一种阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物、制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种基因传递载体材料、制备方法及其应用，属于生物医用高分子材料技术领域。

背景技术：

肿瘤的基因治疗是指利用基因操作方法引入外源基因，纠正肿瘤细胞基因的结构或功能缺陷，或通过增强宿主对肿瘤的杀伤能力和机体的防御机能治疗肿瘤。基因治疗具有针对性强、毒副作用小、疗效好等优势，其关键在于构建安全、高效的基因传递载体。目的基因递送至肿瘤细胞的方式主要包括两种，依托病毒载体的介导和借助非病毒载体的转染。非病毒载体主要包括阳离子脂质体和阳离子聚合物。脂质体价格昂贵，易与血浆蛋白发生吸附作用导致质粒dna解体，转染效率不稳定。阳离子聚合物可与dna结合，形成尺寸较小的微粒复合物，但因缺乏疏水结构域，不能与内质膜直接作用来融合或破坏内质体的稳定性。非病毒载体转染目的基因的效率和基因表达水平远低于病毒载体，难以有效地发挥目的基因的抑癌作用，同时还存在细胞毒性、降解性差等问题。

病毒载体利用亲代病毒高度进化的机制，有效识别和感染细胞，进而获得稳定、高效的基因表达，适合基因治疗的应用和作为生物学研究的工具。腺病毒作为常用的基因传递载体，不仅能有效地将目的基因递送至肿瘤细胞中并高水平表达，也易于培养和纯化，还能够插入大片段的外源基因，携带的基因不会整合到受染细胞基因组，表达的基因序列稳定，没有致癌和致突变的危险。但腺病毒也存在免疫原性风险、高滴度时的细胞毒性、对柯萨奇-腺病毒受体阳性细胞的趋向性等不足。采用阳离子聚合物静电涂层腺病毒，能屏蔽腺病毒与宿主的相互作用，阻断腺病毒的固有受体介导的内吞作用。聚乙烯亚胺和聚赖氨酸是最早用于静电涂层腺病毒的阳离子聚合物，能增强肿瘤细胞对腺病毒的感染性，保护腺病毒免受血清抗体的中和，但存在核内体逃逸效率低、降解性差和细胞毒性问题，还存在进入血液后快速解离的障碍。因此，构建生物相容性好、可生物降解、感染效率高、免疫原性低的新型腺病毒基因载体在肿瘤基因治疗领域将具有广阔的应用前景。

在本发明之前，文献“systemicimage-guidedlivercancerradiovirotherapyusingdendrimer-coatedadenovirusencodingthesodiumiodidesymporterastheranosticgene”（jnuclmed,2013,54:1450-1457）中采用聚酰胺-胺型树状高分子涂层腺病毒载体，能够明显增强细胞对载体的摄取并阻断腺病毒对柯萨奇-腺病毒受体阳性细胞的趋向性。但是聚酰胺-胺型树状高分子的降解性差，影响载体中目的基因在靶细胞中的表达。

技术实现要素：

本发明针对裸腺病毒载体的缺陷和现有腺病毒复合物载体的不足，提供一种能高效率递送外源性目的基因、低细胞毒性的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物、制备方法及其应用。

本发明采用以下技术方案实现发明目的：提供一种阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物，阳离子化柞蚕丝素蛋白以静电吸附作用涂层至腺病毒表面；所述复合物的粒径为315～448nm，复合物的表面zeta电位为-7.2～-0.1mv。

本发明技术方案还包括一种如上所述的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物的制备方法，将柞蚕丝脱胶、溶解、透析后得到再生柞蚕丝素蛋白溶液，再进行如下步骤的加工：

（1）将分子量为1.8kd的聚乙烯亚胺（pei）溶解于三蒸水中，配制成浓度为0.5～8mg/ml的聚乙烯亚胺溶液；将生柞蚕丝素蛋白溶液用三蒸水配制成浓度为10mg/ml，在冰浴中平衡20～30分钟；

（2）按柞蚕丝素蛋白溶液与聚乙烯亚胺溶液体积比为10:1，向柞蚕丝素蛋白溶液中逐滴加入聚乙烯亚胺溶液，缓慢搅拌，用0.1mol/l的4-吗啉乙磺酸调节溶液的ph值至7.8～8.0，再加入占柞蚕丝素蛋白质量20%的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，继续缓慢搅拌，冰浴中反应12～15小时；反应产物经截留分子量3.5kd的透析袋在温度为0～4°c的三蒸水中透析后，再经离心超滤处理，得到阳离子化柞蚕丝素蛋白溶液，阳离子化柞蚕丝素蛋白的表面zeta电位为+2.4～+12.1mv；

（3）将步骤（2）制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白溶液用三蒸水配制成浓度10～150μg/ml；腺病毒用磷酸盐缓冲溶液（pbs）稀释至效价(1～2)×10⁷pfu/ml；按体积比1:3～3:1，将腺病毒与阳离子化柞蚕丝素蛋白混合均匀，涡旋处理1分钟，室温静置30～45分钟，得到阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物。

步骤（2）所述的离心超滤处理，用截留分子量3kd的超滤管在温度为0～4°c、转速7500rpm的条件下离心超滤30分钟。

本发明技术方案中所述的腺病毒携带生长抑制因子4（ing4）基因、白细胞介素-24（il-24）基因、血管内皮生长因子165（vegf165）基因、血管生成素1（ang-1）基因中的一种或两种基因。

本发明提供的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物的应用，复合物能特异性感染靶细胞，所述靶细胞为对细胞膜表面过表达整合素αvβ3和/或αvβ5细胞。

所述的靶细胞包括肺癌细胞、肝癌细胞、血管内皮细胞。

本发明的原理是：柞蚕丝素蛋白中大量的极性氨基酸残基使其比家蚕丝素蛋白具有更丰富的化学反应活性和修饰位点。柞蚕丝素蛋白在中性环境下带负电荷，采用化学改性手段使柞蚕丝素蛋白表面带上正电荷，能赋予其直接涂层裸腺病毒的能力，并且能减弱腺病毒载体与细胞膜之间的静电相斥作用，增强细胞对载体的摄取。柞蚕丝素蛋白具有优异的生物相容性、较低的免疫原性以及可控的生物降解性，采用柞蚕丝素蛋白涂层腺病毒，可降低腺病毒载体的细胞毒性和免疫原性风险。

与现有技术相比，本发明的明显优点如下：

1.本发明制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物感染效率显著提高。本发明利用正负电荷相互吸引的原理使阳离子化柞蚕丝素蛋白涂层至腺病毒表面，屏蔽裸腺病毒表面的大量负电荷，减弱腺病毒载体与细胞膜之间的静电排斥作用，显著提高基因转染效率。

2.天然柞蚕丝素蛋白中富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（rgd）三肽序列，rgd序列能够与细胞表面的整合素αvβ3和αvβ5特异性结合，帮助载体靶向转入细胞中，显著提高基因转染效率。

3.柞蚕丝素蛋白经pei改性后携带大量的自由氨基，涂层腺病毒形成的丝素/腺病毒复合物进入细胞后会产生“质子海绵”效应，复合物中的氨基鳌合大量质子，引起氯离子内流，导致溶酶体渗透性肿胀而破裂，腺病毒完全暴露出来无遮挡，诱导其携带的目的基因在细胞内有效释放，显著提高目的基因的表达水平。

4.本发明制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物感染效率显著提高，能降低腺病毒的有效使用滴度，避免高滴度腺病毒的细胞毒性。

5.本发明制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物，因柞蚕丝素蛋白可生物降解且具有优异的生物相容性和较低的免疫原性，既能有效降低腺病毒载体的细胞毒性，也能降低腺病毒的免疫原性风险，同时能阻断腺病毒对柯萨奇-腺病毒受体阳性细胞的趋向性。

6.本发明制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物感染效率高、细胞毒性低，在针对其靶细胞的体内外感染中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明提供的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物制备原理示意图；

图2为裸腺病毒的扫描电镜照片；

图3为本发明实施例提供的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物的扫描电镜照片；

图4和图5分别为经裸腺病毒感染的肺癌细胞h460的激光共聚焦显微镜照片和流式细胞检测图；

图6和图7分别为经本发明实施例提供的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物感染的肺癌细胞h460的激光共聚焦显微镜照片和流式细胞检测图；

图8为本发明实施例提供的阳离子化柞蚕丝素蛋白、裸腺病毒、阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物对脐静脉内皮细胞huvec的细胞毒性对比柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步描述。

实施例1

1.聚乙烯亚胺改性柞蚕丝素蛋白，制备阳离子化柞蚕丝素蛋白，具体步骤如下：

（1）100g柞蚕丝在5l、质量浓度2.5‰的na2co3水溶液中煮沸三次，时间分别为30min、30min、45min。每次煮完，用去离子水清洗三次。洗净的柞蚕丝在60°c的烘箱中烘干得到精炼柞蚕丝。四水硝酸钙加热熔融、过滤、恒温至105°c，分次加入扯松的柞蚕丝，每100ml硝酸钙溶解10g柞蚕丝。溶解5h左右，至柞蚕丝全部溶解，无絮状物。冷却的柞蚕丝素溶液转移至透析袋（截留分子量12kd）中，在温度为0～4°c的去离子水中透析后得到再生柞蚕丝素蛋白溶液，调整浓度至10mg/ml，在冰浴中平衡20～30分钟。

（2）聚乙烯亚胺溶解于三蒸水中，配制成浓度0.5～8mg/ml，向柞蚕丝素蛋白溶液中逐滴加入pei溶液，柞蚕丝素蛋白溶液与pei溶液的体积比为10:1，缓慢搅拌，用0.1mol/l的4-吗啉乙磺酸调节溶液的ph值至7.8～8.0，再加入占柞蚕丝素蛋白质量20%的1-(3-二甲基氨基丙基)-1-乙基碳二亚胺盐酸盐，继续缓慢搅拌，冰浴中反应12～15小时。反应结束后溶液转移至透析袋（截留分子量3.5kd）中，在温度为0～4°c的三蒸水中透析后，再经超滤管（截留分子量3kd）在温度为0～4°c、转速7500rpm的条件下离心超滤30分钟，得到阳离子化柞蚕丝素蛋白（casf）溶液。

按本实施例上述的技术方案，固定柞蚕丝素蛋白溶液的浓度以及柞蚕丝素蛋白/聚乙烯亚胺体积比，改变聚乙烯亚胺溶液的浓度和反应溶液的ph值，可以得到阳离子化程度不同的柞蚕丝素蛋白。参见表1，它是本实施案例中按不同聚乙烯亚胺溶液的浓度、反应溶液的ph值制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白的表面zeta电位结果对比。

表1阳离子化柞蚕丝素蛋白的表面zeta电位

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2.阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物的制备，具体步骤如下：

（1）阳离子化柞蚕丝素蛋白按pei浓度4mg/ml、溶液ph值7.8制备得到。阳离子化柞蚕丝素蛋白溶液经0.22µm的无菌滤嘴过滤2次，用灭菌的三蒸水稀释至浓度为10～150µg/ml。

（2）裸腺病毒用pbs稀释至效价(1～2)×10⁷pfu/ml。将裸腺病毒与步骤（1）中阳离子化柞蚕丝素蛋白按体积比1:3～3:1混合均匀，涡旋处理1分钟，室温静置30～45分钟，制备阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物。阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物的制备原理如图1所示，表面带正电荷的丝素蛋白依靠静电吸附作用涂层至带负电荷的裸腺病毒表面，形成丝素/腺病毒复合物。裸腺病毒及丝素/腺病毒复合物的形貌如图2、图3所示，裸腺病毒、阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物均呈球形或类球形颗粒，分散均匀，复合物颗粒的粒径大于裸腺病毒颗粒的粒径。

按本实施例上述的技术方案，改变阳离子化柞蚕丝素蛋白的浓度、腺病毒的效价和腺病毒/丝素体积比可以制备不同的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物。参见表2，它是本实施案例中按不同柞蚕丝素蛋白浓度、腺病毒效价、腺病毒/丝素体积比制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物的表面zeta电位、粒径的结果对比。

表2阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物的表面zeta电位和粒径

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实施例2

阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物体外感染靶细胞，包括以下步骤：

（1）效价为1×10⁷pfu/ml的裸腺病毒与浓度为100µg/ml的阳离子化柞蚕丝素蛋白按体积比1:1混合均匀，涡旋处理1分钟，室温静置30～45分钟，制备丝素/腺病毒复合物；效价为1×10⁷pfu/ml的裸腺病毒与无血清培养基按体积比1:1混合均匀，获得与丝素/腺病毒复合物同等效价的裸腺病毒。

（2）肺癌细胞h460以1×10⁵细胞/孔的密度接种于六孔板，用含10%胎牛血清的1640培养基培养24h。吸除培养基，分别加入步骤（1）中制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物、裸腺病毒，腺病毒编码了ing4-il-24双基因。感染8h后吸除丝素/腺病毒复合物、裸腺病毒，补充2ml含10%胎牛血清的1640培养基继续培养24h。

（3）采用激光共聚焦显微镜观察经丝素/腺病毒复合物、裸腺病毒感染的肺癌细胞h460的绿色荧光表达，并采用流式细胞仪检测表达绿色荧光的阳性细胞比例。参见附图4和图5，分别为经裸腺病毒感染的肺癌细胞h460的激光共聚焦显微镜照片和流式细胞检测图；参见附图6和图7，分别为经本实施例提供的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物感染的肺癌细胞h460的激光共聚焦显微镜照片和流式细胞检测图；由图4与图6、图5与图7的对比结果可以看出，感染裸腺病毒的肺癌细胞h460中部分细胞表达绿色荧光，感染效率约为64%。感染丝素/腺病毒复合物的肺癌细胞h460表达绿色荧光的细胞数量较感染裸腺病毒后表达绿色荧光的细胞数量更多。肺癌细胞h460感染丝素/腺病毒复合物效率约为94%，显著高于感染裸腺病毒的效率，表明阳离子化柞蚕丝素蛋白涂层至裸腺病毒表面能明显提高腺病毒载体传递基因的效率。

（4）肝癌细胞smmc-7721以1×10⁵细胞/孔的密度接种于六孔板，用含10%胎牛血清的dmem培养基培养24h。吸除培养基，分别加入步骤（1）中制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物、裸腺病毒，腺病毒编码了ing4基因、il-24基因或ing4-il-24双基因。感染8h后吸除丝素/腺病毒复合物、裸腺病毒，补充2ml含10%胎牛血清的dmem培养基继续培养24h，采用流式细胞仪检测感染效率。肝癌细胞smmc-7721感染裸腺病毒的效率约为53%；感染丝素/腺病毒复合物的效率约为84%，显著高于感染裸腺病毒的效率。

（5）脐静脉内皮细胞huvec以1×10⁵细胞/孔的密度接种于六孔板，用含10%胎牛血清的dmem培养基培养24h。吸除培养基，分别加入步骤（1）中制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物、裸腺病毒，腺病毒编码了vegf165基因、ang-1基因或vegf165-ang-1双基因。感染8h后吸除丝素/腺病毒复合物、裸腺病毒，补充2ml含10%胎牛血清的dmem培养基继续培养24h，采用流式细胞仪检测感染效率。huvec细胞感染裸腺病毒的效率约为66%；感染丝素/腺病毒复合物的效率约为85%，显著高于感染裸腺病毒的效率。以上结果表明裸腺病毒载体经阳离子化柞蚕丝素蛋白涂层后能显著提高基因传递的效率。

实施例3

阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物的细胞毒性，具体步骤如下：

（1）效价为1×10⁷pfu/ml裸腺病毒与浓度为100µg/ml的阳离子化柞蚕丝素蛋白按体积比1:1混合均匀，涡旋处理1分钟，室温静置30～45分钟，制备获得丝素/腺病毒复合物；效价为1×10⁷pfu/ml裸腺病毒与无血清培养基按体积比1:1混合均匀，获得与丝素/腺病毒复合物同等效价的裸腺病毒。腺病毒编码了ing4-il-24双基因。

（2）脐静脉内皮细胞huvec以1×10⁴细胞/孔的密度接种于96孔板，设5个复孔，用含10%胎牛血清的dmem培养基培养24h。吸除培养基，每孔加入100μl步骤（1）中制备的阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物、裸腺病毒，感染8h后吸除丝素/腺病毒复合物、裸腺病毒，每孔补充200μl含血清培养基，继续培养1、3、5、7天。

（3）huvec细胞培养至1、3、5、7天后，采用cck-8法测定细胞存活率，结果如图8所示。huvec细胞与阴性材料组阳离子化柞蚕丝素蛋白共培养1、3、5、7天后，细胞的存活率与空白对照组接近，表明阳离子化柞蚕丝素蛋白对huvec细胞无明显毒性。经裸腺病毒感染的huvec细胞在培养7天后，细胞的存活率约为85%，显著低于空白对照组（p<0.05），表明裸腺病毒对huvec细胞产生毒性。经阳离子化柞蚕丝素蛋白/腺病毒复合物感染的huvec细胞在培养1、3、5、7天后，细胞的存活率始终与空白对照组接近，保持在90%以上，表明裸腺病毒经阳离子化柞蚕丝素蛋白涂层后得到的复合物对正常细胞无明显毒性。