一种靶向人肝癌细胞的多肽及其用途的制作方法

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种靶向人肝癌细胞的多肽及其用途。

背景技术：

噬菌体展示技术（phagedisplaytechnology，pdt）是一种经典的筛选靶向新药和发现药物新靶点的方法，是georgep.smith在1985年提出的一种快速筛选多肽、蛋白质、抗体的高通量方法，并在2018年获得了诺贝尔化学奖。该技术的原理是将外源多肽或蛋白质的dna序列插入中噬菌体次要外壳蛋白piii基因中，外源蛋白随着衣壳蛋白的表达而展示到噬菌体表面，噬菌体展示肽库在构建、改造及筛选方面具有易操作的优点，因此形成了商业化试剂盒以供科研使用。

通过噬菌体展示技术筛选得到的能特异靶向肿瘤细胞的多肽，即肿瘤归巢肽(tumorhomingpeptides，thps),它能特异识别和结合肿瘤组织或血管表面的特异性受体或标志物。因此，thps可将抗肿瘤药物直接靶向递送至肿瘤组织、细胞中,能够减少或消除药物耐受及毒副作用。当前发现的肿瘤归巢肽通常是由5～31个氨基酸构成的分子量很小的活性多肽。小分子多肽与抗体药物相比，克服了抗体药物因其分子量较大所致的难以渗透到肿瘤组织的缺欠，多肽易通过生理屏障，亲和力高，且易化学合成。近十年中，肿瘤归巢肽已成为一种抗癌剂的有效靶向运载工具和肿瘤区域显像剂。

发明人利用噬菌体12肽库对人肝癌细胞进行差减筛选，通过dna测序并翻译，最终得到能与人肿瘤细胞靶向结合的多肽序列。其优势在于，（1）所得到的多肽片段较稳定，增强了多肽的实用性；（2）建立了多肽基因型和表现型之间的联系，操作更加便利；（3）该多肽能特异亲合肝癌细胞，具有肿瘤靶向性。基于之前利用噬菌体展示技术靶向筛选的人肝癌细胞靶向亲和多肽，发明人进一步做了验证，以证明该多肽的高效性和特异性，为进一步开展新型肿瘤靶向药物的设计和研发提供候选资源和奠定坚实基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种对人肝癌细胞具有高度亲和力并能特异性靶向结合的多肽和该靶向多肽在肝癌诊断和治疗中的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种靶向人肝癌细胞的多肽，该多肽的氨基酸序列选自seqidno.1-seqidno.3之一所示的氨基酸序列。

上述多肽链中单字母符号代表的氨基酸残基，氨基酸缩略表见表2。

一种生物活性片段或衍生物，包含seqidno.1-seqidno.3任一多肽序列为核心序列，包括共价连接的化合物以及由核心序列组成的多聚体混合。

优选地，所述的生物活性片段或衍生物与所述多肽具有相同的生物学功能，即同样具有对肝细胞具有高度亲和力并能特异性靶向结合。

一种多聚核苷酸序列，其能编码包含上述的seqidno.1-seqidno.3的任一项多肽序列以及所述的多肽活性片段及其衍生物。

一种用于肝癌诊断的多肽分子探针，包含氨基酸序列为seqidno.1-seqidno.5所述多肽。

一种用于临床肝癌的成像和诊断的显像剂，包含所述多肽和显影剂或放射性核素，包含氨基酸序列为seqidno.1-seqidno.3所述多肽。

一种药物组合物，包括seqidno.1-seqidno.3所述的多肽作为靶向肽和能杀死肝癌细胞的制剂，还包括与所述的多肽相缀合或混合能制备靶向药物的载体；

所述的肽作为靶向肽，与能够杀死肝癌细胞的制剂相缀合或混合；作为用于肝癌治疗的药物，也可作为药物靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等。

优选地，所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、激素、抗肿瘤抗生素、金属络合物或肿瘤放射靶向标瘤放射靶向标记物中的任意一种。

更优选地，所述的制剂为能杀伤肿瘤细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光动力治疗或光热治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。

进一步地，所述载体为目前药剂学广泛应用的、天然的高分子材料以及人工合成的分子聚合物及他们的混合物。

进一步地，所述药物组合物在任何药物治疗学上可接受的剂量和剂型。

氨基酸序列为seqidno.1-seqidno.3所述的多肽及其生物活性片段或衍生物在制备用于预防、治疗或诊断肿瘤的药物或显像制剂中的用途。

所述肿瘤为肝癌。

与现有技术比，本发明的有益效果如下。

（1）本发明提供的多肽片段能够特异性结合肝癌细胞，而不识别正常肝癌上皮细胞（即正常细胞）。因此，该肿瘤靶向多肽及其衍生物在肝癌肿瘤分子诊断，筛查和靶向治疗中具有重要应用价值。

（2）本发明提供的多肽的肿瘤特异性结合作用，为进一步寻找新的肿瘤靶点，研究大分子间相互作用的结合位点、寻找亲和力高且具有生物活性的配体分子以及药物的筛选、疫苗和新型诊断试剂的研发等领域带来了更多希望。

（3）本发明提供的多肽与传统药物相比在生产上，应用生物工程技术，短肽类药物合成和纯化简便，容易实现规模化生产，而且兼有相对分子质量较小、免疫原性弱、活性高等优点，为选出的多肽有望成为效果好、效益高的新时代药物带来更多希望。

（4）本发明利用了噬菌体展示技术筛选与人肝癌特异结合的多肽，鉴定其特异性和亲和力，为临床上肝癌诊断试剂及靶向治疗药物的研制奠定基础。

附图说明

图1是噬菌体展示技术对肝癌细胞特异性结合阳性噬菌体克隆的三轮减性筛选实验结果图，其中a为各轮噬菌体淘选后洗脱液的滴定数；b为各轮噬菌体淘选的回收率图。

图2是elisa鉴定1-30号阳性噬菌体克隆与人肝癌细胞bel7402亲和力的od405结果图。

图3是30个阳性噬菌体克隆的dna测序结果。a为阳性噬菌体克隆dna测序统计表；b为重复率最高的阳性噬菌体克隆的dna测序图。

图4是fitc标记的多肽fitc-gl与人正常肝上皮细胞hl-7702和人肝癌细胞bel7402结合能力的流式细胞检测结果图。其中a为fitc-gl与人正常肝上皮细胞hl-7702和人肝癌细胞bel7402结合的流式结果图；b为流式结果的统计图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的阐述，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1利用噬菌体展示技术对肝癌细胞特异性结合阳性多肽的三轮减性筛选。

1.1宿主菌e.colier2738的复苏、培养。

制备大肠杆菌平板，取lb-tet培养平板于37度孵箱预热1小时，待e.colier2738菌液融化后，用接种环蘸取少量菌液均匀铺在培养平板，然后倒置于37℃的恒温培养箱中过夜培养。制备宿主菌液，从生长良好的培养板中挑取单一菌落，置于含有四环素的lb细菌培养液中，37℃、180rpm振荡过夜培养，使细菌处于对数生长期。制备好的含大肠杆菌lb-tet平板放到4℃冰箱保存备用，宿主菌液放到-80℃冰箱保存备用。

1.2噬菌体展示十二肽库体外减性筛选。

以人源性肝癌细胞bel7402作为靶细胞，人正常肝上皮细胞hl-7702为吸附细胞。利用噬菌体展示技术体外筛选方法，对纽英伦生物技术有限公司(newenglandbiolabs)的ph.d.-12^tmphagedisplaypeptidelibrary进行3轮体外筛选。并尽量保证每一轮噬菌体的投入总量相同，每轮递增筛选压力，最终获得高度富集的噬菌体。具体筛选步骤如下。

1.2.1准备筛选所用细胞。

挑选生长良好的人源性肝癌细胞bel7402、人正常肝上皮细胞hl-7702。用胰蛋白酶分别消化细胞，显微镜下观察细胞变圆变亮后，吸掉胰酶，加入细胞培养基，轻轻吹打细胞使贴壁细胞悬浮。将两种细胞悬液分别吸到预先制备好的，经过多聚赖氨酸处理的培养皿中，放到细胞孵育箱中，培养到细胞贴壁，待生长良好后用于筛选。

1.2.2准备菌液。

筛选当天将过夜培养的宿主菌液加到lb培养液中。37℃、180rpm振荡约3小时。以上为筛选滴度测定及扩增使用菌液。

1.2.3封闭细胞。

用吸管吸净培养皿中的液体，并在无菌滤纸上将培养皿中液体拍甩干净。用0.5%bsa封闭，37℃放置1小时。

1.2.4肽库结合。

弃掉培养皿里的封闭液。加入用tbst稀释100倍的ph.d.-12^tm原始噬菌体展示十二肽库，室温下120rpm微摇作用1小时。

1.2.5洗涤。

吸掉第一轮未结合的噬菌体液，把培养皿放到无菌滤纸上用力拍干。用0.1%tbst洗涤培养皿10次，每次约30秒左右，并冲洗培养皿底部及其边缘，倒掉洗涤液，在无菌滤纸上拍干（注意每次洗涤后更换一张新的干净滤纸，防治交叉污染）。

1.2.6洗脱。

培养皿里加入洗脱液（0.2mglycine-hcl，ph2.2），常温下、80rpm、微摇15min。洗脱作用结束后，轻轻吹打洗脱液后吸出，加入到含有中和缓冲液的ep管里，混匀。

1.3测定噬菌体滴度。

提前摇菌，加tet到lb中，37度180rpm，3小时后，达到对数生长期（od值达到0.6左右为佳）。测定滴度前先将lb/iptg/xgal平板在37℃孵箱预热1小时以上。准备琼脂糖凝胶，微波加热至融化。取吸附后中和洗脱液（或扩增后噬菌体上清液），用lb培养基倍数稀释噬菌体。稀释范围为：吸附后中和洗脱液稀释10²-10⁵；扩增后噬菌体上清液稀释10⁹-10¹²。每个ep管加入备好的菌液，并在每管里加入10μl不同稀释倍数的噬菌体液。在振荡仪上振荡5min混匀。把感染后噬菌体液加到室温融化的琼脂中，立即将混悬液加至已预热的lb/iptg/xgal平板里，用冷却的涂布玻璃棒均匀涂开（每个稀释倍数一个平板，并做好标记）。将涂好的平板倒置于37℃的孵箱过夜培养。第二天检查平板上的噬菌体蓝斑生长情况并计数（即数每个平板上的噬菌体斑个数）。

1.4噬菌体扩增纯化。

把剩余的吸附后洗脱液进行扩增纯化，以备接下来的筛选。取无菌离心管，把备好的过夜宿主菌接种到lb培养基中，形成对数前宿主菌液。把所有的吸附后洗脱液加入到对数前宿主菌液里，于37℃、200rpm快速振荡5小时进行扩增。把扩增噬菌体液于4℃、12000rpm离心10min，把上清转到另一新的离心管里再次同等条件下离心。小心取离心管上部80%的上清液到一新的离心管里，再往离心管里加入六分之一体积的peg/nacl，放4℃冰箱过夜沉淀。次日，将前日沉淀50ml管于4℃、12000rpm条件下离心15min，弃上清，再次同等条件离心2min，弃掉剩余上清液。把沉淀物用1ml的tbs重悬后转移到无菌ep管里，于4℃、14000rpm条件下离心5min。上清转移到新的ep管里，再次加入六分之一体积的peg/nacl，冰上沉淀1小时。于4℃、14000rpm条件下离心10min，弃掉上清液，保留沉淀。用200μl的tbs重悬沉淀物，于4℃、1000rpm离心1min，保留上清于新的ep管（此为扩增后噬菌体液），-20℃冰箱储存。

1.5第二到三轮筛选。

筛选的基本步骤同第一轮。每下一轮筛选均选用前一轮扩增后的噬菌体液作为次级肽库，每轮尽量保持同第一轮基本一致的噬菌体投入量，总共进行三轮减性筛选。每轮筛选后的洗脱液均要测定噬菌体滴度，并计算噬菌体的回收率。

结果如图1所示，图1为利用噬菌体展示技术对肝癌细胞特异性结合阳性多肽的三轮减性筛选实验结果图；其中a为三轮筛选各轮洗脱液的噬菌体滴度；b为三轮筛选各轮的噬菌体的回收率，上述结果显示经过三轮淘选后能够阳性与肝癌细胞特异性结合的阳性噬菌体洗脱液的滴定数为1.5×10⁷pfu/ml，富集了约400倍。

实施例2酶联免疫吸附实验检测阳性噬菌体克隆与肝癌细胞的亲和力。

2.1纯化阳性噬菌体克隆。

2.1.1阳性噬菌体的扩增：在锥形瓶中加入20mllb/tet液体培养基，然后按1:100加入大肠杆菌菌液和待扩增的噬菌体，置于37ºc，恒温振荡器中剧烈震荡4.5h，得到噬菌体的扩增液。

2.1.2阳性噬菌体的纯化：将经上述步骤得到的噬菌体扩增液4ºc、12000r/min，离心10min，取上清后加入1/6体积peg-nacl沉淀过夜后，12000r/min离心15min，弃去上清液，用tbs缓冲液溶解沉淀，再次给予1/6体积peg-nacl，冰上孵育1h。4ºc、14000r/min，离心15min，弃去上清，将得到的沉淀用tbs-nan3溶解后置于4ºc冰箱保存。

2.2酶联免疫吸附实验检测亲和力。

2.2.1制备细胞96孔板，铺板规则：96孔板边缘两列16个孔分别加入100μl×pbs作为空白组；然后1、2、3、4行的每个小孔按照蛇形各铺100μ人正常肝上皮细胞hl-7702悬液，5、6、7、8行的每个小孔按照蛇形各铺100μ人源性肝癌细胞huh-7悬液，然后将铺好的细胞平板置于通有5%co2的37ºc细胞恒温培养箱中过夜即可进行elisa实验。

2.2.2固定：取出过夜铺有细胞的96孔板，拍干孔中液体后，用pbs洗涤3次，然后加入4%多聚甲醛固定20min。

2.2.3阻断：取出固定后的96孔板，拍干孔中液体后，用pbs洗涤3次，然后加入3%过氧化氢,于37ºc细胞恒温培养箱中封闭30min，用以阻断内源性过氧化物酶的活性。

2.2.4封闭：取出阻断后的96孔板，拍干孔中液体后，用pbs洗涤3次，再加入3%bsa/pbs于37ºc细胞恒温培养箱中封闭1h。

2.2.5加噬菌体样品：取出封闭后的96孔板，拍干孔中液体后，加入纯化得到的20个阳性噬菌体，于37ºc细胞恒温培养箱中反应1h。

2.2.6加一抗：取出反应后的96孔板，拍干孔中液体后，用pbs洗涤3次后加入1:4000的m13抗体，4ºc过夜。

2.2.7：取出反应后的96孔板，拍干孔中液体后，用pbs洗涤3次，加二抗,于37ºc细胞恒温培养箱中反应30min。

2.2.8加底物tmb：将pbs洗涤3次后的96孔板于避光条件下加入tmb显示剂，避光置于37ºc细胞恒温培养箱中15min。

2.2.9终止：取出反应后的96孔板，加入2m硫酸终止反应。

2.2.10结果的测定：将完成全部反应的96孔板置于酶标仪中，于405nm处测定其od值，保存结果并进行分析。

结果如图2所示，实验组肝癌细胞bel7402的平均吸光度值od405与对照组正常肝上皮细胞hl-7702的平均吸光度值od405相比明显增强。说明上述阳性噬菌体克隆能特异的与肝癌细胞bel7402结合而与肝正常上皮细胞hl-7702结合作用则较弱。

实施例3测定分析阳性噬菌体克隆dna序列。

3.1.阳性单克隆噬菌体挑选。

把第三轮筛选后所得的噬菌体液，进行滴度测定铺制lb平板，在生长菌斑数不足100个的平板上，随机挑取30个间隔5mm生长良好的蓝斑。把随机挑取的30个蓝斑分别加入到1ml对数前宿主菌液（同噬菌体扩增），于37℃、200rpm快速振荡4.5小时进行扩增。

3.2阳性单克隆噬菌体单链dna提取。

将扩增的单克隆噬菌体液分别于4℃、14000rpm离心30秒，取上清液转到新管中，4℃、1000rpm离心30秒，取上清的80%转到新的无核酸酶离心管里，取300ul菌液按1:1比例加300ul甘油，-20度冰箱冻存，取此即为扩增的单克隆噬菌体液。剩下500ul菌液加200ulpeg，混匀室温静置20min，4度离心14000r，10min，弃上清，4度14000rpm离心3min，弃上清，加100ulnai，混合均匀，加250ul无水乙醇，静置10min，4度10000rpm离心10min，弃上清，用预冷的70%乙醇轻微洗3次，晾干30min，10000rpm离心5min，弃上清，加60ulte。

3.3dna纯化。

取上一步60ulte管，加40ulte补足至100ul。向离心管里加入500ulbufferb3，充分混匀。将混合液全部移入吸附柱，室温下，8000g，离心30秒，将滤出液再次加入吸附柱中再次过柱。倒掉收集管里的液体，将吸附柱放回收集管里。向吸附柱里加入500μlwashsolution，9000g，离心30秒。倒掉收集管里的液体，吸附柱重新放到收集管中。重复上一步骤，将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g，离心1min。在吸附膜中央加入40μl的elutionbuffer，室温静置2min。9000g离心1min，将所得到的dna溶液进行测序。

3.4测定dna序列并分析。

将提取的单链dna进行序列测定，并根据三联密码子的原则翻译出相应的氨基酸序列。用dnastar软件将其翻译为短肽序列和结构分析，并运用ncbiblast与已知蛋白多肽序列对比同源性；genebank、swiss-prot蛋白数据库对核苷酸序列进行相似性分析。

结果如图3所示为阳性噬菌体克隆的测序结果，a为dna测序结果中筛选出来的3个序列和重复次数，其中共测了30个阳性单克隆噬菌体，其中重复次数最高的seqidno.1为22次，其他序列重复次数分别为seqidno.2为5次，seqidno.3为3次，将3个序列与已知蛋白多肽序列对比同源性和相似性分析结果为与已知蛋白多肽序列没有同源性，与核苷酸序列没有相似性。b为重复率最高的阳性噬菌体克隆的dna测序波形图。

实施例4流式细胞术鉴定fitc-阳性多肽片段fitc-gl与肝癌细胞特异性靶向结合能力。

将bel7402、hl7702细胞铺于6孔板中，将细胞置于孵箱内，使之贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基，加胰酶消化1min，离心1000rpm5min，用含有10%的血清停止消化，弃去上清液，pbs洗1次，离心1000rpm5min，弃上清。加入5μmfitc-th，混合均匀，37度孵育15min。离心1000rpm5min，弃上清。加pbs洗一遍，室温1000rpm离心5min，弃上清。加300ulpbs混合均匀，上样，进行流式细胞仪检测。

结果如图4所示，a为多肽fitc-gl与肝癌细胞特异性靶向结合的流式结果图，结果发现肝癌细胞bel7402与多肽几乎全部结合，检测到强荧光信号；而正常肝上皮hl7702细胞则与多肽几乎不结合，只检测到微弱的荧光信号。b荧光强度统计柱形图，可以发现与正常肝上皮细胞相比，多肽fitc-gl与肝癌细胞的结合能力显著增强，有统计学差异，***p<0.001。

序列表

<110>中国医科大学

<120>一种靶向人肝癌细胞的多肽及其用途

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