检测猪瘟病毒的RT-RAA引物、探针和试剂盒及应用的制作方法

本发明是关于动物疫病检测技术领域，特别是关于一种检测猪瘟病毒的rt-raa引物、探针和试剂盒及应用。

背景技术：

猪瘟(classicalswinefever,csf)是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,csfv)引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，特征为高热稽留和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死，具有很高的发病率和死亡率，被世界动物卫生组织(oie)列为a类法定传染病之一。猪是本病原唯一的自然宿主，病猪和带毒猪是最主要的传染源。猪瘟对猪危害极为严重，会造成养猪业巨大的经济损失。近年来猪瘟流行和发病特点发生了许多新变化，出现非典型猪瘟、温和型猪瘟，散发性流行，发病特点及临床症状轻或不明显，死亡率低，病理变化不特征，而且常呈隐性感染，给临床确诊带来了很大的困难，须依赖实验室诊断才能确诊。

为了降低猪瘟给养猪业带来的巨大经济损失，需要快速、准确的诊断技术。目前，冰冻切片直接荧光抗体(fa)试验是检查csfv抗原的方法之一，扁桃体是首选病料，此外血清中和试验、elisa、pcr、动物接种试验如兔体交互免疫试验等方法，也是目前实验室较常用的检测方法，都可对猪瘟进行确诊，且对该病的诊断和防控发挥了重要作用。常规诊断方法存在操作复杂，需要复杂的仪器设备，所需时间长的缺点，不利于猪瘟的快速诊断，也不适合基层和现场即时检测(pointofcaretesting，poct)。因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高的猪瘟病毒检测方法，对该病的诊断和防控具有重要意义。

重组酶介导的等温扩增反应(recombinaseaidedamplification,raa)是一种新型的等温体外核酸扩增技术，反应在37-42℃条件下30min内即可得到与传统pcr反应相当的扩增产物。raa技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性。重组酶与引物结合形成的蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，在单链dna结合蛋白的帮助下，打开模板dna的双链结构，并在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互补链，从而对模板上的目标区域进行指数式扩增。

raa反应简单快速，对仪器要求简单，不需要热循环反应的温度控制仪器。在基础体系中添加逆转录酶，省去了额外的cdna合成步骤，可以对rna模板进行一步法扩增。利用exo探针技术和核酸外切酶iii，能实现数据的实时读取，就像荧光定量pcr一样。将exo探针技术、核酸外切酶iii和逆转录酶结合起来的exort-raa，可以一步实现对rna模板的实时扩增。该技术具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、能实现现场快速检测等特点。再根据探针中的fam是一种绿色荧光基团，其在蓝光下可以被激发出绿色荧光，因此可以结合便携式蓝光仪器对raa扩增产物进行可视化的判断，适用于即时检测，是未来核酸检测方面具有推广应用前景的等温扩增技术。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测猪瘟病毒的rt-raa引物和探针，通过所述引物和探针对猪瘟病毒实施逆转录重组酶介导等温扩增(reversetranscriptionrecombinase-aidedamplification，rt-raa)，以实现对猪瘟病毒进行快速、特异、灵敏、可视化、简便的检测。

为实现上述目的，本发明提供了一种检测猪瘟病毒的rt-raa引物和探针，包括用于鉴定猪瘟病毒5’ntr基因的正向引物csfv-5’ntr-f、反向引物csfv-5’ntr-r和探针csfv-5’ntr-probe，所述正向引物csfv-5’ntr-f、反向引物csfv-5’ntr-r和探针csfv-5’ntr-probe的序列如下：正向引物csfv-5’ntr-f：5’-actgggctagccatgcccacagtaggactagcaaa-3’(seqidno.1)，反向引物csfv-5’ntr-r：5’-gcttctgctcacgtcgaactactgacgactg-3’(seqidno.2)，探针csfv-5’ntr-probe5’-actagccgtagtggcgagctccctgggtggtctaagtcctgagtacag-3’(seqidno.3)。

在本发明的一实施方式中，所述探针csfv-5’ntr-probe自5’端起第31位碱基t标记fam发光基团，第32位碱基c被四氢呋喃thf代替，第33位碱基t标记bhq1淬灭基团，3’端进行c3-spacer阻断修饰。

本发明还提供了一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述检测猪瘟病毒的rt-raa引物和探针。

在本发明的一实施方式中，所述试剂盒还包含逆转录重组酶介导等温扩增的试剂。

在本发明的一实施方式中，所述试剂包括反应缓冲液、rnasefreeddh2o、含有镁离子的缓冲液、和rt荧光基础反应单元。

在本发明的一实施方式中，所述含有镁离子的缓冲液为醋酸镁，所述rt荧光基础反应单元包含单链dna结合蛋白、重组酶、逆转录酶和聚合酶，优选的，所述rt荧光基础反应单元以冻干粉的形式存在。

本发明还提供了上述检测猪瘟病毒的试剂盒在制备检测猪瘟病毒制剂中的应用，包括以下步骤：提取rna：提取待测样品的rna；rt-raa反应体系扩增：以提取的rna为模板，加入试剂盒中检测猪瘟病毒的rt-raa引物和探针以及包含逆转录重组酶介导等温扩增的试剂组成rt-raa反应体系进行rt-raa扩增；以及结果判定：质控标准：阴性对照无扩增曲线或可视化结果为无色，且阳性对照出现扩增曲线或可视化结果为绿色，则实验数据有效，否则实验结果为无效；结果描述及判定：待检测样品无扩增曲线或可视化结果为无色，样品判为阴性；出现扩增曲线或可视化结果为绿色，样品判为阳性；其中，阴性对照中的模板加入的是rnasefreeddh2o，阳性对照中的模板为已知csfv毒株的rna模板。

在本发明的一实施方式中，所述rt-raa反应体系的总体系为50μl，含有反应缓冲液29.4μl，10pmol/μlcsfv-5’ntr-f和csfv-5’ntr-r各2μl，10pmol/μlcsfv-5’ntr-probe0.6μl，rnasefreeddh2o和待检测的样品rna模板共13.5μl，醋酸镁2.5μl，rt荧光基础反应单元(包含单链dna结合蛋白、重组酶、逆转录酶和聚合酶)。

在本发明的一实施方式中，所述rt-raa的反应条件为在42℃下恒温扩增30min。

在本发明的一实施方式中，所述结果判定是通过蓝光检测仪器进行结果的可视化判断的，优选的，可视化结果是使用天根生化科技有限公司的便携式tgreenmonitor蓝光电泳监测仪(ose-470m)在暗室中直接进行肉眼判断。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

首先，本发明提供一种检测猪瘟病毒的rt-raa引物、探针和试剂盒及应用。采用包含rt-raa引物和探针的试剂盒检测猪瘟病毒仅需在37-42℃恒温条件下反应30min即可完成，该方法反应快速，对仪器要求简单，不需要热循环反应的温度控制仪器，大大缩短了反应时间，适用于即时检测(pointofcaretesting，poct)，可以真正实现便携式的快速核酸检测。

其次，rt-raa扩增结果可以通过便携式蓝光仪进行肉眼可视化判断，以实现对csfv进行快速、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。

再次，本发明通过逆转录重组酶介导的等温扩增方法(rt-raa)检测猪瘟病毒，操作简单、用时短，仪器小巧携带方便，可移动，适合在基层或现场进行猪瘟的快速检测，为猪瘟的早期防控争取宝贵的时间。

附图说明

图1a是根据本发明一实施方式的猪瘟病毒的rt-raa优化的引物筛选原理示意图；

图1b是根据本发明一实施方式的猪瘟病毒的rt-raa优化的引物和探针具体位置的示意图；

图2a是根据本发明一实施方式的检测最佳反应温度的real-timert-raa扩增结果；

图2b是根据本发明一实施方式的检测最佳反应温度的rt-raa可视化的结果；

图3a是根据本发明一实施方式的检测引物和探针特异性的real-timert-raa扩增结果；

图3b是根据本发明一实施方式的检测引物和探针特异性的real-timert-qpcr扩增结果；

图3c是根据本发明一实施方式的检测引物和探针特异性的rt-raa可视化的结果；

图4a是根据本发明一实施方式的检测引物和探针灵敏性的real-timert-raa扩增结果；

图4b是根据本发明一实施方式的检测引物和探针灵敏性的real-timert-qpcr扩增结果；

图4c是根据本发明一实施方式的检测引物和探针灵敏性的rt-raa可视化的结果。

主要附图标记说明：

1：42℃；2：41℃；3：40℃；4：39℃；5：38℃；1’：猪伪狂犬病毒；2’：猪繁殖与呼吸综合征病毒；3’：猪圆环病毒2型；4’：猪流行性腹泻病毒；5’：猪德尔塔冠状病毒；6’：猪a型塞内卡病毒；7’：牛病毒性腹泻病毒；8’：猪瘟病毒；9’：阴性对照；1”：10³tcid50rnacsfv；2”：10²tcid50rnacsfv；3”：10¹tcid50rnacsfv；4”：10⁰tcid50rnacsfv；5”：10^-1tcid50rnacsfv；6”：阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

本发明所涉及到的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1猪瘟病毒rt-raa检测引物及探针设计与筛选

通过ncbi查找到来自世界各国的51条公开的猪瘟病毒的全基因组序列，利用vectornti软件对这51株csfv全基因组序列进行比对分析保守区域，经同源性分析后，发现csfv的5’ntr基因非常保守，因此根据csfv的5’ntr基因的最保守区域设计rt-raa的引物和探针。rt-raa引物的设计遵循以下基本原则：引物长度应大于等于30bp，最好在30-35bp之间；扩增子长度不超过500bp，最好长度为100-200bp之间；gc含量大于30％，小于70％，最好在40％到60％之间；最好避免引物中存在许多重复的短序列；避免引物直接形成发夹结构，或引物二聚体的形成等等。为保证rt-raa扩增效率，需要对引物进行大量的筛选，从而能获得更好的引物组合。引物筛选原则如下：第一次筛选是用某一正向引物对所有反向引物进行筛选，再选择最优的反向引物对所有正向引物进行筛选，最终筛选出一对好的引物。对于需要获得高灵敏度的引物组合需进行第二次引物筛选，其筛选方法用第一次筛选出来的最佳引物组合进行如下改进：将其在模板上的位置以1-3个碱基的速度前后移动或在引物两端增加和去掉碱基，来筛选出比第一次的引物更好的引物组合。

设计了下表1的引物组合和探针，按照上面引物筛选原则进行筛选。

表1设计的引物组合和探针序列

引物对和探针的筛选包括如下步骤：

1)配制rt-raa反应体系

总体系50μl，含有反应缓冲液29.4μl，10pmol/μlcsfv-5’ntr-f和csfv-5’ntr-r各2μl，10pmol/μlcsfv-5’ntr-probe0.6μl，rnasefreeddh2o和待检测的样品rna模板共13.5μl，醋酸镁2.5μl，rt荧光基础反应单元(包含单链dna结合蛋白、重组酶、逆转录酶和聚合酶的冻干粉)，购自潍坊安普未来生物科技有限公司。阴性对照模板加入的是rnasefreeddh2o，阳性对照模板为已知csfv毒株的rna模板。

2)rt-raa反应体系扩增

将检测反应条件设置为：在42℃下恒温扩增30min。

可视化结果是使用天根生化科技有限公司的便携式tgreenmonitor蓝光电泳监测仪(ose-470m)在暗室中直接进行肉眼判断。

质控标准：阴性对照无扩增曲线或可视化结果为无色，且阳性对照出现扩增曲线或可视化结果为绿色，则实验数据有效，否则实验结果为无效。

结果描述及判定：待检测样品无扩增曲线或可视化结果为无色，样品判为阴性；出现扩增曲线或可视化结果为绿色，样品判为阳性。阳性起峰时间早，扩增速度快，或可视化结果的颜色越亮，说明该引物组合和探针越好。

引物筛选步骤如下：第一次筛选是固定某一上游引物f4，然后对r1，r2，r3，r4，r5，r6，r7，r8这8对下游引物进行筛选，筛选出了r2是最优下游引物，再固定最优的下游引物r2，然后对f1，f2，f3，f4，f5，f6这6对上游引物进行筛选，筛选出了f3是最优的上游引物，因此，第一次筛选的最佳引物组合是f3和r2。对于需要获得高灵敏度的引物组合需进行第二次引物筛选，需用第一次筛选出来的最佳引物组合进行如下改进：将第一次筛选出来的最佳引物在模板上的位置以1-3个碱基的速度前后移动或在引物两端增加和去掉碱基，来继续筛选出比第一次的引物更好的引物组合。最终筛选出了上游引物f3-5和下游引物r2-2组合是最佳引物组合。引物筛选示意图如图1a所示。

最终筛选出最佳引物组合和探针序列如下：正向引物csfv-5’ntr-f：5’-actgggctagccatgcccacagtaggactagcaaa-3’、反向引物csfv-5’ntr-r：5’-gcttctgctcacgtcgaactactgacgactg-3’、探针csfv-5’ntr-probe：5’-actagccgtagtggcgagctccctgggtgg(fam-dt)(thf)(bhq1-dt)aagtcctgagtacag[c3-spacer]，其中探针自5’端起第31位碱基t标记fam发光基团，第32位碱基c被四氢呋喃thf代替，第33位碱基t标记bhq1淬灭基团，3’端进行c3-spacer阻断修饰。

实施例2猪瘟病毒rt-raa最佳反应温度的筛选

设置5组(1：42℃；2：41℃；3：40℃；4：39℃；5：38℃)不同温度的反应条件，使用筛选出来的最佳引物组合和相同模板在相同体系中进行rt-raa反应。

通过图2a-2b中的结果显示，在最短的时间内产生最强的荧光信号的反应温度是42℃，因此，本发明的猪瘟病毒rt-raa最佳反应温度为42℃。

实施例3引物探针的灵敏度和特异性检测

检测灵敏度

设置5组不同浓度的猪瘟病毒rna模板，在rt-raa最适条件下进行核酸的扩增。

参照rna提取试剂说明书提取猪瘟病毒rna，用5x10⁵tcid50/ml原始毒价的猪瘟细胞毒，稀释到10³tcid50/2ul,然后10倍分别稀释到10²tcid50/2ul，10¹tcid50/2ul，10⁰tcid50/2ul，10^-1tcid50/2ul，分别取2μl作为反应模板，并设置阴性对照，按照前述加样方法进行rt-raa核酸扩增。同时用已发表文献(hainesetal.,2013)中的real-timert-qpcr方法进行对比。

通过图4a-4c中的结果显示，本发明设计的引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，检测灵敏度10¹tcid50csfvrna/反应，且可视化的灵敏度也能达到10¹tcid50csfvrna/反应。

检测特异性

分别用猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪a型塞内卡病毒、牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒作为反应模板，并设置阴性对照，按照前述加样方法进行rt-raa核酸扩增。同时用已发表文献(hainesetal.,2013)中的real-timert-qpcr进行对比。检测反应条件为：42℃恒温扩增30min。通过图3a-3c中的结果显示，除了猪瘟病毒rna模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线和可视化的绿色荧光结果，其他病毒及阴性对照组均未出现扩增曲线且可视化结果为无色。结果表明，本发明所使用的引物和探针可以实现对猪瘟病毒的特异性检测，不与其他相关病毒发生交叉反应。

实施例4对实际样品的检测应用

取临床组织病料和细胞毒样品共114份，按照rna提取试剂说明书提取待检的114份临床样品，提取的rna放在-80℃保存(反复冻融最好不超过3次)。按照前述加样方法进行rt-raa核酸扩增。同时用已发表文献(hainesetal.,2013)中的real-timert-qpcr方法同时检测此临床样品进行对比。

结果显示，如下表2所示，114份临床样品real-timert-raa检出阳性49份(43％)，real-timert-qpcr检出阳性51份(44.7％)，可视化rt-raa检出阳性45份(39.5％)。real-timert-raa与real-timert-qpcr的kappa值为0.964，p＜0.001，可视化rt-raa与real-timert-qpcr的kappa值为0.892，p＜0.001。

表2临床样品检测结果

综上所述，本发明中的方法可以实现对猪瘟病毒进行快速、特异、灵敏、可视化、简便的检测。该方法反应快速，对仪器要求简单，不需要热循环反应的温度控制仪器，适合在基层或现场进行该病的即时检测，可以真正实现便携式的快速核酸检测。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110>中国农业大学

<120>检测猪瘟病毒的rtraa引物、探针和试剂盒及应用

<130>p200352dd1f

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

actgggctagccatgcccacagtaggactagcaaa35

<210>2

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcttctgctcacgtcgaactactgacgactg31

<210>3

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

actagccgtagtggcgagctccctgggtggtctaagtcctgagtacag48