一种利用微生物发酵法提取橘皮精油的方法与流程

(一)技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种微生物发酵技术在橘皮精油提取中的应用。

(二)

背景技术：

柑橘精油，是指从芸香科柑橘属植物(包括橙子、柚子、蜜橘、椪柑等)的果皮中提取，具有芳香气味油状液体的总称。柑橘精油具有令人喜爱的独特芳香风味，其主要成分是萜烯类、倍半萜烯类以及高级醇类、醛类、酮类、酯类等组成的含氧化合物。研究表明柑橘精油具有抑菌、消炎、抗病毒、抗氧化等活性作用，具有较高的应用价值。柑橘精油在医药、食品、日化领域的运用已相当广泛，是调配多种香精的原料。

我国是仅次于巴西和美国的第三大柑橘生产国，柑橘在鲜食或加工生产后产生大量皮渣，目前多是作为垃圾处理。柑橘皮渣中含有包括精油等许多有用成分，从柑橘皮渣中提取精油，可实现对柑橘的综合利用，提高柑橘资源利用率，对柑橘产区的经济发展和环境保护都起到积极作用。

目前，柑橘精油提取的方法有直接压榨法、水蒸气蒸馏法、有机溶剂提取法、超临界流体萃取法等。直接压榨法可避免精油受热可能导致的成分改变和挥发损失，但提取得率通常较低；水蒸气蒸馏法应用最为广泛，设备要求低，但存在热分解的问题；有机溶剂提取法在去除溶剂时容易导致挥发性成分的损失；超临界流体萃取法耗时虽短，但设备成本较高，产能有限，在生产实践中应用还有一定局限性。相比之下，水蒸气蒸馏法有相对优势，是目前柑橘精油提取的主要方法。在从橘皮提取精油前，有采用酶解法破坏细胞壁使细胞中的精油释放出来，从而提高了精油的提取率。如采用纤维素酶酶解辅助提取桔皮精油，精油的提取率可以达到3.14％[王建美,罗玲环,吴梦霞,等.酶解-水蒸气蒸馏法提取桔皮精油的工艺研究.金华职业技术学院学报,2013,13(6):86-89]，较单纯水蒸气蒸馏法提取的2％左右的得率有很大提高。虽然酶解辅助水蒸气蒸馏提取能够提高柑橘精油的提取得率，但需要纯酶，且用量较高，无疑增加了生产成本。一些霉菌可以产生多种多糖水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等，如用霉菌直接发酵预处理柑橘皮，霉菌适度生长，产生的多糖水解酶水解橘皮细胞壁，有利于细胞中的精油释放出来，从而提高精油的提取得率。为此，本发明对水蒸气蒸馏法提取橘皮精油工艺进行改进，增加微生物发酵预处理步骤，从而提高了橘皮精油的提取得率。

(三)

技术实现要素：

本发明目的将微生物发酵技术应于橘皮精油的提取中，提供一种利用微生物发酵法提取橘皮精油的方法，从而显著提高橘皮精油的提取得率。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用微生物发酵法提取橘皮精油的方法，所述方法为：经粉碎的新鲜橘皮中，接种霉菌孢子后，于28–30℃发酵3–4d，获得橘皮发酵物；橘皮发酵物经水蒸气蒸馏法提取，获得橘皮精油；所述霉菌为里氏木霉、长枝木霉或黑曲霉。

进一步，所述新鲜橘皮是将新鲜的柑橘(citrusreticulateblanco)果皮，用粉碎机粉碎成粒径大小为2–3mm的颗粒。

进一步，所述霉菌为里氏木霉(trichodermareesei)gim3.553、长枝木霉(trichodermalongibrachiatum)gim3.140或黑曲霉(aspergillusniger)gim3.546，优选里氏木霉gim3.553。

进一步，所述的霉菌孢子接种量以新鲜橘皮重量计为3–5×10⁶个/g。

进一步，所述的里氏木霉gim3.553孢子以孢子液的形式加入，所述孢子液的制备方法为：低温保藏的里氏木霉gim3.553孢子接种于pda平板培养基(直径9cm的培养皿中)，于28–30℃恒温培养2–3d后，加入无菌水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液转移到无菌试管中，用无菌水调整孢子浓度为3–5×10⁸个/ml(血球计数板计数)。所述的pda平板培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基)终浓度组成为：马铃薯200g/l(煮沸30min后过滤留汁)，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，溶剂为自来水，ph自然(实测6.5)。

进一步，所述的从橘皮发酵物中提取精油的方法为：将橘皮发酵物中加入去离子水、nacl和少许玻璃珠，振荡摇匀后，采用水蒸气蒸馏法，冷凝回流提取获得橘皮精油；具体为：橘皮发酵物置于圆底烧瓶中，加入去离子水、nacl和少许玻璃珠，振荡摇匀后，圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止；接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内微沸，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(3–5h)，停止加热，放置1h以上；开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出精油。所述的去离子水体积加入量以新鲜橘子皮重量计为2ml/g；所述nacl加入量以去离子水质量计为2％–3％；所述玻璃珠加入目的是防止加热爆沸；所述的挥发油提取器，也称挥发油测定器，结构见附图1。

本发明所述的里氏木霉gim3.553、长枝木霉gim3.140和黑曲霉gim3.546，均购自广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在从新鲜柑橘果皮中提取精油前，增加了霉菌，特别是里氏木霉gim3.553的发酵预处理。里氏木霉gim3.553在经粉碎的橘皮中适度生长，产生纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶等多糖水解酶，破坏细胞壁结构，有助于精油从细胞中释放出来，从而提高了精油提取得率。较不采用发酵预处理的常规方法相比，橘皮精油的提取得率可以提高50％以上。

(四)附图说明

图1挥发油提取器结构示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例所述的柑橘，是芸香科(rutaceae)植物柑橘(citrusreticulatebanco)，所述的橘皮是柑橘成熟果实的外皮。

本发明的橘皮精油提取方法按《中国药典》四部(2015版)中的―2204挥发油测定法”操作。

实施例1发酵菌株的筛选

为了筛选到一株适用于发酵橘皮，以提高精油提取得率的微生物菌株，本发明采用下述方法筛选发酵菌株。

(1)4℃保藏的黑曲霉(aspergillusniger)gim3.546、里氏木霉(trichodermareesei)gim3.553、塔宾曲霉(aspergillustubingensis)gim3.577、长枝木霉(trichodermalongibrachiatum)gim3.140和康宁木霉(trichodermakoningii)gim3.518菌株平板培养的孢子接种于新鲜pda平板培养基，于28℃恒温培养3d。加5ml的无菌水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌水调整孢子浓度为3×10⁸个/ml(血球计数板计数)。

(2)100g新鲜橘子皮，粉碎成粒径约为2–3mm的颗粒，加入到250-ml经160℃干热灭菌2h的三角瓶中，再接种1ml步骤(1)制备各霉菌的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下培养3d，获得橘皮发酵物。

(3)步骤(2)获得的全部橘皮发酵物转移到500-ml的圆底烧瓶中，加入200ml的去离子水、4g的nacl和20粒玻璃珠，振荡摇匀后，圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管(图1)，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止。接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内微沸，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(3h)，停止加热，放置1h以上，开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出橘皮精油，称重。

同样条件下，以不接种菌株作为对照，其他操作均相同。

经不同霉菌菌株发酵的橘皮，以及未经发酵的橘皮(对照)，水蒸气蒸馏法提取精油的得率见表1。

表1经不同菌株发酵的橘皮精油提取得率

由表1数据可以看出，橘皮经里氏木霉gim3.553发酵后，精油的提取得率为2.40％，较未经发酵的对照相比，得率提高的幅度最大，达到了37.1％，本发明选定该菌株作为橘皮精油提取的发酵菌株。

所述的平板培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基(pda)，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水1000ml，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000ml，再加入蔗糖20g、琼脂20g，ph自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌15min后倒入直径9cm的无菌培养皿，冷却后备用。

本发明所述的黑曲霉gim3.546、里氏木霉gim3.553、塔宾曲霉gim3.577、长枝木霉gim3.140和康宁木霉gim3.518菌株均来自广东省微生物菌种保藏中心，均为面向社会的共享菌株。广东省微生物菌种保藏中心地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

所述的橘皮精油提取得率按以下公式计算：

100g新鲜橘皮烘干后的质量为31.02g，所以以下实施例的新鲜橘皮干重得率按31.02％计算。

实施例2

里氏木霉gim3.553应用于橘皮精油的提取，可以按以下步骤操作。

(1)4℃保藏的里氏木霉gim3.553菌株平板培养的孢子接种于新鲜pda平板培养基，于28℃恒温培养3d，加5ml的无菌水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌水调整孢子浓度为4×10⁸个/ml。

(2)100g新鲜橘子皮，粉碎至粒径约为2–3mm，加入到250-ml经160℃干热灭菌2h的三角瓶中，再接种1ml步骤(1)制备的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下培养4d，获得橘皮发酵物。

(3)步骤(2)获得的全部橘皮发酵物转移到500-ml的圆底烧瓶中，加入200ml的去离子水、6g的nacl和20粒玻璃珠，振荡摇匀后，圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止。接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内微沸，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(3h)，停止加热，放置1h以上，开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出橘皮精油，称重。

按上述步骤，从100g新鲜橘皮中提取得到橘皮精油0.754g，提取得率为2.53％(按橘皮干重计)，较实施例1中未经微生物发酵的常规提取的得率(1.75％)提高了44.6％。

实施例3

里氏木霉gim3.553应用于橘皮精油的提取，可以按以下步骤操作。

(1)4℃保藏的里氏木霉gim3.553菌株平板培养的孢子接种于新鲜pda平板培养基，于28℃恒温培养3d，加5ml的无菌水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌水调整孢子浓度为5×10⁸个/ml。

(2)200g新鲜橘子皮，粉碎至粒径约为2–3mm，加入到500-ml经160℃干热灭菌2h的三角瓶中，再接种2ml步骤(1)制备的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下培养4d，获得橘皮发酵物。

(3)步骤(2)获得的全部橘皮发酵物转移到1-l的圆底烧瓶中，加入400ml的去离子水、12g的nacl和30粒玻璃珠，振荡摇匀后，圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止。接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内微沸，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(5h)，停止加热，放置1h以上，开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出橘皮精油，称重。

按上述步骤，从200g新鲜橘皮中提取得到橘皮精油1.58g，提取得率为2.65％(按橘皮干重计)，较实施例1中未经微生物发酵的常规提取的得率(1.75％)提高了51.5％。

实施例4里氏木霉gim3.553应用于橘皮精油的提取

里氏木霉gim3.553应用于橘皮精油的提取，可以按以下步骤操作。

(1)4℃保藏的里氏木霉gim3.553菌株平板培养的孢子接种于新鲜pda平板培养基，于28℃恒温培养3d，加5ml的无菌水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌水调整孢子浓度为5×10⁸个/ml。

(2)500g新鲜橘子皮，粉碎至粒径约为2–3mm，加入到1-l经160℃干热灭菌2h的三角瓶中，再接种5ml步骤(1)制备的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下培养4d，获得橘皮发酵物。

(3)步骤(2)获得的全部橘皮发酵物转移到2-l的圆底烧瓶中，加入1000ml的去离子水、30g的nacl和50粒玻璃珠，振荡摇匀后，圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止。接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内微沸，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(5h)，停止加热，放置1h以上，开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出橘皮精油，称重。

按上述步骤，从200g新鲜橘皮中提取得到橘皮精油3.89g，提取得率为2.61％(按橘皮干重计)，较实施例1中未经微生物发酵的常规提取的得率(1.75％)提高了49.2％。