一种索玛鲁肽的合成方法与流程

1.本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种制备索玛鲁肽的方法。
技术背景
2.胰高血糖素样肽-1(glp-1)是由人肠道l细胞分泌的一种肽类激素，能够促进胰岛素的分泌、抑制胰高血糖素的分泌，具有降低血糖浓度的功效，被用于ii型糖尿病的治疗。然而天然glp-1在体内不稳定，易被二肽基肽酶-iv(dpp-iv)快速降解。
3.索玛鲁肽，英文名称为semaglutide，是由丹麦诺和诺德公司开发生产的一种新型长效胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物，用于治疗ii型糖尿病。索玛鲁肽具有降血糖、减肥和保护心血管的功效，已于2017年12月获得fda批准上市。索玛鲁肽的lys侧链经peg、glu和十八碳二羧酸修饰后，亲水性大大提高、与白蛋白的结合力增强；同时n端第2位的ala突变为aib后，有效的避免了被dpp-iv酶解而失活，半衰期达到40h，患者每周只需注射一次。索玛鲁肽的cas号为910463-68-2，分子式为c187h291n45o59，分子量为4113.64g/mol，肽序列为：
4.h-his-aib-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(aeea-aeea-γ-glu-octadecanedioic)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh。
5.目前已报道的索玛鲁肽的制备方法大致分为两类：一类是把含有侧链的lys作为片段直接接入索玛鲁肽主链完成合成，专利cn104356224a公开了一种采用液相法在lys的ε-nh2上接上侧链，随后在树脂上逐步缩合氨基酸制备索玛鲁肽的方法。另一类是分别逐个完成索玛鲁肽主链和侧链的偶联，专利cn 201511027176公开了在固相逐步合成索玛鲁肽直链肽，合成侧链修饰基团，脱去lys的保护基，并偶联侧链修饰基团，最终裂解得到该多肽产物。由于索玛鲁肽的序列较长且有较多的疏水氨基酸，采用氨基酸逐步缩合的方法合成时，易形成折叠，导致树脂收缩严重，延长反应时间，进而粗肽中产生较多与产品性质极为接近的杂质，如[d-his]的消旋杂质
[0006]
h-d-his-aib-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(aeea-aeea-γ-glu-octadecane-dioic)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh；+gly
[0007]
杂质
[0008]
h-his-aib-glu-gly-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(aeea-aeea-γ-glu-octadecanedioic)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh；d-phe
[0009]
杂质
[0010]
h-his-aib-glu-gly-thr-d-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(octadecanedioicacidmono-tert-butyl
[0011]
ester-γ-glu-peg-peg)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh；
[d-his]消旋杂质与索玛鲁肽目标肽的理化性质相近，极大增加了索玛鲁肽产品的分离纯化难度，导致产品收率大大降低。因此，迫切需要一种纯度和收率高，合成成本低的索玛鲁肽的合成方法。


技术实现要素：

[0012]
为了解决现有合成过程中所存在的杂质多，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，不利于工业化生产等问题，本发明提供了一种收率高、纯度高的索玛鲁肽的合成方法。采用三肽加三肽片段的策略减少d-his消旋杂质、+gly杂质、d-thr、d-phe杂质的产生，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。
[0013]
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种索玛鲁肽的合成方法，分别合成索玛鲁肽全保护s1-s3片段和s4-s6片段，应用于合成索玛鲁肽全保护肽树脂，并经裂解、纯化得到索玛鲁肽。
[0014]
需要指出的是，在本发明中，s1为索玛鲁肽肽序中n端第一位的氨基酸，同理s2、s3、s4、s5、s6、s18、s19、s20分别为n端第2、3、4、5、6、18、19、20位氨基酸，以此类推。
[0015]
优选地，全保护s1-s3片段为r1-his(r2)-aib-glu(or3)-oh，全保护s4-s6片段为r4-gly-thr(r5)-phe-oh，其中
[0016]
r1选自fmoc、dde、alloc、boc、trt、dmb、mmt、mtt，
[0017]
r2选自fmoc、dde、alloc、boc、trt、dmb、mmt、mtt，
[0018]
r3选自tbu、bzl，
[0019]
r4选自fmoc，
[0020]
r5选自tbu、bzl。
[0021]
作为更优选方案，r1选自：boc或fmoc，r2选自：trt或boc，r3选自tbu，r4选自fmoc，r5选自tbu。
[0022]
在一些实施例中r1是boc，r2是trt，r3是tbu，r4是fmoc，r5是tbu，即：s1-s3片段为boc-his(trt)-aib-glu(otbu)-oh，s4-s6片段为fmoc-gly-thr(tbu)-phe-oh。采用全保护s1-s3片段boc-his(trt)-aib-glu(otbu)-oh能有效减少d-his消旋杂质的产生；采用全保护，s4-s6片段fmoc-gly-thr(tbu)-phe-oh能有效减少+gly杂质、d-thr、d-phe杂质的产生，两个片段的使用可明显地提高索玛鲁肽粗肽收率、纯度。
[0023]
申请人意外地发现，在索玛鲁肽的制备中，20位采用单体fmoc-lys(aeea-aeea-γ-glu(otbu)-octadecanedioic)-oh，能够使肽中间体被容易地插入spps中，能够使氨基端氨基酸更容易与其反应，且能够明显地抑制/减少错配肽杂质(如，氨基酸缺失肽、氨基酸多余肽)、消旋肽杂质产生，明显地提高索玛鲁肽粗肽收率、纯度。
[0024]
在一些实施方案中，s20为：fmoc-lys(aeea-aeea-γ-glu(otbu)-octadecanedioic)-oh，s1-s3片段为：boc-his(trt)-aib-glu(otbu)-oh，s4-s6片段为：fmoc-gly-thr(tbu)-phe-oh。
[0025]
本发明通过采用片段和逐步合成相结合的固相合成法，制备索玛鲁肽s1-s3片段和s4-s6片段，将其作为关键起始物料应用于索玛鲁肽固相合成中，极大降低了d-his、d-glu、d-thr、d-phe消旋杂质和+gly杂质的产生，显著降低了粗品纯化的难度，大大提高了索玛鲁肽的纯度和收率，降低了合成成本，有利于工业化大生产。
附图说明
[0026]
图1为实施例8制备的索玛鲁肽粗肽的hplc色谱图
[0027]
图2为实施例11制备的索玛鲁肽精肽的hplc色谱图
具体实施方式
[0028]
以下结合具体实施例，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0029]
本发明中所使用的缩写的含义列于下表中：
[0030][0031][0032]
实施例1 boc-his(trt)-aib-glu(otbu)-oh的制备
[0033]
a.将150g替代度为1.06mmol/g2-ctc树脂加入反应釜中，加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入500ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
[0034]
b.称取135.30gfmoc-glu(otbu)-oh于烧杯中，加入500mldmf和78.83mldiea，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤a所得ctc树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除dmf。加入25ml甲醇和250mldmf的混合溶液，50mldiea和250mldmf的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用dmf洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用甲醇洗3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。
[0035]
c.将步骤b所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到211.89gfmoc-glu(otbu)-ctc树脂，经检测替代度为0.75mmol/g。
[0036]
d.将步骤c得到的fmoc-glu(otbu)-ctc树脂全部倒入反应釜中，用500mldcm溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液500ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入dmf500ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液500ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入dmf500ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤5次，每次500ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用ph试纸检测滤液，结果显示ph在6.5-7.0为合格。
[0037]
e.依次称取103.39gfmoc-aib-oh、48.16gdic和51.57ghobt于干净的1l烧杯中，加入体积比为1:1的dmf/dcm溶液500ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入dmf500ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤5次，每次500ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到fmoc-aib-glu(otbu)-ctc树脂。
[0038]
f.按如上步骤d的去保护方法和步骤e的偶联方法，偶联氨基酸boc-his(trt)-oh。最后用二氯甲烷洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用甲醇洗3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护boc-his(trt)-aib-glu(otbu)-ctc树脂245.31g。
[0039]
g.裂解液配比为tfe:dcm＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向200ml裂解液中加入步骤f中所得的ctc树脂的全保护肽树脂20g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用100ml的dcm洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1l异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200ml，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护boc-his(trt)-aib-glu(otbu)-oh粗品7.65g。
[0040]
实施例2 fmoc-his(boc)-aib-glu(obzl)-oh的制备
[0041]
a.将100g替代度为1.12mmol/g2-ctc树脂加入反应釜中，加入300ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入300ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入300ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
[0042]
b.称取102.93gfmoc-glu(obzl)-oh于烧杯中，加入300mldmf和55.53mldiea，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤a所得ctc树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除dmf。加入20ml甲醇和150mldmf的混合溶液，30mldiea和150mldmf的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用dmf洗5次，每次300ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次300ml；再用二氯甲烷洗2次，每次300ml；最后用甲醇洗3次，每次300ml，直至树脂充分分散开。
[0043]
c.将步骤b所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到146.54gfmoc-glu(obzl)-ctc树脂，经检测替代度为0.76mmol/g。
[0044]
d.将步骤c得到的fmoc-glu(obzl)-ctc树脂全部倒入反应釜中，用300mldcm溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液500ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入dmf300ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液300ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入dmf300ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤5次，每次300ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用ph试纸检测滤液，结果显示ph在6.5-7.0为合格。
[0045]
e.依次称取72.77gfmoc-aib-oh、33.93gdic和36.33ghobt于干净的1l烧杯中，加入体积比为1:1的dmf/dcm溶液300ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入dmf300ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤5次，每次300ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到fmoc-aib-glu(obzl)-ctc树脂。
[0046]
f.按如上步骤d的去保护方法和步骤e的偶联方法，偶联氨基酸fmoc-his(boc)-oh。最后用二氯甲烷洗5次，每次300ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次300ml；再用二氯甲烷洗2次，每次300ml；最后用甲醇洗3次，每次300ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护fmoc-his(boc)-aib-glu(obzl)-ctc树脂185.76g。
[0047]
g.裂解液配比为tfe:dcm＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向300ml裂解液中加入步骤f中所得的ctc树脂的全保护肽树脂30g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用150ml的dcm洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1l异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200ml，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护fmoc-his(boc)-aib-glu(obzl)-oh粗品12.95g。
[0048]
实施例3 fmoc-his(trt)-aib-glu(otbu)-oh的制备
[0049]
a.将120g替代度为1.06mmol/g2-ctc树脂加入反应釜中，加入400ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入400ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入400ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
[0050]
b.称取108.24gfmoc-glu(otbu)-oh于烧杯中，加入400mldmf和63.06mldiea，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤a所得ctc树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除dmf。加入20ml甲醇和200mldmf的混合溶液，30mldiea和200mldmf的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用dmf洗5次，每次400ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次400ml；再用二氯甲烷洗2次，每次400ml；最后用甲醇洗3次，每次400ml，直至树脂充分分散开。
[0051]
c.将步骤b所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到175.21gfmoc-glu(otbu)-ctc树脂，经检测替代度为0.73mmol/g。
[0052]
d.将步骤c得到的fmoc-glu(otbu)-ctc树脂全部倒入反应釜中，用400mldcm溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液500ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入dmf400ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液400ml，于
20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入dmf400ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤5次，每次400ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用ph试纸检测滤液，结果显示ph在6.5-7.0为合格。
[0053]
e.依次称取82.71gfmoc-aib-oh、38.53gdic和41.26ghobt于干净的1l烧杯中，加入体积比为1:1的dmf/dcm溶液400ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入dmf400ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤5次，每次400ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到fmoc-aib-glu(otbu)-ctc树脂。
[0054]
f.按如上步骤d的去保护方法和步骤e的偶联方法，偶联氨基酸fmoc-his(trt)-oh。最后用二氯甲烷洗5次，每次400ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次400ml；再用二氯甲烷洗2次，每次400ml；最后用甲醇洗3次，每次400ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护fmoc-his(trt)-aib-glu(otbu)-ctc树脂208.64g。
[0055]
g.裂解液配比为tfe:dcm＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向200ml裂解液中加入步骤f中所得的ctc树脂的全保护肽树脂20g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用100ml的dcm洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1l异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200ml，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护fmoc-his(trt)-aib-glu(otbu)-oh粗品8.25g。
[0056]
实施例4 fmoc-gly-thr(tbu)-phe-oh的制备
[0057]
a.将150g替代度为1.10mmol/g2-ctc树脂加入反应釜中，加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入500ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
[0058]
b.称取127.85gfmoc-phe-oh于烧杯中，加入500mldmf和81.81mldiea，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤a所得ctc树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除dmf。加入25ml甲醇和250mldmf的混合溶液，40mldiea和250ml dmf的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用dmf洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用甲醇洗3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。
[0059]
c.将步骤b所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到205.46gfmoc-phe-ctc树脂，经检测替代度为0.80mmol/g。
[0060]
d.将步骤c得到的fmoc-phe-ctc树脂全部倒入反应釜中，用500mldcm溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液500ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入dmf500ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液500ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入dmf500ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤5次，每次500ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用ph试纸检测滤液，结果显示ph在6.5-7.0为合格。
[0061]
e.依次称取131.16gfmoc-thr(tbu)-oh、49.98gdic和53.51ghobt于干净的1l烧杯中，加入体积比为1:1的dmf/dcm溶液500ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入dmf500ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤5次，每次500ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到fmoc-thr(tbu)-phe-ctc树脂。
[0062]
f.按如上步骤d的去保护方法和步骤e的偶联方法，偶联氨基酸fmoc-gly-oh。最后用二氯甲烷洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用甲醇洗3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护fmoc-gly-thr(tbu)-phe-ctc树脂236.15g。
[0063]
g.裂解液配比为tfe:dcm＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向200ml裂解液中加入步骤f中所得的ctc树脂的全保护肽树脂20g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用100ml的dcm洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1l异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200ml，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护fmoc-gly-thr(tbu)-phe-oh粗品7.39g。
[0064]
实施例5 fmoc-gly-thr(bzl)-phe-oh的制备
[0065]
a.将100g替代度为1.10mmol/g2-ctc树脂加入反应釜中，加入300ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入300ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入300ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
[0066]
b.称取85.23gfmoc-phe-oh于烧杯中，加入300mldmf和54.54mldiea，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤a所得ctc树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除dmf。加入20ml甲醇和150mldmf的混合溶液，25mldiea和150ml dmf的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用dmf洗5次，每次300ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次300ml；再用二氯甲烷洗2次，每次300ml；最后用甲醇洗3次，每次300ml，直至树脂充分分散开。
[0067]
c.将步骤b所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到136.84gfmoc-phe-ctc树脂，经检测替代度为0.80mmol/g。
[0068]
d.将步骤c得到的fmoc-phe-ctc树脂全部倒入反应釜中，用300mldcm溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液300ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入dmf300ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液300ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入dmf300ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤5次，每次300ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用ph试纸检测滤液，结果显示ph在6.5-7.0为合格。
[0069]
e.依次称取87.44gfmoc-thr(bzl)-oh、33.32gdic和35.67ghobt于干净的1l烧杯中，加入体积比为1:1的dmf/dcm溶液300ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，
于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入dmf300ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤5次，每次300ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到fmoc-thr(bzl)-phe-ctc树脂。
[0070]
f.按如上步骤d的去保护方法和步骤e的偶联方法，偶联氨基酸fmoc-gly-oh。最后用二氯甲烷洗5次，每次300ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次300ml；再用二氯甲烷洗2次，每次300ml；最后用甲醇洗3次，每次300ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到全保护fmoc-gly-thr(bzl)-phe-ctc树脂160.86g。
[0071]
g.裂解液配比为tfe:dcm＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向200ml裂解液中加入步骤f中所得的ctc树脂的全保护肽树脂20g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用100ml的dcm洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的1l异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚200ml，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得全保护fmoc-gly-thr(bzl)-phe-oh粗品7.84g。
[0072]
实施例6 fmoc-lys(aeea-aeea-γ-glu(otbu)-octadecanedioic)-oh的制备
[0073]
a.将150g替代度为1.05mmol/g2-ctc树脂加入反应釜中，加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入500ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入500ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
[0074]
b.称取121.44gfmoc-aeea-oh于烧杯中，加入500mldmf和76.18mldiea，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤a所得ctc树脂中，于20-25℃条件下混合反应4h。待反应结束后，滤除dmf。加入25ml甲醇和250mldmf的混合溶液，40mldiea和250mldmf的混合溶液至树脂中,继续混合反应1h。反应结束后，抽滤，树脂用dmf洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用甲醇洗3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。
[0075]
c.将步骤b所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到140.20mmolfmoc-aeea-ctc树脂，经检测替代度为0.73mmol/g。
[0076]
d.将步骤c得到的fmoc-aeea-ctc树脂全部倒入反应釜中，用500mldcm溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液500ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入dmf500ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液500ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入dmf500ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤5次，每次500ml，每次混合5min，并在第4次洗涤后，用ph试纸检测滤液，结果显示ph在6.5-7.0为合格。
[0077]
e.依次称取108.07gfmoc-aeea-oh、35.42gdic和39.59ghobt于干净的1l烧杯中，加入体积比为1:1的dmf/dcm溶液500ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合反应2h。待反应结束后，抽干，加入dmf500ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤5次，每次500ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到fmoc-aeea-aeea-ctc树脂。
[0078]
f.按如上步骤d的去保护方法和步骤e的偶联方法，依先后顺序，依次分别偶联氨基酸fmoc-glu(oh)-otbu和十八烷二酸单叔丁酯。最后用二氯甲烷洗5次，每次500ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次500ml；再用二氯甲烷洗2次，每次500ml；最后用醇3次，每次500ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到octadecanedioic-γ-glu(otbu)-aeea-aeea-ctc树脂255.40g。
[0079]
g.裂解液配比为tfe:dcm＝1:4(体积比)，于15℃条件下，向300ml裂解液中加入步骤f中所得的ctc树脂的全保护肽树脂30g，升温至30℃，继续搅拌反应3小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用100ml的dcm洗涤，重复操作两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积为原始体积的30％，然后将浓缩液缓慢加入到预冷的2l异丁基醚中，沉降后离心5次，每次用异丁基醚300ml，得到白色固体粉末，先用氮气吹干后，再用真空干燥箱干燥10小时，取出称重，即得octadecanedioic-γ-glu(otbu)-aeea-aeea-oh粗品11.65g。
[0080]
h.将步骤g得到的octadecanedioic-γ-glu(otbu)-aeea-aeea-oh粗品5g，溶解于10mldcm中，加入2.2g五氟苯酚。称取2.4gdcc，溶于10mldcm中，将dcc溶液缓慢滴加到反应溶液中，搅拌反应1.0h，tlc检测反应完全后，过滤。滤液用饱和食盐水洗涤一次，用水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥dcm溶液，浓缩至干燥，溶于适量的乙腈中。称取6.08gfmoc-lys-oh.hcl溶解于乙腈/水(乙腈/水＝1/2)中，加入7.5mldiea，搅拌15分钟。将以上的反应溶液缓慢滴加到fmoc-lys-oh溶液中，搅拌反应1.5h。加入稀盐酸调ph值约为6，加入少量dcm萃取。经纯化得到fmoc-lys(aeea-aeea-γ-glu(otbu)-octadecanedioic)-oh2.85g。
[0081]
实施例7替代度为0.30mmol/g的fmoc-gly-wang树脂的制备
[0082]
a.将10g替代度为0.90mmol/g的wang树脂加入反应釜中，加入100ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，再加入100ml二氯甲烷，混合40min后，滤除二氯甲烷，最后再加入100ml二氯甲烷，混合2min后，滤除二氯甲烷，该树脂备用。
[0083]
b.称取5.35g的fmoc-gly-oh和2.92g的hobt于烧杯中，加入100mldmf和4.46ml的diea，将溶液于0-10℃下搅拌激活5min后，倒入步骤a所得wang树脂中，加入0.16g的dmap，于20-25℃条件下混合4h。待反应结束后，加入醋酸酐8.5ml，继续混合1h。反应结束后，抽滤，树脂用dmf洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用甲醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。
[0084]
c.将步骤b所得树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。烘干后，得到12.87g的fmoc-gly-wang树脂，经紫外检测替代度为0.30mmol/g。
[0085]
实施例8索玛鲁肽粗肽的制备1
[0086]
a.将实施例7中得到的10gfmoc-gly-wang树脂倒入反应釜中，用100mldcm溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液100ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入dmf100ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液100ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入dmf100ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤8次，每次100ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用ph试纸检测滤液，结果显示ph在6.5-7.0为合格。
[0087]
b.依次称取3.89g的fmoc-arg(pbf)-oh、2.31gtbtu和0.97ghobt于干净的1l烧杯中，加入体积比为1:1的dmf/dcm溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌
溶解，待温度恒定后，加入1.49mldiea，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入dmf100ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤6次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到fmoc-arg-gly-wang树脂。
[0088]
c.按如上步骤a的去保护方法和步骤b的偶联方法，依主链氨基酸先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸或肽片段，即：fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、实施例7所得的fmoc-lys(aeea-aeea-γ-glu(otbu)-octadecanedioic)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、实施例4所得的fmoc-gly-thr(tbu)-phe-oh和实施例1所得的boc-his(trt)-aib-glu(otbu)-oh的偶联。偶联完成后，用二氯甲烷洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到索玛鲁肽肽树脂26.15g。hplc色谱图如图1所示。
[0089]
实施例9索玛鲁肽粗肽的制备2
[0090]
a.将10g替代度为0.30mmol/g的fmoc-gly-wang树脂倒入反应釜中，用100mldcm溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液100ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入dmf100ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液100ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入dmf100ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤8次，每次100ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用ph试纸检测滤液，结果显示ph在6.5-7.0为合格。
[0091]
b.依次称取3.89g的fmoc-arg(pbf)-oh、2.31gtbtu和0.97ghobt于干净的1l烧杯中，加入体积比为1:1的dmf/dcm溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入1.49mldiea，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入dmf100ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤6次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到fmoc-arg-gly-wang树脂。
[0092]
c.按如上步骤a的去保护方法和步骤b的偶联方法，依主链氨基酸先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸或肽片段，即：fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、实施例7所得的fmoc-lys(aeea-aeea-γ-glu(otbu)-octadecanedioic)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、实施例5所得的fmoc-gly-thr(bzl)-phe-oh和实施例2所得的fmoc-his(boc)-aib-glu(obzl)-oh的偶联。偶联完成后，用二氯甲烷洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中
干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到索玛鲁肽肽树脂27.08g。hplc色谱图与图1相似。
[0093]
实施例10索玛鲁肽粗肽的制备3
[0094]
a.将实施例7中得到的10gfmoc-gly-wang树脂倒入反应釜中，用100mldcm溶胀混合15min后抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液100ml，于20-30℃条件下混合5min后，抽干。加入dmf100ml，混合5min后，抽干。加入体积浓度为20％哌啶/dmf溶液100ml，于20-30℃条件下混合10min后，抽干。加入dmf100ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤8次，每次100ml，每次混合5min，并在第七次洗涤后，用ph试纸检测滤液，结果显示ph在6.5-7.0为合格。
[0095]
b.依次称取3.89g的fmoc-arg(pbf)-oh、2.31gtbtu和0.97ghobt于干净的1l烧杯中，加入体积比为1:1的dmf/dcm溶液100ml，置于冰水中于0-10℃条件下用机械搅拌器搅拌溶解，待温度恒定后，加入1.49mldiea，继续维持温度并搅拌激活5min。将以上激活液缓慢加入到反应釜中，于20-25℃条件下混合2h。待反应结束后，抽干，加入dmf100ml，混合5min后，抽干。重复用dmf洗涤6次，每次100ml，每次混合5min。最后用茚三酮检测为阴性，即得到fmoc-arg-gly-wang树脂。
[0096]
c.按如上步骤a的去保护方法和步骤b的偶联方法，依主链氨基酸先后顺序，依次分别偶联剩余氨基酸或肽片段，即：fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、实施例7所得的fmoc-lys(aeea-aeea-γ-glu(otbu)-octadecanedioic)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、实施例4所得的fmoc-gly-thr(tbu)-phe-oh和实施例3所得的fmoc-his(trt)-aib-glu(otbu)-oh的偶联。偶联完成后，用二氯甲烷洗5次，每次100ml；洗毕，用甲醇洗两次，每次100ml；再用二氯甲烷洗2次，每次100ml；最后用醇洗3次，每次100ml，直至树脂充分分散开。将该树脂于20-30℃条件下真空干燥箱中干燥4h，直至恒重(连续两次称重，误差低于1％)。得到索玛鲁肽肽树脂26.91g。hplc色谱图与图1相似。
[0097]
实施例11索玛鲁肽精肽的制备
[0098]
将实施例8获得的索玛鲁肽粗品溶于稀氨水，再用磷酸调节索玛鲁肽粗品溶液的ph为8.0～8.5，过滤得到索玛鲁肽粗肽溶液。以八烷基键合硅胶为固定相、以氯化铵和乙腈为流动相对索玛鲁肽粗肽溶液进行hplc线性梯度洗脱，收集索玛鲁肽馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得索玛鲁肽的一次纯化溶液。索玛鲁肽的一次纯化溶液以八烷基键合硅胶为固定相、用磷酸调节ph的磷酸二氢钾水溶液，乙腈与异丙醇混合溶剂为流动相进行hplc线性洗脱，收集索玛鲁肽馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除部分乙腈，获得索玛鲁肽的二次纯化溶液。索玛鲁肽的二次纯化液以八烷基键合硅胶为固定相、用碳酸氢铵水溶液和乙腈为流动相进行hplc线性洗脱，收集索玛鲁肽馏分，用旋转蒸发仪旋蒸去除乙腈和大部分水，冷冻干燥，获得索玛鲁肽精肽4.86g,hplc纯度为99.75％，hplc色谱图如图2所示,纯化收率为68.24％。