氯功能的菌群丰度均小于1％。本方法有效的实现了对能将pce完全脱氯至ethene的功能菌dehalococcoides的高效富集。

本发明通过群落分析发现，得到的混合菌中存在着其他pce脱氯微生物——geobacter(0.3％)。根据已有的研究发现，geobacter与dehalococcoides在厌氧脱氯过程底物利用情况相近，无法有效分离，为获得此阶段的pce快速脱氯微生物geobacter，必须设计一套新的分离方法。

因此，基于上述方法富集得到的四氯乙烯完全脱氯混合菌，本发明还提供了一种从上述富集的四氯乙烯完全脱氯混合菌中分离得到地杆菌geobacter的方法，其具体包括如下步骤：

s1.将上述得到的混合菌在上述以四氯乙烯为唯一电子受体的dl-乳酸钠厌氧脱氯液体培养基中完全厌氧培养，培养至pce(mol％)为100％，传至下一代，再保持同等培养条件进行两次传代；

s2.将步骤s1传代后的脱氯菌接种到以0.5～1mm四氯乙烯为唯一电子受体，5×10⁴pa氢气为电子供体的醋酸钠厌氧脱氯液体培养基中，30～35℃培养，往培养基中加入的na2s，在该条件下培养pce(mol％)为20～40％，进行传代，保持同等培养条件进行三次传代；

s3.将步骤s2传代三次后的培养液中加入50ppm的抗生素杀灭杂菌；

s4.在含抗生素的培养液中传代两次后，进行梯度稀释纯化操作得到地杆菌geobacter；

其中，所述醋酸钠厌氧脱氯液体培养基与上述dl-乳酸钠厌氧脱氯液体培养基的区别在于碳源为三水合醋酸钠。

作为一种最优选的醋酸钠厌氧脱氯液体培养基方案，如表2所示。

表2

在上述分离过程中，混合菌pce脱氯行为发生变化，pce脱氯全部转化为cis-dce，无trans-dce检出，从群落结构分析中得知geobacter丰度的剧烈变化：开始使用分离策略后，geobacter丰度从dl-乳酸钠厌氧脱氯液体培养基中最后一代的16.09％上升到醋酸钠厌氧脱氯液体培养基第一代中的46.64％，进行梯度稀释纯化前，geobacter丰度已达95.42％，而dehalococcoides仅剩0.74％。

优选地，所述抗生素为氨苄青霉素。

优选地，步骤s4所述梯度稀释纯化设置7个浓度梯度，监测10^-7浓度下的四氯乙烯(mol％)，当四氯乙烯(mol％)为20％时再进行下一次梯度稀释，经15次梯度稀释后得到纯菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明大量富集了实现pce完全脱氯的目标功能微生物：dehalococcoides，并保持良好活性，富集的混合菌表现出较理想的脱氯能力和效果；进一步利用生态学原理，指导分离纯化高效pce脱氯的目标微生物：地杆菌geobacter，为实现高效富集和分离卤代有机物脱卤功能微生物和获得工程菌剂提供了有利的技术指导，对于卤代有机物厌氧微生物修复技术领域具有重要的应用价值。

附图说明

图1为富集得到的dehalococcoides混合菌对pce完全脱氯能力测定图；

图2为富集培养后脱氯功能菌群丰度图；

图3：a为r/k选择微生物生长曲线示意图；b为geobacter与dehalococcoides厌氧脱氯过程生长曲线；

图4为geobacter分离过程中微生物群落变化。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1从城市黑臭水体高效富集四氯乙烯完全脱氯混合菌

1、实验方法

(1)富集方法

取5ml从城市pce污染黑臭水中采集沉积物样品，接种至以1mmpce为唯一电子受体的dl-乳酸钠厌氧脱氯液体培养基(其配方如表1所示)，为减少接种时外界氧气带来的影响，保证培养环境的完全厌氧，往培养基中加入过量的na2s。培养温度为30℃，同时监测pce脱氯情况，观察其是否产生ethene。待培养液中pce完全脱氯后，保持同等培养条件，进行两次传代至培养液中无明显沉积物残留即得到四氯乙烯完全脱氯混合菌。

表1

pce脱氯情况计算公式：

上述各式中：cn(pce)为第n次监测时体系pce浓度；cn(tce)为第n次监测时体系tce浓度；cn(cis-pce)为第n次监测时体系cis-dce浓度；cn(trans-pce)为第n次监测时体系trans-dce浓度；cn(vc)为第n次监测时体系vc浓度；cn(ethene)为第n次监测时体系ethene浓度。

(2)群落分析方法

为证明富集得到pce脱氯功能菌为含有目标功能菌——dehalococcoides的混合菌群，分别对原城市黑臭水体沉积物样品以及经pce培养富集后获得的混合菌群进行群落分析。

群落分析方法：对富集前后得到混合菌群的菌体通过离心收集，提取所有菌体的dna，将提取的dna作为模板，用通用引物集对高突变区v4-v5区进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行测序，对测序得到的结果通过mothur进行序列组装和过滤，并使用qiime进行后续处理和下游分析。最后根据greengenes数据库对获得的序列进行分类，得到富集前后体系中群落结构。

2、实验结果

(1)从沉积物的初代培养液顶空部分检测到大量的ethene产生，并且pce可以完全脱氯至ethene，证明获得含dehalococcoides的菌群。图1为富集得到的dehalococcoides混合菌对pce完全脱氯能力测定图，从图1中可以看出，经过两次传代后，获得的混合菌培养5天pce(mol％)可以达到100％，并全部转化为cis-dce，仅产生少量的trans-dce(<0.2％)；在第6天过后，cis-dce逐渐开始被脱氯，产生vc和ethene，并在第26天基本将pce完全脱氯产生ethene，可见本发明中富集的混合脱氯菌表现出较理想的脱氯能力和效果。

(2)图2为富集培养后脱氯混合菌菌群丰度图，从图中的群落组成情况来看，在经过pce富集培养后，目标功能菌——dehalococcoides的丰度达到68.87％，其他具有pce脱氯功能的菌群丰度均小于1％。本方法有效的实现了对能将pce完全脱氯至ethene的功能菌dehalococcoides的高效富集。

此外，发明人通过上述富集方法从pce污染土壤中富集四氯乙烯完全脱氯混合菌，其中dehalococcoides的丰度都高于60％，表明本发明对pce污染土壤和地下水中pce完全脱氯菌的富集具有普适性。

实施例2从pce脱氯至cis-dce过程中分离得到地杆菌geobacter

从图1可以看出pce的完全脱氯过程分为两个阶段，后一阶段仅能由dehalococcoides完成，而在第一阶段pce脱氯速度较快(0.4mmcl^-/day)，并且未观察到明显的trans-dce(部分dehalococcoides脱氯产物)产生，证明其中必然存在非dehalococcoides参与pce的脱氯；通过群落分析发现，混合菌中存在着其他pce脱氯微生物—geobacter(0.3％)。由于geobacter与dehalococcoides在厌氧脱氯过程底物利用情况相近，无法有效分离，为获得此阶段的pce快速脱氯微生物geobacter，必须设计一套新的分离方法。

1、分离纯化方法

首先将实施例1富集得到的含dehalococcoides混合菌在原培养条件下，培养5天，即pce(mol％)恰为100％时，传至下一代；保持上述培养条件再传两代，筛去仅参与dce脱氯至ethene的dehalococcoides。然后接种到以1mmpce为唯一电子受体，5×10⁴pa氢气为电子供体的醋酸钠厌氧脱氯液体培养基(其配方如表2所示)中，30℃培养，同样需要往培养基中加入过量的na2s，并监测其pce脱氯情况。在该条件下培养至pce(mol％)达到20-40％(大约3天)，进行传代，保持上述条件传代3次后，往培养液中加入50ppm的ampicillin杀灭杂菌。

在含抗生素的培养液中传代两次后，进行梯度稀释纯化操作：设置7个浓度梯度，监测10^-7浓度下的pce(mol％)，当pce(mol％)约为20％时进行下一次梯度稀释，经15次梯度稀释后得到纯菌。

在分离培养期间定期进行混菌中微生物群落组成分析。

表2

2、实验结果

(1)根据经典生态学原理—r/k选择可知：当生长环境不稳定，生长时间较短时，r选择生物胜出；当生长环境稳定，生长时间充足下，效率高的k选择生物会胜出，如图3的a图所示，红色线代表快速生长的r选择微生物，蓝色代表底物利用效率高的k选择微生物。从图3的b图可以看出geobacter与dehalococcoides的生长模式分别与r、k选择微生物相近。在分离过程中，混合菌pce脱氯行为发生变化，pce脱氯全部转化为cis-dce，无trans-dce检出，并且传代时间从3天逐渐变为1.5～2天。

(2)图4为geobacter分离过程中微生物群落变化图，从群落结构分析中可以得知geobacter丰度的剧烈变化：开始使用分离策略后，geobacter丰度从dl-乳酸钠厌氧脱氯液体培养基中最后一代的16.09％上升到醋酸钠厌氧脱氯液体培养基第一代中的46.64％，进行梯度稀释纯化前，geobacter丰度已达95.42％，而dehalococcoides仅剩0.74％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。