一种罗氏沼虾线粒体COI基因扩增引物的制作方法

本发明涉及虾类生物线粒体基因获取技术领域，

尤其是，本发明涉及一种罗氏沼虾线粒体coi基因扩增引物。

背景技术：

罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii)隶属于甲壳纲(crustacea)、十足目(decapoda)、长臂虾科(palaemonidae)、沼虾属(macrobrachium)，原产于东南亚的热带和亚热带地区，是淡水虾类养殖中个体最大的品种，在东南亚一些天然水域里，发现其最大个体中，雄虾体长可达40cm、体重654g，雌虾体长25cm、体重200g。中国大陆自1976年引进该虾，经过广大科研工作者及产业推广者的努力，中国已成为全球罗氏沼虾养殖最多的国家，养殖产量占世界总产量的60%左右。但由于长期近亲繁殖、高密度养殖等，引起种质衰退、抗逆能力差、性早熟等，严重影响了虾农的增产增收。因此，进一步培育满足产业与市场需求的经济性状优良的罗氏沼虾新品种或新品系迫在眉睫。遗传多样性是物种进化的基础，与进化潜力和适应力呈正相关，遗传多样性越高的群体，其生产性状如活力、生长速度、产卵量、环境适应力及抗病性能等提高的潜力越大。因此，遗传多样性水平不仅制约着生物的适应性进化，也是选择育种的前提。

线粒体dna(mitochondrialdna,mtdna)是一种核外的遗传物质，与核dna相比，mtdna具有分子量小、结构简单、进化速度快、母系遗传等特点。另外，mtdna基因排列紧凑，几乎没有间隔序列和内含子，易采用通用引物进行pcr扩增获得目的基因片段。因此，线粒体基因被认为是研究动物进化、群体遗传多样性和遗传结构的有力工具。目前，已有一些关于罗氏沼虾线粒体coi基因遗传多样性的研究报道，但已有的研究采用的coi基因片段都较短，长度约400bp～500bp，提供的数据量有限。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种罗氏沼虾线粒体coi基因扩增引物。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

一种罗氏沼虾线粒体coi基因扩增引物，该引物序列为：

上游引物序列为seqidno.1，即coif：

5'-caacgtaattgtcactgcccacg-3'；

下游引物序列为seqidno.2，即coir：

5'-gtatctgtgatctgctggtggga-3'。

本发明还提供一种如权利要求1所述的罗氏沼虾线粒体coi基因扩增引物的设计方法，包括以下步骤：

登陆美国国立生物技术信息中心下载已有的罗氏沼虾线粒体基因组全序列；

将下载的罗氏沼虾线粒体基因组序列用clustalx软件进行比对，并定位coi基因的位置，确定其两端保守区域；

在确定的保守区域用引物设计软件primer6进行上下游引物的设计。

本发明还提供一种对罗氏沼虾线粒体coi基因进行扩增的方法，采用上述所述的罗氏沼虾线粒体coi基因扩增引物对罗氏沼虾的dna模板溶液进行pcr扩增。

优选地，pcr扩增条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性30s、56-62℃退火30s、72℃延伸30s，重复10次循环，每次循环降低1℃；然后再95℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s，重复25次循环；最后72℃延伸20min。

优选地，pcr扩增体系包括：灭菌水、10×buffer、dntp、mgc12、上游引物、下游引物、taq酶和dna模板。

更优选地，pcr扩增体系为50μl，包括：灭菌水31μl，10×buffer5μl，2.5mmol/l的dntp4μl，25mmol/l的mgc123μl，10μmol/l的上、下游引物各为1μl，5u/μl的taq酶0.2μl，100ng/μl的dna模板溶液5μl。

更优选地，所述dna模板溶液采用高盐法提取，并用灭菌水稀释至100ng/μl。

优选地，pcr扩增后，罗氏沼虾线粒体coi基因的片段长度为1250bp~1300bp。

与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：

本发明的一种罗氏沼虾线粒体coi基因扩增引物可使获得的罗氏沼虾线粒体coi基因片段长度增加至1300bp左右，且该引物具有条带单一、扩增效率高的特点，能够更好地满足后续罗氏沼虾线粒体基因组研究以及罗氏沼虾群体遗传多样性研究的需要。

附图说明

图1为本发明实施例pcr扩增获得罗氏沼虾线粒体coi基因片段的电泳图；

图2为本发明实施例pcr扩增获得罗氏沼虾线粒体coi基因片段测序后获得的部分代表性序列。

图1中，s1-s20代表20个罗氏沼虾样本，“空白”是阴性对照，marker为分子量标准；图2中，hap_1至hap_9代表9个不同的序列，序列间相同碱基采用小圆点表示，每段序列末尾方括号中的数字代表那一行结尾时序列中含总碱基的个数，图2示出的序列长度是1247bp。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例通过以下步骤进行罗氏沼虾线粒体coi（即细胞色素氧化酶i亚基（cytochromecoxidasesubuniti））基因扩增引物的设计、合成以及完成罗氏沼虾线粒体coi基因的扩增。

1、下载序列。登陆美国国立生物技术信息中心（ncbi，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），下载已有的罗氏沼虾线粒体基因组全序列，其genbank登录号分别为ay659990和nc006880，并定位其中coi基因的位置。

2、引物设计与合成。将genbank下载的2条罗氏沼虾线粒体基因组序列用clustalx软件进行比对，在coi基因的5'和3'端100-200个碱基对的保守区域内，肉眼观察并结合引物设计软件primer6进行上下游引物的设计并对其进行评估。设计引物时尽量避免发卡结构、引物二聚体的出现等。设计多对引物，并由武汉天一辉远生物科技公司合成。

3、dna提取。对采自江苏数丰水产种业有限公司的罗氏沼虾个体用高盐法提取dna，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测提取dna的完整性，微量分光光度计检测浓度和纯度，后用灭菌水稀释至100ng/μl供后续pcr扩增实验，dna模板母液冻存于-20℃冰箱备用。

4、使用引物扩增目的片段。在50μl的pcr反应体系中，用合成的引物扩增罗氏沼虾个体的coi基因片段，该体系包括：灭菌水31μl（可根据dna模板的用量做适当调整）、10×buffer5μl、dntp(2.5mmol/l)4μl、mgc12(25mmol/l)3μl、上下游引物(10μmol/l)各为1μl、taq酶(5u/μl)0.2μl、dna模板溶液(100ng/μl)5μl（可根据dna模板的提取质量适当调整用量）。为提高产物的特异性，pcr反应采用touchdown程序：95℃预变性5min；然后95℃变性30s、56-62℃退火30s、72℃延伸30s，重复10次循环，每次循环降低1℃；然后再95℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s，重复25次循环；最后72℃延伸20min。

5、对扩增出的产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一，扩增效率高的一对引物，上游引物为coif：5'-caacgtaattgtcactgcccacg-3'，对应于genbank中编号为ay659990的罗氏沼虾线粒体基因组序列中的156-178位点，下游引物为coir：5'-gtatctgtgatctgctggtggga-3'，对应于genbank中编号为ay659990的罗氏沼虾线粒体基因组序列中的1487-1509位点。pcr扩增产物送武汉天一辉远生物科技公司进行纯化回收，并采用和扩增相同的引物进行正反向双向测序，获得目的片段。该引物设计的目标片段长度约1300bp，经测序后，删去首尾测序信号不准确的碱基后，可获得1250bp左右的序列长度供后续分析。采用本发明引物进行pcr扩增获得罗氏沼虾线粒体coi基因片段的电泳图如图1所示。经测序后获得的部分代表性序列如图2所示。

本发明的一种罗氏沼虾线粒体coi基因扩增引物可使获得的罗氏沼虾线粒体coi基因片段长度增加至1300bp左右，且该引物具有条带单一、扩增效率高的特点，能够更好地满足后续罗氏沼虾线粒体基因组研究以及罗氏沼虾群体遗传多样性研究的需要。

本发明不局限于上述具体的实施方式，本发明可以有各种更改和变化。凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖州师范学院

<120>一种罗氏沼虾线粒体coi基因扩增引物

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>coif

<400>1

caacgtaattgtcactgcccacg23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>coir

<400>2

gtatctgtgatctgctggtggga23