一种病毒重组酶-聚合酶扩增检测方法与流程

文档序号:22120201发布日期:2020-09-04 16:07阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种病毒核酸扩增方法,其特征在于,所述方法包括第一步rpa或rt-rpa反应和第二步rpa反应,所述第二步rpa反应的引物对位于所述第一步rpa或rt-rpa反应引物对扩增获得的模板内,且与第一步rpa或rt-rpa反应引物对不重叠或小于10bp的重叠。

2.根据权利要求1的扩增方法,其特征在于,所述方法还包括,在第一步rpa或rt-rpa反应体系中加入rna模板进行反应,取1%-100%第一步rpa或rt-rpa反应产物加入第二步rpa反应体系进行第二步rpa反应。

3.根据权利要求1或2的扩增方法,其特征在于,所述第一步rpa或rt-rpa反应体系中rna模板为4个copy到1e6个copy。

4.根据权利要求1或2的扩增方法,其特征在于,所述第一步rpa或rt-rpa反应或第二步rpa反应的反应时间分别为5-30min。

5.根据权利要求1或2的扩增方法,其特征在于,所述第一步rpa或rt-rpa反应或第二步rpa反应的反应温度为35℃到45℃,优选的是37℃-42℃,更优选的是37℃。

6.一种用于病毒检测的引物对,其特征在于,所述引物对包括第一对rpa或rt-rpa引物对,和/或第二对rpa引物对,分别依次用于第一步rpa或rt-rpa反应和第二步rpa反应,所述第二步rpa反应的引物对位于所述第一步rpa或rt-rpa反应引物对扩增获得的模板内,且与第一步rpa或rt-rpa反应引物对不重叠或小于10bp的重叠。

7.一种与权利要求6所述的引物对配套使用的病毒检测的探针,其特征在于,所述探针在第二步rpa反应时使用,所述探针添加可以识别/thf/或者/idsp/的核酸内切酶。

8.一种用于病毒检测的序列组合,其特征在于,包括权利要求6所述的引物对和权利要求7所述的探针。

9.一种试剂盒,其特征在于,其包含权利要求6的引物对、权利要求7的探针和/或权利要求8的序列组合。

10.权利要求6的引物对、权利要求7的探针和/或权利要求8的序列组合在制备检测病毒试剂盒中的用途。

11.一种用于病毒检测的重组酶-聚合酶扩增方法,其特征在于,具体步骤包括:

(1)将病毒样本与核酸释放剂混合,裂解病毒衣壳并释放病毒核酸;

(2)两步rpa反应:包括第一步rpa或rt-rpa反应和第二步rpa反应,所述第二步rpa反应的引物对位于所述第一步rpa或rt-rpa反应引物对扩增获得的模板内,且与第一步rpa反应引物对不重叠或小于10bp的重叠。

12.根据权利要求11的扩增方法,其特征在于,所述方法还包括,在第一步rpa或rt-rpa反应体系中加入rna模板进行反应,取第一步rpa或rt-rpa反应产物加入第二步rpa反应体系进行第二步rpa反应。

13.根据权利要求11或12的所述扩增方法,其特征在于,其中所述步骤(1)的病毒rna原液样本来源于鼻咽拭子、深咳痰液、肺泡灌洗液、唾液样品或肺组织活检标本。

14.根据权利要求11或12的所述扩增方法,其特征在于,所述第一步rpa或rt-rpa反应体系中rna模板为4个copy到1e6个copy。

15.根据权利要求11或12的扩增方法,其特征在于,所述第一步rpa或rt-rpa反应或第二步rpa反应的反应时间分别为5-30min。

16.根据权利要求11或12的扩增方法,其特征在于,所述第一步rpa或rt-rpa反应或第二步rpa反应的反应温度为35℃到45℃,优选的是37℃-42℃,更优选的是37℃。

17.根据权利要求11或12的扩增方法,其特征在于,所述在第一步rpa或rt-rpa反应体系中加入rna模板进行反应,取1%-100%第一步rpa或rt-rpa反应产物加入第二步rpa反应体系进行第二步rpa反应。

18.根据权利要求11或12的扩增方法,其特征在于,所述方法还包括胶体金层析显色步骤,取第二步rpa反应产物加入到depc水中混合均匀进行稀释,吸取稀释产物用于胶体金层析显色。

19.根据权利要求11或12的扩增方法,其特征在于,所述方法还包括荧光探针检测步骤。


技术总结
本发明涉及一种快速、高灵敏度的病毒重组酶‑聚合酶扩增检测方法、引物组以及试剂盒。本发明涉及的检测方法可快速且高灵敏度地对COVID‑19等突发性病毒的核酸进行检测,检测过程无需纯化提取核酸,直接裂解后就能够实现检测,极大减化了核酸检测操作步骤,降低了操作复杂性,适用于新型冠状病毒等突发性卫生事件的快速即时检测。

技术研发人员:白净卫;刘册;李寅青;严翔;袁国华
受保护的技术使用者:清华大学
技术研发日:2020.05.09
技术公布日:2020.09.04
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