利用CRISPR\Cas9系统对水稻TDR基因进行定点突变及检测的方法与流程

本发明属于水稻分子育种技术领域，涉及一种利用crispr\cas9系统对水稻tdr基因进行定点突变的方法，并进一步提供一种对通过此种定点突变方法获得的特定tdr突变基因型进行检测的高分辨率溶解曲线分析方法。

背景技术：

隐性雄性不育株系在水稻育种中具有重要应用价值，目前已成功应用于轮回选择育种，也被应用于spt技术(seedproductiontechnology，一种植物雄性不育系生产技术)。水稻中克隆了很多隐性雄性不育基因，其中tdr基因失活导致的败育十分彻底，为无花粉型败育易于田间观察识别，不影响育性之外的农艺性状，因而具有重要利用价值。尽管已经存在tdr基因的突变体，但通过回交的方式向目标品种中导入该基因的突变体较为耗时费力，而且遗传背景不容易纯化，而通过定点基因突变技术对tdr基因进行诱变则更加便捷，而且可使目标材料遗传背景基本保持不变。

基因的定点突变可通过基因编辑技术进行。基因编辑系统主要包括锌脂蛋白核酸酶(zfn)、类转录因子效应蛋白核酸酶(talen)及crispr系统等[gaj,t.,etal.zfn,talen,andcrispr/cas-basedmethodsforgenomeengineering.trendsbiotechnol,2013,31(7):397-405]，这些技术中应用最为广泛的是crispr\cas9系统。通过crispr\cas9系统创制的突变一般是1至数个碱基的缺失/插入(indel)突变，当需要确定候选基因编辑植株中发生的具体序列变化时，一般通过dna测序进行鉴定。在确定基因突变情况后，一般要在对基因编辑株系后代中进行去除标记的纯合突变单株的筛选，最后一般选择个别株系进行应用。特别地，在隐性雄性不育基因的基因编辑及应用中，有时需要在可育株中区分杂合型和野生型，而通过表型无法区分，因而只能通过一定的基因分型方法在基因水平上进行鉴定。

高分辨率溶解曲线是一种新型的高通量基因分型方法，与野生型序列差异为少数几个碱基的突变难以通过普通pcr结合普通电泳的方法进行检测，而高分辨率溶解曲线分析法可对一些插入/缺失突变(indel)和单碱基突变(snp)进行基因分型。高分辨率溶解曲线分析基于特定核酸荧光染料的pcr并借助特定仪器进行，在遗传和育种研究的多个方面得到了应用。

技术实现要素：

针对回交利用水稻现成隐性雄性不育基因tdr耗时费力、遗传背景难以纯化的缺点，本发明提供了一种利用crispr\cas9系统对水稻野生型tdr基因进行定点突变的方法，并进一步提供了一种对定点突变获得的特定tdr突变基因型进行检测的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明公开了一种利用crispr\cas9系统对水稻野生型tdr基因进行定点突变的方法，所述的tdr基因编码与seqidno.1所示序列相同或存在95％以上序列相似性的水稻蛋白质序列，所述的crispr\cas9系统采用的sgrna引导序列(guidesequence)包括转义为dna序列形式表示的如seqidno.2或seqidno.3所示的任一序列，或与seqidno.2或seqidno.3所示序列存在1至3个碱基差异的序列。

优选地，所述的crispr\cas9系统的功能组分组装在双元ti质粒载体中，所述的双元ti质粒载体包括pcubi1390cas9-u3或pcubi1390cas9-u6。

更优选地，所述的双元ti质粒载体为pcubi1390cas9-u3时，采用的crispr\cas9系统sgrna引导序列选自转义为dna序列形式如seqidno.2所示的序列，或与seqidno.2所示序列存在1至3个碱基差异的序列；所述的双元ti质粒载体为pcubi1390cas9-u6时，采用的crispr\cas9系统sgrna引导序列选自转义为dna序列形式如seqidno.3所示的序列，或与seqidno.3所示序列存在1至3个碱基差异的序列。

优选地，上述方法包含如下步骤：

1)构建目标crispr双元ti质粒载体；

2)将载体转化至农杆菌中；

3)采用农杆菌转化法转化水稻愈伤组织，获得t0代转化子；

4)对t0代转化子中tdr基因的靶位点突变情况进行检测；

5)观察转化子育性变化；

6)加代繁殖转化子并从后代中筛选已经去除t-dna成分且突变基因型为纯合功能失活突变型的单株；

7)繁殖目标纯合单株。

优选地，上述步骤1)又包含：

1-1)设计sgrna引导序列，合成用于克隆的寡脱氧核糖核酸：

引导序列为seqidno.2时，寡脱氧核糖核酸序列为

gtdru3-f：ggcagcacaggtctcagcactgc，

gtdru3-r：aaacgcagtgctgagacctgtgc；

引导序列为seqidno.3时，寡脱氧核糖核酸序列为

gtdru6-f：cttgctgcattgaggcctctagt，

gtdru6-r：aaacactagaggcctcaatgcag；

1-2)分别把步骤1-1)合成的寡脱氧核糖核酸退火形成双链寡核酸接头；

1-3)酶切和回收双元ti质粒载体；

1-4)将双元ti质粒载体与接头连接：将gtdru3-f和gtdru3-r制作的接头与载体pcubi1390cas9-u3相连接，将gtdru6-f和gtdru6-r制作的接头与载体与pcubi1390cas9-u6相连接；

1-5)将连接好的载体转化大肠杆菌，对大肠杆菌单克隆转化子进行测序，繁殖正确克隆，提取质粒备用。

更优选地，步骤1-3)中，用限制性内切酶aari酶切crispr/cas9载体pcubi1390cas9-u3或pcubi1390cas9-u6。

更优选地，步骤1-5)中，所用测序引物包括：

检测克隆正确性，启动子为u3时用osu3-f：ggcatgcatggatcttggaggaat；启动子为u6时用osu6-f：ttgagcgattacaggcgaaagtg；

检测载体完整性，35s正向引物35s-f：tgacgcacaatcccactatccttc；cas95′端引物cas9-r-1：tcgagcctgcgggacttagag；cas93′端引物c126：tcgtgaagaagaccgaggtt。

优选地，步骤4)中，通过dna测序分析对t0代转化子中tdr基因的靶位点突变情况进行检测，所述突变情况包括：无突变，纯合突变、杂合突变、双等位基因突变和嵌合突变。

优选地，步骤5)中通过以下方法观察转化子育性变化：用肉眼于开花当天或开花前1-3天直接观察，若花药室中存在黄色花粉则为可育，若无花粉则为不育；当植株为不育时，其突变类型可能为纯合突变、双等位基因突变或嵌合突变三种情况中的一种，当为可育时，突变类型可能为但不限于无突变或杂合突变两种情况中的一种。

优选地，步骤6)中，当t0转化子为不育时，将其作为母本与野生型进行杂交而繁殖，当t0转化子为可育且为杂合突变时，使其自交繁殖；在获得自交或杂交t1代植株后，于该世代对植株进行是否携带t-dna成分的检测；筛选到去除t-dna成分单株后依据育性情况进行纯合突变植株的判断，不育株为纯合株，而当t0转化子为不育时，与野生型杂交获得的不含t-dna成分的t1代植株中不存在纯合株，需使t1植株自交，从获得的t2代植株中筛选不育株。

优选地，步骤7)还包括：将获得的不含t-dna成分的纯合不育单株作母本与同世代群体中分离出的去除t-dna成分的可育株杂交，杂交时父本株数应选4株以上，并且各自与不育株单独成对杂交，各组合单独收种繁殖，后代可出现两种情况，第一种后代群体存在可育株和不育株的分离，第二种全部是可育株，选择保留出现第一种情况的群体并继续将其中的不育株与可育株杂交，此后各代继续进行此种操作，可使获得的后代可育株与不育株呈1:1分离保持不变。

第二方面，本发明提供了一种通过本发明第一方面所述方法获得的定点突变的检测方法，通过高分辨率溶解曲线分析实现。

优选地，所述的高分辨率溶解曲线分析包含以下步骤：

a)制备待检测水稻植株的dna；

b)以步骤a)制备的dna为模板进行pcr扩增；

c)将pcr产物转移至高分辨率溶解曲线分析仪器适配的pcr反应板，进行高分辨率溶解曲线分析；

d)根据高分辨率溶解曲线分析突变基因型。

优选地，步骤b)中，pcr扩增所使用的引物对包括：seqidno.4和seqidno.5所示序列组成的引物对，或seqidno.6和seqidno.7所示序列组成的引物对。

更优选地，所述的seqidno.4和seqidno.5所示序列组成的引物对用于本发明第一方面内容所述方法获得的定点突变进行检测，并且仅在所述crispr\cas9系统采用如seqidno.2所示序列或与此序列存在1至3个碱基差异的序列为sgrna引导序列的条件下使用；所述的seqidno.6和seqidno.7所示序列组成的引物对用于本发明第一方面内容所述方法获得的定点突变进行检测，并且仅在所述crispr\cas9系统采用如seqidno.3所示序列或与此序列存在1至3个碱基差异的序列为sgrna引导序列的条件下使用。

优选地，步骤b)中，pcr扩增反应组分如表1所示，

表1.hrm分析中的pcr扩增反应组分

优选地，步骤b)中，pcr扩增温度程序为：94℃2min；95℃5s，65℃20s，72℃20s，45循环；72℃1min；95℃3min；16℃2min。

优选地，步骤b)中，还包括：在pcr扩增结束后，向pcr反应液中添加入高分辨率溶解曲线分析通用的双链寡核苷酸低温内标，所述的低温内标正义链为atcgtgatttctatagttatctaagtagttggcattaataatttcatttt，配制的内标浓度为2.5pmol/μl时添加量为1μl。

优选地，步骤c)中，所述高分辨率溶解曲线分析仪器采用idaholightscanner96系统。

优选地，步骤d)中，基因分型所依据的溶解曲线应与野生型对照进行比较后判断突变情况。

有益效果

本发明提供了一种利用crispr\cas9系统对tdr基因进行定点突变的方法，用于创制具有重要应用价值的隐性雄性不育材料。与回交导入现成突变基因或通过tilling(定向诱导基因组局部突变)技术从头诱变并筛选目标突变体的传统方法相比，本发明提供的方法更加高效，而且对操作对象遗传背景的影响更小，而与通过rna干扰抑制tdr表达的方法相比，本方法对目的基因功能的敲除是彻底和永久的，而且最终可获得不含任何外源转基因成分的基因突变株系。

本发明进一步提供了一种对tdr基因定点突变进行检测的方法，通过进行高分辨率溶解曲线分析，可用于对通过第一方面方法获得的t0代转化子中tdr基因靶位点是否发生突变进行初步检测，也可进一步用于对获得的不同突变基因型进行筛选以鉴定出易于与野生型进行基因分型的特定tdr突变型，并在需要时对其进行基因分型检测，特别地，例如用于需要从tdr无功能突变的杂合突变体自交后代分离群体的可育株中鉴定出杂合基因型的情况。本方法克服了利用常规pcr产物进行电泳的常规检测方法难以直接对短片段indel突变进行分型的缺点，免除了传统caps\dcaps标记检测方法需要酶切的过程，流程更加简单，效率更高，与常规sanger测序相比，免除了pcr产物纯化过程，不仅效率更高而且成本更加低廉，此外本发明的提供的分型方法一次检测的样品量可少至几个样品，也可多至96个样品，检测通量十分灵活。总之，本发明提供的突变分型方法具有检测通量灵活可变，效率高，成本低廉的优点。

附图说明

图1为实施例1中通过crispr/cas9系统创制的tdr基因突变基因型。wt，野生型；#加数字，靶位点1的突变类型编号；##加数字，靶位点2的突变类型编号；野生型序列中灰色底纹者为与crispr/cas9系统sgrna引导序列对应的基因序列位点，其中加粗且加下划线碱基分别表示cas9系统中u3或u6启动子起始转录碱基a或g，加框碱基tgg表示spcas9pam位点ngg，黑色倒三角指示cas9核酸酶切割位点，所有序列方向均为5′-3′；突变体序列中短线“-”示缺失碱基，下划线者示对应位置碱基缺失后插入的碱基，余为与野生型相同者；图右边数字表示缺失(用“-”表示)或插入(用“+”表示)的碱基数；

图2展示了实施例1中创制的tdr基因突变雄性不育株系表型。图中包含了野生型和突变体的穗子及一个雄蕊上的花药。野生型穗子结实正常，花药室中包含黄色花粉颗粒；突变体穗子全部为空瘪粒，花药室中无花粉。

图3为实施例中高分辨率溶解曲线检测的高分辨率溶解曲线图谱。图a和b为对部分tdr基因定点突变t0植株进行检测的结果，显示所有检测的植株其tdr靶位点扩增片段溶解曲线与野生型均存在差异，揭示这些植株中靶位点发生突变；图c和d是对筛选获得的易于与野生型进行基因分型的突变型进行分型检测的结果，显示两种突变基因的纯合突变型、杂合突变型与野生型三种基因型之间能良好区分。图a和c为利用针对靶位点1设计的引物对检测的结果，图b和d为利用针对靶位点2设计的引物对检测的结果；图中熔解曲线标注的文字显示该曲线代表植株的基因型；突变型编号对应突变体序列参见图1；横轴为温度，纵轴为归一化并取导数的荧光值曲线。

具体实施方式

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

除非另外指明，否则本发明的实施将采用本领域常规的生物学技术和农业领域技术。除非另外指明，否则本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如书籍《分子克隆实验指南(第3版)》(j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔著；黄培堂等译；科学出版社，2008)中所述的条件，或按照制造试剂或设备厂商所建议的条件。

实施例1、在水稻中通过crispr\cas9敲除tdr基因创制隐性雄性不育株系

通过如下步骤完成tdr基因(msu水稻基因组数据库基因编号为loc_os02g02820；rap水稻基因组数据库编号为os02g0120500；其蛋白质序列如seqidno.1所示)的敲除及获得雄性不育株：

1)设计crispr\cas9系统sgrna引导序列

利用在线工具crispr-p(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)，按照开发者提供的方法，设计crispr\cas9系统针对tdr基因的引导序列(也等同于靶位点序列)，本实施例选择两种引导序列(即选择两个靶位点)予以实施，分别为agcacaggtctcagcactgc(即seqidno.2所示序列，对应靶位点1)和gctgcattgaggcctctagt(即seqidno.3所示序列，对应靶位点2)。

2)依据引导序列及载体要求合成用于克隆的寡核酸

本实施例采用基于载体pcambia1390(由非盈利机构cambia构建，载体序列及图谱见http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html)的crispr/cas9载体pcubi1390cas9-u3和pcubi1390cas9-u6(载体信息参考文献：龙起樟，黄永兰，唐秀英，王会民，芦明，袁林峰，万建林.利用crispr/cas9敲除osnramp5基因创制低镉籼稻，中国水稻科学，2019，33(5):407-420)，均为本申请发明者所在实验室构建。

依据设计的sgrna引导序列及载体构建要求，合成除末端四个碱基外其余碱基反向互补的寡脱氧核糖核酸：

对于引导序列为seqidno.2所示序列的情况，合成寡脱氧核糖核酸序列为：ggcagcacaggtctcagcactgc(命名为gtdru3-f)和aaacgcagtgctgagacctgtgc(命名为gtdru3-r)，而对于引导序列为seqidno.3所示序列的情况，合成寡脱氧核糖核酸序列为cttgctgcattgaggcctctagt(命名为gtdru6-f)和aaacactagaggcctcaatgcag(命名为gtdru6-r)。

3)退火寡核酸形成接头

用1倍te缓冲液溶解寡核酸，终浓度为100pmol/μl，将互补的寡核酸各取等量混合后加入2％体积的5mnacl(此方法中退火体系各组分及终浓度约为：10mmtris-cl，1mmedta，100mmnacl，两种互补寡核酸各自50pmol/μl)，混匀，于pcr仪(杭州晶格t960)中95度2分钟，自然冷却至室温，接头即制成，把接头稀释50倍至1pmol/μl备用。

4)酶切和回收

用限制性内切酶aari(生产商：thermoscientific；货号：er1581)酶切crispr/cas9载体pcubi1390cas9-u3或pcubi1390cas9-u6。

酶切体系：质粒5μg，aari酶3u，10×aari缓冲液4μl，50×oligonucleotide(0.025mm；酶生产商提供)0.8μl，补水至40μl；

酶切条件：37℃温育10小时；

回收载体质粒dna：直接乙醇沉淀回收，具体地，在酶切体系中加入4μl3mnacl，再加入88μl乙醇，-20度低温保持30min，12000g/min离心10min，弃掉上清，再用70％乙醇洗涤2遍，待样品干燥后用50μl水溶解质粒dna。

5)连接

连接反应体系为：t4连接酶缓冲液1μl，乙醇沉淀回收的载体100ng左右，接头1pmol，t4连接酶(生产商neb，货号m0202s)1μl，ddh2o补足至10μl总体积；

连接反应条件为：16℃连接2h。

连接时将gtdru3-f和gtdru3-r制作的接头与载体pcubi1390cas9-u3相连接，将gtdru6-f和gtdru6-r制作的接头与载体与pcubi1390cas9-u6相连接。

6)转化大肠杆菌：把10μl全部连接产物全部接入100μl商业化的大肠杆菌dh5α化学感受态细胞(生产商北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；货号mcc001)，转化方法依据生产商提供的方法，用含卡那霉素的平板筛选阳性克隆。

7)测序

挑单克隆，以如下引物对单克隆进行测序，选取正确克隆，扩大繁殖提取质粒。测序引物为：

osu3-f(ggcatgcatggatcttggaggaat)(检测克隆正确性，启动子为u3时用)；

osu6-f(ttgagcgattacaggcgaaagtg)(检测克隆正确性，启动子为u6时用)；

35s-f(tgacgcacaatcccactatccttc)(35s正向引物，检测载体完整性)；

cas9-r-1(tcgagcctgcgggacttagag)(cas95′端引物，检测载体完整性)；

c126(tcgtgaagaagaccgaggtt)(cas93′端引物，检测载体完整性)。

8)转化农杆菌

用常规的反复冻融法将正确克隆质粒转化至常规cacl2法制备的eha105农杆菌化学感受态细胞中，具体地，农杆菌感受态细胞的制备及转化包含如下步骤：

i)取-70℃保存的eha105于含50μg/ml利福平板划线，28℃培养。

ii)挑取单菌落接种于5mlyep液体培养基中，220rpm28℃振荡培养12-16hr。

iii)取2ml菌液转接于100mlyep液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至od600＝0.5。

iv)转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清液。

v)加入10ml预冷的0.1m的cacl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，4℃5000rpm离心5min，去上清。

vi)加入4ml预冷的含15％甘油的0.1m的cacl2溶液，轻轻悬浮。

vii)农杆菌悬浮液分装于无菌1.5ml离心管中，每管200μl冻存于-70℃。

viii)双元载体转化农杆菌eha105

取1μg左右的质粒dna加入到200μleha105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，液氮放置5min，再在37℃水浴5min，接着冰浴2min，加入800μlyep液体培养基28℃、175rpm摇培3h，后涂在含50μg/ml卡那霉素的yep平板上，28℃培养到形成单菌落。

9)转化愈伤组织

利用农杆菌转化法转化粳稻品种台南11(针对两个靶位点的载体均进行转化)和宁7012(只转化针对靶位点2的载体)的愈伤组织(方法参考如下文献：tokis，haran，onok，etal.earlyinfectionofscutellumtissuewithagrobacteriumallowshigh-speedtransformationofrice.plantj，2006，47(6):969-976)。

10)对转化子中tdr基因的靶位点进行检测

提取转化子dna(本实施例中为秧苗期叶片)，利用引物tdru3hm1-f(aatggcaggttcttggagatgacag；即seqidno.4)和tdru3hrm1-r(aggaggagtccagtgggattgaag；即seqidno.5)，以及tdru6hm1-f(ggaggtggcaccagtttggatg；即seqidno.6)和tdru6hm1-r(atcaggagagagcctccagtagatg；即seqidno.7)组成的引物对分别对转化子tdr基因dna序列中包含靶位点1和靶位点2的目标序列进行pcr，将获得的pcr产物目标片段克隆至pmd-18-t载体(厂商takara，货号6011)，转化大肠杆菌，挑取单克隆测序，测10个单克隆以上，保证获得5个以上阳性克隆。

所述pcr反应的体系为：5μl10×pcrbuffer(mg²⁺plus；takara)，4μldntpmixture(各2.5mm)，5μl引物(正反向混合，各5pmol/μl)，0.5μltakarartaq(5u/μl)，2μldmso(≧99.5％)，2μldna，31.5μlh2o，总体积50μl。

所述pcr的温度程序为：95℃2min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35循环；72℃1min。

11)突变判定

将测序结果与野生型序列进行比对，分析，结果显示，品种台南11的转化子中，获得6株靶位点1发生突变的株系以及3株靶位点2发生突变的株系，品种宁7012获得3株靶位点2发生突变的株系。图1总结了所有突变序列类型，表2展示了每个突变株系的突变基因型。除宁7012品种l01株系为嵌合体外，其余均为双等位基因突变。靶位点1共存在9种突变类型，靶位点2存在10种突变类型。

表2基因编辑株系中tdr靶位点的基因型

注:“-”表示该项不存在。

12)观察和繁殖突变体，获得tdr纯合突变雄性不育株系

表2所列两个品种所有株系t0代(转基因当代)植株均表现为雄性不育，雄蕊花药室中无花粉(如图2所示)。为了繁殖这些突变材料，将部分株系作母本与原始亲本杂交，从通过杂交获得的t1植株中通过叶片潮霉素抗性试验(方法参考文献：刘巧泉，陈秀花，王兴稳，彭凌涛，顾铭洪.一种快速检测转基因水稻中潮霉素抗性的简易方法.农业生物技术学报，2001，9(03):264-268)选择不含转基因成分的单株让其自交繁殖获得t2代植株，理论上，后来将出现1/4不育株，3/4可育株，其中的不育株为某种突变型的纯合株，而可育株中有1/3为野生型，2/3为杂合突变株，观察发现，t2代植株中有不育株和可育株分离，其中不育株占约1/4，下一步进一步利用高分辨率溶解曲线分析法对t2代群体中的不育株(即纯合突变株)与野生型进行分析，以筛选出容易与野生型进行基因分型的突变类型。

实施例2、利用高分辨率溶解曲线分析法检测易于与野生型分型的tdr突变类型并对其进行繁殖

实施例1中在获得不同基因编辑株系后代不育株(纯合突变株)后，进一步利用本发明提供高分辨率溶解曲线法对不同株系后代不育株与野生型一同分析，以筛选出易于与野生型进行分型的突变基因型。结果显示，从靶位点1和靶位点2的突变株系中各自获得了一种易于分型的突变类型，突变编号分别为#04和##07。进一步对易于分型的突变株系中的可育株进行基因分型检测，筛选出杂合突变型(高分辨率熔解曲线分析结果见图3c和d)，然后通过稻桩繁殖将杂合突变可育株与同系不育株进行杂交，后代不育株与可育株呈1:1分离，此后继续以可育株与不育株杂交的方式对筛选获得的不育突变株系进行繁殖。

本实施例中采用的高分辨率溶解曲线分析方法具体如下：

高分辨率溶解曲线分析利用idaholightscanner96系统进行，采用小片段扩增法。pcr引物及扩增子：利用引物tdru3hm1-f(aatggcaggttcttggagatgacag；即seqidno.4)和tdru3hrm1-r(aggaggagtccagtgggattgaag；即seqidno.5)，以及tdru6hm1-f(ggaggtggcaccagtttggatg；即seqidno.6)和tdru6hm1-r(atcaggagagagcctccagtagatg；即seqidno.7)组成的引物对分别对转化子tdr基因dna序列中包含靶位点1和靶位点2的目标序列进行pcr，扩增产物分别为106bp和90bp。

pcr反应体系如下：1μl10×pcrbuffer(mg²⁺plus；takara)，0.8μldntpmixture(各2.5mm)，1μl引物(正反向混合，各5pmol/μl)，0.1μltakarartaq(5u/μl)，0.4μldmso(≥99.5％)，1μldna，1μllc-green荧光染料，4.7μlh2o，总体积10μl，上加20μl矿物油。

pcr温度程序：94℃2min；95℃5s，65℃20s，72℃20s，45循环；72℃1min；95℃3min；16℃2min。

pcr结束后反应液加入1μl低温内标(浓度为2.5pmol/μl)，然后将pcr体系连同石蜡油全部转入专用pcr板(bio-rad，blackshell/whitewellpcrplate，货号hsp9665)中进行hrm分析，分析温度范围65-95度。数据分析处理用系统自带软件进行，分析方式选择小片段法。

实验中添加低温内标可以改善具有相同基因型的不同样品溶解曲线的集中度，以提高分析效果的准确性，低温内标为双链寡核酸，其正义链序列为atcgtgatttctatagttatctaagtagttggcattaataatttcatttt，制作方法与前文所述引导序列寡核酸接头制作所用的相同。

实施例3、利用高分辨率溶解曲线分析法初步检测tdr定点突变t0代转化子靶位点基因突变情况

利用实施例2中所述相同的方法对实施例1中获得的tdr基因定点敲除t0代转化苗进行了检测，并与测序结果进行比较，发现所有存在基因突变的植株其高分辨溶解曲线与野生型相比呈现明显差别(见图3a&b)，因而利用本发明提供方法对定点突变当代转化苗进行检测，可快速判断转化子靶位点是否存在基因突变。

序列表

<110>江西省超级水稻研究发展中心

<120>利用crispr\cas9系统对水稻tdr基因进行定点突变及检测的方法

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