基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品及其制备方法与流程

基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品及其制备方法
技术领域
[0001]
本发明属于13、18、21三体综合征特征基因核酸检测领域，尤其涉及一种基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品及其制备方法。


背景技术：

[0002]
染色三体综合征是当前优生优育政策的大敌，最常见的三体综合征为13、18、或21三体综合征，其发病机制主要是指胎儿染色体上多了一条特定染色体所致的先天性疾病。多数患儿会在妊娠早期发育停止，进而造成流产；但仍有小部分受精卵可发育成熟，最终导致患儿出生。患儿出生后智力发育受限，显著低于一般同龄儿童。由于此类患儿智力低下，发育迟滞，对家庭和社会造成极大负担。因此，三体综合征已成为当前产前诊断筛选的重中之重。尽管三体综合征发病机制还不清楚，但母亲的生育年龄与三体综合征的发生频率具有显著相关性。研究表明，35岁以下母亲，其发生率不到0.1％，此后发生率随着母亲年龄的增大而上升。鉴于三体综合征发生的具体原因仍不明确，从源头阻断此疾病发生目前仍是难以攻克的困境。因此在产前阶段，对针对全体孕妇进行有效筛查，提早发现三体综合征患儿，尽早采取干预措施，对于预防患儿出生，减轻家庭、社会负担具有重要现实意义。
[0003]
目前三体综合征的分子诊断主要有两种途径：一种是基于羊水细胞的染色体检查；另一种是基于母体循环内胎儿游离dna的核酸检查。前者对采样要求极高，且具有一定的不良事件发生率；此外检测的实验室室内与室间变异度仍难以有效控制。后者尽管具有高度的安全性，可有效避免采样对胎儿的影响，但是对检测精度与灵敏度具有非常严苛的要求。由此可见一款稳定、性能优异的质控产品对于切实提高三体综合征核酸检测结果的准确性具有重大价值。目前尽管有少部分欧美厂商运用三体综合征患儿的淋巴细胞制备了相关质控产品。但是，此类产品存在批次间精密度不均一的特点，严重掣肘临床大规模应用。因此，开发全新稳定，高重复性的三体质控产品是产前诊断领域的热点与重点。
[0004]
crispr-cas9是目前已成为生物工程领域中最常用的基因编辑工具。近年来，随着技术研发的进展，以cripsr-cas9技术为基础的基因全长敲入表达已成为现实。相较于普通的质粒表达体系，其具有更高的表达效率与更低的错误发生率，可稳定维持特定基因的高效、持久表达，故尤其适合用于构建永生化人源性淋巴细胞。
[0005]
类器官培养是近年来兴起的一种全新体外活体细胞培养与扩增模式。相较于经典2d贴壁培养系统，类器官一方面具有构建成功率高的特点，可长期、低成本、快速培养；另一方面，类器官培养可保留原始细胞的基因组、蛋白组等分子特征，在扩增过程中不会丢失原有细胞的关键性分子遗传背景，可为后续研究或生产提供更真实的细胞环境。


技术实现要素：

[0006]
本发明所解决技术问题是提供一种基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品及其制备方法，结合crsipr-cas9技术与类器官培养技术，高保真地扩
增特定遗传背景细胞，可极为真实地模拟实际临床样本的检测流程，实现三体综合征核酸检测的全方位监控；成本低廉、稳定性高、便于储存与转运等优势，便于工业级别的大规模生产；具有重要的价值与应用前景。
[0007]
为解决上述技术问题，本发明提供一种基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品，用于全方位监测三体综合征基因检测的过程。
[0008]
本发明还提供一种基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的制备方法，制备步骤如下：
[0009]
(1)利用crispr-cas9技术对13、18、21三体综合征患者来源的外周血淋巴细胞进行端粒酶tert基因的敲入表达，构建可稳定扩增分裂的基因编辑淋巴细胞；
[0010]
(2)构建全新类器官培养体系，对应用步骤(1)中编辑后淋巴细胞进行大规模扩增，并通过染色体核型分析验证扩增细胞染色体畸变状态的维持情况；
[0011]
(3)将应用步骤(2)中扩增淋巴细胞与健康人来源淋巴细胞按照特定比例混合，精确定量验证后制得基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品。
[0012]
其中，步骤(1)tert基因的敲入表达的具体步骤为：根据tert基因全长域设计3对特异性引物，扩增相关片段产物全长可覆盖全部tert基因cds区域，完成扩增后，分别将此三部分序列整合进入单一的puro表达质粒中，并且在两段分别插入带有800bp同源臂的表达供者质粒，分别向受体淋巴细胞导入crispr-cas9和供者序列，构建可稳定扩增分裂的基因编辑淋巴细胞。
[0013]
其中，步骤(2)的具体步骤为：
[0014]
(2-1)编辑后淋巴细胞的准备
[0015]
对步骤(1)完成crispr-cas9 tert敲入表达编辑后的淋巴细胞留样保种后，取一定量细胞通过流式细胞术、pi染色、以及cck-8实验检测细胞凋亡与增殖活性，确定细胞处于较好的增殖状态后，计数细胞并使用无血清dmem培养液将细胞重悬至2
×
106个细胞/ml，体积为100μl；之后使用原始浓度的matrigel基质胶100μl与前述细胞悬液按照体积比1:1的比例进行混匀，置于冰上备用，完成细胞准备；
[0016]
(2-2)三体综合征淋巴细胞的类器官培养
[0017]
以步骤(2-1)中matrigel细胞混悬物为基础，每200微升为一单位，滴加至24孔培养板，并置于37℃环境促ecm交联凝固。按照表2配制改良的淋巴细胞类器官培养液，待细胞悬液凝固后，加至24孔培养板，每孔1毫升，置于37℃培养箱进行培养；
[0018]
其中，步骤(3)的具体步骤为：
[0019]
(3-1)将步骤(2)中类器官培养扩增后的三体综合征患者来源淋巴细胞使用活细胞计数仪进行活性测定后，精准定量；
[0020]
(3-2)之后与健康人来源淋巴细胞按照特定比例混合(1:103，1:104，1:105，1:106，1:107)，添加细胞保存液后制得不同浓度梯度的稀释质控产品。
[0021]
本发明还提供一种利用上述的制备方法制备的基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的准确性鉴定方法，其特征在于，实验步骤为：使用数字pcr技术对不同比例质控产品进行检测，鉴定基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的准确性。
[0022]
本发明还提供一种利用上述的制备方法制备的基于crsipr-cas9与类器官培养的
三体综合征基因核酸检测质控品的重复性鉴定方法，其特征在于，实验步骤为：使用数字pcr技术对三个不同批次制备的全水平(1:103，1:104，1:105，1:106，1:107)质控产品进行检测，鉴定不同批次基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的重复性。
[0023]
本发明还提供一种利用上述的制备方法制备的基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的稳定性鉴定方法，其特征在于，实验步骤为：使用数字pcr技术对37℃环境下保存一个月(每隔一周检测)，室温环境下保存四个月(每隔一个月检测)、4℃保存1年(每隔一个季度检测)的本发明所述质控产品进行检测，鉴定基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品稳定性。
[0024]
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
[0025]
1、本发明所解决技术问题是提供一种以crispr-cas9基因入技术联合类器官培养构建13、18、21三体综合征特征基因核酸检测质控品及其制备方法，通过特定技术高保真地扩增特定遗传背景细胞，可极为真实地模拟实际临床样本的检测流程，实现三体综合征核酸检测的全方位监控。本发明具有成本低廉、稳定性高、便于储存与转运等优势，便于工业级别的大规模生产，具有重要的价值与应用前景。
[0026]
2、本发明中主要涉及两个技术创新，其一利用全新的crispr-cas9系统对三体综合征背景的淋巴细胞实现高活性端粒酶tert的敲入与表达，制备具有永生化潜能的三体综合征背景淋巴细胞；其二，利用优化的类器官培养技术，可实现对前述编辑细胞的高效、高保真扩增，为大规模生产提供坚实基础。
[0027]
3、本发明创新性的以三体综合征患者来源、带有特定遗传背景的淋巴细胞作为基础细胞，运用基因编辑技术进行永生化处理进而制备质控产品。产品的基础生物学遗传背景与实际患者更为接近，相较于普通患者来源质控物质具有更高的基因组稳定性，因此其可广泛应用于目前常规的三体综合征基因检测方法(尤其是ngs)的性能确认、试剂盒性能验证以及日常检测质量控制；突破性的利用改良的类器官培养方法，有效对编辑后的三体综合征淋巴细胞进行扩增，与以往的参考物质相比，其具有易于大批量制备、处理过程汇中稳定性高、保存时间长等优势；此外，制备的产物可与野生型淋巴细胞随意混合，因此三体综合征特定核酸的比例高度可控，并可严格确保产品特定基因比例维持在极小的范围内，具有高度的批内/批间稳定性；产品整体轻便而易于转运，可充分解决市场上现有产品存在的制备量少、运输不便等缺点；使用平台广，可适用于多种检测平台，实现对不同来源标本、不同检测系统的质量考评。
附图说明
[0028]
图1为本发明中tert细胞敲入片段后的鉴定结果图；
[0029]
图2为本发明中tert细胞敲入片段后的蛋白层面鉴定结果图；
[0030]
图3为本发明中三体综合征淋巴细胞的类器官培养示意图；
[0031]
图4为本发明中改良类器官培养方式对培养细胞染色体的高度保真性验证的结果图；
[0032]
图5为本发明中质控品的准确性鉴定的结果图；
[0033]
图6为本发明中质控品的重复性鉴定的结果图；
[0034]
图7为本发明中质控品的稳定性鉴定的结果图。
具体实施方式
[0035]
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
[0036]
本发明将首先利用crispr-cas9技术对13、18、21三体综合征患者来源的外周血淋巴细胞进行端粒酶tert的敲入表达，构建可稳定扩增分裂的基因编辑淋巴细胞；其后，构建全新类器官培养体系，对前述基因编辑后淋巴细胞进行大规模扩增，并通过染色体核型分析验证扩增细胞染色体畸变状态的维持情况；之后，将产品与野生型人源性淋巴细胞按照特定比例混合，精确定量验证后即可制得本发明所述质控品。本发明具有成本低廉、稳定性高、便于储存与转运等优势，便于工业级别的大规模生产，具有重要的价值与应用前景。
[0037]
本发明提供一种基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的制备方法，制备步骤如下：
[0038]
(1)利用crispr-cas9技术对13、18、21三体综合征患者来源的外周血淋巴细胞进行端粒酶tert的敲入表达，构建可稳定扩增分裂的基因编辑淋巴细胞；具体步骤为：
[0039]
根据tert基因全长域设计3对特异性引物，扩增相关片段产物全长可覆盖全部tert基因cds区域，引物如下表所示(表1)。完成扩增后，分别将经由表1引物扩增形成的3部分序列整合进入单一的puro表达质粒中，并且在两段分别插入带有800bp同源臂的表达供者质粒。分别向受体淋巴细胞导入crispr-cas9和供者序列：crispr-cas9分为cas9和grna两部分，cas9为无特异性核酸内切酶，负责切割dna引发dna链断裂，形成外源性片段插入缺口；grna由支架序列和靶向序列两部分构成，支架序列负责结合、引导并激活cas9切割活性，靶向序列长度则与目的序列互补序列后，起到dna定位作用，可诱导cas9靶向切割目的dna序列。
[0040]
。
[0041]
步骤(1)中导入片段的鉴定方法为：前述表达载体转染受体淋巴细胞72h后，利用流式细胞术分选gfp阳性细胞；抽提基因组dna，进行t7e1检测，鉴定cas9对基因组的切割效率；细胞培养4周后，通过镜检排除非单克隆细胞，将单克隆细胞消化后取1/2裂解，抽提基因组dna并进行fish与测序鉴定；通过流式细胞术鉴定细胞的表达效率，结果如图1显示，tert基因敲入后的细胞阳性率在99.5％以上，达到预期敲入表达目标。
[0042]
步骤(1)中敲入表达产物的蛋白层面鉴定方法为：本部分拟采用western blot技术对敲入表达的tert蛋白进行鉴定。采用sds-page电泳对目标蛋白进行电泳分离；采用半
干转方式进行转膜；转膜完成后封闭，选择特定一抗4℃孵育过夜；完成后，使用对应二抗室温孵育2小时；之后利用ecl方法进行曝光检测，image j软件分析条带灰度，以β-actin为内参计算相对表达量，评估目标蛋白表达量。结果如图2所示，敲入后在特定分子量附近具有特异性蛋白条带，证明敲入表达成功。
[0043]
构建全新类器官培养体系，对应用步骤(1)中编辑后淋巴细胞进行大规模扩增，并通过染色体核型分析验证扩增细胞染色体畸变状态的维持情况；包括如下步骤：
[0044]
(2-1)编辑后淋巴细胞的准备
[0045]
对前述完成crispr/cas9 tert敲入表达编辑后的淋巴细胞留样保种后，取一定量细胞通过流式细胞术、pi染色、以及cck-8实验检测细胞凋亡与增殖活性，确定细胞处于较好的增殖状态后，计数细胞并使用无血清dmem培养液将细胞重悬至2
×
106个细胞/ml，体积为100μl；之后使用原始浓度的matrigel基质胶100μl与前述细胞悬液按照体积比1:1的比例进行混匀，置于冰上备用，完成细胞准备。
[0046]
(2-2)三体综合征淋巴细胞的类器官培养
[0047]
以前述matrigel细胞混悬物为基础，每200微升为一单位，滴加至24孔培养板，并置于37℃环境促ecm交联凝固。按照表2配制改良的淋巴细胞类器官培养液，待细胞悬液凝固后，加至24孔培养板，每孔1毫升，置于37℃培养箱进行培养，结果如图2所示。
[0048]
。
[0049]
步骤(2)中淋巴细胞类器官培养的验证
[0050]
使用wb技术对培养后细胞的tert表达进行检测，证实tert并未随着培养发生丢失；使用二代测序对培养后细胞进行检测，发现培养后细胞与投板前细胞具有类似的染色体变化，证实此改良类器官培养方式对培养细胞染色体的高度保真性。通过细胞活力实验发现，改良类器官培养相较常规体外淋巴细胞扩增培养，可有效提高细胞的增殖能力、减少细胞凋亡，结果如图4所示。综上，本发明提出的改良类器官培养方法可高效、高保真地对编辑后三体综合征患者淋巴细胞进行扩增，便于后续质控品的生产。
[0051]
(3)将应用步骤(2)中扩增淋巴细胞与健康人来源淋巴细胞按照特定比例混合，精确定量验证后即可制得本发明所述质控品；具体流程如下：
[0052]
(3-1)将步骤(2)中类器官培养扩增后的三体综合征患者来源淋巴细胞使用活细
胞计数仪进行活性测定后，精准定量；
[0053]
(3-2)与健康人来源淋巴细胞按照特定比例混合(1:103，1:104，1:105，1:106，1:107)，添加细胞保存液后制得不同浓度梯度的基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品。
[0054]
下面结合几个实施例以验证本发明提供的基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的准确性、重复性和稳定性。
[0055]
实施例1
[0056]
13、18、21三体二代测序检测质控品的准确性鉴定
[0057]
使用数字pcr技术对不同比例质控产品进行检测，鉴定其准确性。结果如图5所示，在各个数量级上，数字pcr检测结果与预期混合比例具有显著相关性，且相关系数>0.95，证实质控产品具有高度准确性。
[0058]
实施例2
[0059]
13、18、21三体二代测序检测质控品的重复性鉴定
[0060]
使用数字pcr技术对三个不同批次制备的全水平(1:103，1:104，1:105，1:106，1:107)质控产品进行检测，鉴定不同批次产品的重复性。结果如图6所示，三个不同批次在所有水平上检测值均无显著差异，保持在较好的sd范围内，证实本产品制备流程具有优异的重复性。
[0061]
实施例3
[0062]
13、18、21三体二代测序检测质控品的稳定性鉴定
[0063]
使用数字pcr技术对37℃环境下保存一个月(每隔一周检测)，室温环境下保存四个月(每隔一个月检测)、4℃保存1年(每隔一个季度检测)的本发明所述质控产品进行检测，鉴定其稳定性。结果如图7所示，无论在何种环境，本发明所述质控产品在所有的水平上均具有高度的表达一致性，证实本质控产品具有良好的稳定性，适合于多种保存环境，有利于转运与储藏。
[0064]
本发明所解决技术问题是提供一种基于crsipr-cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品及其制备方法。本发明涉及质控品来源于三体综合征患者，通过特定技术高保真地扩增特定遗传背景细胞，可极为真实地模拟实际临床样本的检测流程，实现三体综合征核酸检测的全方位监控。本发明具有成本低廉、稳定性高、便于储存与转运等优势，便于工业级别的大规模生产。综上，本发明具有重要的价值与应用前景。
[0065]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。