一种棘沟赖利绦虫鉴定的PCR方法与流程

本发明具体涉及一种棘沟赖利绦虫鉴定的pcr方法，属于感染家禽的赖利属绦虫种属的鉴别领域。

背景技术：

绦虫病是严重危害鸡健康和养殖业的寄生虫疾病。寄生于鸡的绦虫隶属于扁形动物门、绦虫纲、圆叶目、戴文科的赖利属绦虫。赖利属绦虫寄生于家鸡、火鸡和雉鸡等多种家禽的小肠中，通过营养吸收和毒素释放，造成鸡发育受阻、生长缓慢、出现消瘦、贫血、中毒等症状。大量的绦虫寄生还会造成鸡肠道阻塞，诱发肠梗阻和急性炎症。鸡可以单独感染一种绦虫，也可以遭受多种绦虫的混合感染。近年来全球报道的鸡感染赖利属绦虫病例大大增加，已发现的赖利属绦虫有200多种。目前对于赖利属绦虫种类的鉴定，主要依赖于形态学特征观察，通过对虫体大小、头节形状、顶突、小钩以及孕卵节片结构等的细微差异加以区分。常规的形态学鉴定方法存在用时长、操作复杂和判断不准确等缺点，而且随着赖利属绦虫发现数量的增加，关于赖利属绦虫形态学的描述产生较大分歧，大大加大了赖利属绦虫鉴定的难度。

核糖体是细胞中广泛存在的细胞器，是细胞蛋白质合成的主要场所。真核生物的核糖体dna(rdna)是细胞核内编码核糖体rna(rrna)的基因，真核生物rdna由重复的单拷贝基因串联组成，每个单拷贝基因由18s、5.8s和28s组成一个转录元，18s、5.8s和28s之间分别被rdna内转录间隔区its1和its2分隔开。核糖体18s是真核生物的染色体上编码核糖体小亚基rna的基因，在核糖体中进化速率最慢，具有高度保守性。its序列是核糖体dna中介于18s和28s之间的内转录间隔区，核糖体dna第一内转录间隔区its1位于18srdna和5.8srdna之间的，核糖体dna第二内转录间隔区位于5.8srdna和28srdna之间。近年来随着寄生虫基因测序数据的完善，18s和its2被广泛用于寄生虫属内、种内鉴定及遗传进化关系分析。棘沟赖利绦虫是威胁鸡健康和养殖最大的赖利属绦虫种类，本发明的目的在于提供一种快速、准确鉴定棘沟赖利绦虫的pcr方法，解决传统棘沟赖利绦虫种属鉴定缺点。

技术实现要素：

棘沟赖利绦虫是威胁鸡健康和养殖最大的赖利属绦虫种类，目前对于棘沟赖利绦虫的鉴定仍然依赖于传统的虫体形态学特征，存在用时长、操作复杂和判断不准确等缺点。本发明参考已公布的赖利属绦虫核糖体基因序列，自主设计18srdna和its-2rdna引物，通过对pcr方法进行优化，准确扩增棘沟赖利绦虫18srdna和its-2rdna基因产物，建立一种基于18srdna和its-2rdna双基因确认的快速、准确鉴定棘沟赖利绦虫的pcr方法。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种棘沟赖利绦虫鉴定的pcr方法，提供棘沟赖利绦虫种属鉴定的18srdna和its-2rdna两种基因检测引物，所述方法包括以下步骤：

步骤1，棘沟赖利绦虫的收集与形态学鉴别：收集绦虫感染鸡病例，放血法处死病鸡，取出完整消化道，小心剪开肠道，将发现的绦虫与肠道一起置于清水中，待绦虫头节脱离肠黏膜并充分舒展后转入生理盐水中清洗，清洗干净后将每条虫体进行单独保存，一部分虫体冻存于-80℃冰箱，准备提取虫体dna，一部分虫体固定于戊二醛水溶液中，做扫描电镜观察，一部分虫体置于多聚甲醛水溶液中固定，做苏木素-伊红染色；

步骤2，dna提取：绦虫虫体30mg，用组织dna提取试剂盒提取绦虫虫体dna；

步骤3，pcr扩增：

(1)引物设计：

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18srdna基因上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示：18s-f:5′-ctgagaaacggctaccact-3′；

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18srdna基因下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示：18s-r:5′-acgccagacgaactacac-3′；

用于鉴定棘沟赖利绦虫的its-2rdna基因上游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示：its-2-f:5′-tattgcggccataggttt-3′；

用于鉴定棘沟赖利绦虫的its-2rdna基因上游引物的核苷酸序列如seqidno.4所示：its-2-r:5′-cgtgagtacccgctgaac-3′；

(2)pcr反应：

准备第一pcr反应管和第二pcr反应管，第一pcr反应管中加入2×mastermix，步骤2提取的绦虫虫体dna为模板，18srdna上、下游引物，去离子水，进行pcr反应；第二pcr反应管中加入2×mastermix，步骤2提取的绦虫虫体dna为模板，its-2rdna上、下游引物，去离子水，进行pcr反应；制备琼脂糖凝胶溶液用tae电泳缓冲液，凝胶凝固前gelred荧光染料，以示踪凝胶电泳中的pcr扩增产物；凝胶凝固后向点样孔中加入pcr扩增产物溶液，在电压条件下电泳，在凝胶成像仪下观察pcr扩增产物分子大小及电泳条带清晰度，拍照；

步骤4，pcr扩增产物测序：用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒将第一pcr反应管和第二pcr反应管pcr扩增产物的电泳条带进行回收，分别将回收得到的18srdna与its-2rdnapcr扩增产物与pmd19-t载体连接，连接pmd19-t载体后转化入dh5α感受态细胞，用含氨苄青霉素的lb琼脂平板培养基对pmd19-t载体转化的dh5α感受态细胞进行阳性筛选，阳性菌落扩大培养后对菌落进行pcr测序，获得18srdna和its-2rdnapcr扩增产物基因序列；

步骤5，序列分析：分别将18srdna和its-2rdnapcr扩增产物基因序列与genbank数据库中公布的赖利属绦虫18srdna、its-2rdna序列进行比对，用mega软件分别将18srdna和its-2rdnapcr扩增产物基因序列与已公布的序列进行遗传进化关系分析。

进一步，所述步骤1中戊二醛水溶液的体积分数为2.5％，配方为：10ml体积分数为25％戊二醛水溶液加入50ml0.2m磷酸缓冲液和40ml蒸馏水，调ph＝7.4，加入蒸馏水补至100ml，其中0.2m磷酸缓冲液配方为：向磷酸二氢钠2.6g和磷酸氢二钠29g中加入蒸馏水补至500ml，调ph＝7.4；

扫描镜观察具体步骤为：剪取1～2cm用体积分数为2.5％戊二醛水溶液固定4h的虫体片段，用含质量/体积分数1％g/ml四氧化锇的0.2m的甲次砷酸钠水溶液孵育1h，梯度乙醇脱水，co2临界点干燥和喷金后置于扫描电子显微镜下观察。

进一步，所述梯度乙醇的梯度为：体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％。

进一步，所述步骤1中多聚甲醛水溶液的质量/体积分数为4％g/ml，配方为：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入0.1mol/l磷酸缓冲液500～800ml，加热至55～60℃，持续搅拌使粉末完全溶解，滴加1mol/l的naoh使溶液清亮，最后补足0.1mol/l的磷酸缓冲液至1000ml；

苏木素-伊红染色具体步骤为：剪取1～2cm用质量/体积分数为4％g/ml多聚甲醛水溶液固定24h的虫体片段，自来水充分清洗后置于染色缸中，用苏木素-伊红染液染色虫体片段0.5～1h，体积分数为1％的盐酸酒精调色30s，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后用中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

所述梯度乙醇的梯度为：体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％。

棘沟赖利绦虫判断要点：体长5～10cm，呈乳白色，不透明。头节呈圆球形，四周有4个圆形吸盘，中央有1个可伸缩的顶突，顶突上分布有两圈交替排列的小钩，每圈小钩数目约22～25个。颈节较短，起始部与头节等宽，向后逐渐增宽。颈节节片宽大于长，外形呈梯形，内部生殖系统尚未发育成熟，染色不明显。成节呈长方形，长度略大于宽度，节片内有一套生殖系统，生殖孔左右交替排列于节片外缘上1/3的位置。雄性生殖系统雄茎囊位于排泄管外侧，睾丸数目30～40个，分布于节片前段的两侧，卵巢的上方。雌性生殖系统中受精囊发达，呈梨性，位于排泄管内侧，睾丸下方。卵巢呈分叶状，位于节片中央，卵黄腺位于卵巢后方。孕节肥厚，节片长大于宽，内无子宫，被卵囊所取代。卵囊呈圆形或椭圆形，散在分布于孕节各处，数量约200～400个，每个卵囊内包含1个胚化的六钩蚴。

进一步，所述步骤3(2)中第一pcr反应管的体积为200μl；第一pcr反应管进行pcr反应的反应体系为50μl；

第一pcr反应管加入2×mastermix为25μl，步骤2提取的绦虫虫体dna为1μl，18srdna上、下游引物各1μl，浓度为0.5μm，去离子水为22μl；

第一pcr反应管进行pcr反应的反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸30秒，扩增40个循环。

进一步，所述步骤3(2)中第二pcr反应管的体积为200μl；第二pcr反应管进行pcr反应的反应体系为50μl；

第二pcr反应管加入2×mastermix为25μl，步骤2提取的绦虫虫体dna为1μl，its-2rdna上、下游引物各1μl，浓度为0.5μm，去离子水22μl；

第二pcr反应管进行pcr反应的反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸30秒，扩增40个循环。

进一步，所述步骤3(2)中琼脂糖凝胶溶液的质量/体积分数为1.5％g/ml，gelred荧光染料与琼脂糖凝胶溶液的体积比例为1:5000～1:10000，pcr扩增产物溶液的体积为5～8μl；电压条件的电压为120v～150v，电泳的时间为30min～40min。

进一步，所述步骤4氨苄青霉素的浓度为50μg/ml。

进一步，所述步骤4中18srdna扩增产物基因序列如seqidno.5所示，its-2rdnapcr扩增产物基因序列如seqidno.6所示。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

1)本发明前期曾通过传统的虫体形态学鉴定，筛选棘沟赖利绦虫用于本发明中pcr引物和方法的建立。传统的虫体形态学鉴定需对绦虫不同部位的节片进行染色、鉴定，存在样本需求量大、工作量大、耗时长、染色过程复杂和难以得到理想的染色结果等缺点(图1)。本发明建立的pcr鉴定方法所需样本量少(约30mg)，工作量小(无需区分节片部位)，用时短(小于24h)且结果判定简单。

2)本发明设计的引物能分别特异性地扩增出虫体样品中的18srdna和its-2rdna序列，用本发明中pcr方法扩增出的条带单一、清晰(图2)。18srdna(图3、图4)和its-2rdna(图5、图6)pcr测序结果能准确比对到genebank中公布的赖利属绦虫对应序列，且遗传进化关系分析显示与棘沟赖利绦虫具有高度的同源性。

附图说明

图1为棘沟赖利绦虫形态学鉴定；

图2为18srdna和its-2rdnapcr凝胶电泳；

图3为本发明扩增的18srdna序列genebank序列比对结果；

图4为本发明扩增的18srdna序列基因进化关系分析；

图5为本发明扩增的its-2rdna序列genebank序列比对结果；

图6为本发明扩增的its-2rdna基因序列遗传进化关系分析。

具体实施方式

实施例1

一种棘沟赖利绦虫鉴定的pcr方法，提供棘沟赖利绦虫种属鉴定的18srdna和its-2rdna两种基因检测引物，所述方法包括以下步骤：

步骤1，棘沟赖利绦虫的收集与形态学鉴别：收集绦虫感染鸡病例，放血法处死病鸡，取出完整消化道，小心剪开肠道，将发现的绦虫与肠道一起置于清水中，待绦虫头节脱离肠黏膜并充分舒展后转入生理盐水中清洗，清洗干净后将每条虫体进行单独保存，一部分虫体冻存于-80℃冰箱，准备提取虫体dna，一部分虫体固定于体积分数为2.5％的戊二醛水溶液(配方为：10ml体积分数为25％戊二醛水溶液加入50ml0.2m磷酸缓冲液和40ml蒸馏水，调ph＝7.4，加入蒸馏水补至100ml，其中0.2m磷酸缓冲液配方为：向磷酸二氢钠2.6g和磷酸氢二钠29g中加入蒸馏水补至500ml，调ph＝7.4)中，做扫描电镜观察，一部分虫体置于质量/体积分数为4％g/ml多聚甲醛水溶液(配方为：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入0.1mol/l磷酸缓冲液500ml，加热至60℃，持续搅拌使粉末完全溶解，滴加1mol/l的naoh使溶液清亮，最后补足0.1mol/l的磷酸缓冲液至1000ml)中固定，做苏木素-伊红染色；

扫描电镜观察：剪取1cm用体积分数为2.5％戊二醛水溶液固定4h的虫体片段，用含质量/体积分数1％g/ml四氧化锇的0.2m的甲次砷酸钠水溶液孵育1h，梯度乙醇(体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％)脱水，co2临界点干燥和喷金后置于扫描电子显微镜下观察。

苏木素-伊红染色：剪取1cm用质量/体积分数为4％多聚甲醛水溶液固定24h的虫体片段，自来水充分清洗后置于染色缸中，用苏木素-伊红染液染色虫体片段0.5h，体积分数为1％的盐酸酒精调色30s，梯度乙醇(体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％)脱水、二甲苯透明后用中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

步骤2，dna提取：绦虫虫体30mg，用组织dna提取试剂盒(购自天根生物科技公司)提取绦虫虫体dna；

步骤3，pcr扩增：

(1)引物设计：

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18srdna基因上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示：18s-f:5′-ctgagaaacggctaccact-3′

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18srdna基因下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示：18s-r:5′-acgccagacgaactacac-3′；

用于鉴定棘沟赖利绦虫的its-2rdna基因上游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示：its-2-f:5′-tattgcggccataggttt-3′

用于鉴定棘沟赖利绦虫的its-2rdna基因上游引物的核苷酸序列如seqidno.4所示：its-2-r:5′-cgtgagtacccgctgaac-3′；

(2)pcr反应：

准备200μl的第一pcr反应管和200μl的第二pcr反应管，第一pcr反应管中加入25μl2×mastermix(中科瑞泰公司)，1μl步骤2提取的绦虫虫体dna为模板，18srdna上、下游引物各1μl，浓度为0.5μm，去离子水为22μl，进行pcr反应，反应体系为50μl；第二pcr反应管中加入25μl2×mastermix(中科瑞泰公司)，1μl步骤2提取的绦虫虫体dna为模板，its-2rdna上、下游引物各1μl，去离子水为22μl，进行pcr反应；第一pcr反应管和第二pcr反应管进行pcr反应的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸30秒，扩增40个循环。制备琼脂糖凝胶溶液用tae电泳缓冲液，凝胶凝固前加入gelred荧光染料(biotium公司)为琼脂糖凝胶溶液的1/5000，以示踪凝胶电泳中的pcr扩增产物；凝胶凝固后向点样孔中加入5μlpcr扩增产物溶液，在120v电压条件下电泳30min，在凝胶成像仪下观察pcr扩增产物分子大小及电泳条带清晰度，拍照；18srdnapcr产物长度为1623bp；its-2rdnapcr产物长度为564bp。

步骤4，pcr扩增产物测序：用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(购自天根生物科技公司)将第一pcr反应管和第二pcr反应管pcr扩增产物的电泳条带进行回收，分别将回收得到的18srdna与its-2rdnapcr扩增产物与pmd19-t载体连接，连接pmd19-t载体后转化入dh5α感受态细胞，用含50μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂平板培养基对pmd19-t载体转化的dh5α感受态细胞进行阳性筛选，阳性菌落扩大培养后对菌落进行pcr测序，获得18srdnapcr扩增产物基因序列(如seqidno.5所示)和its-2rdnapcr扩增产物基因序列(如seqidno.6所示)；

步骤5，序列分析：分别将18srdna和its-2rdnapcr扩增产物基因序列与genbank数据库中公布的赖利属绦虫18srdna、its-2rdna序列进行比对，用mega软件分别将18srdna和its-2rdnapcr扩增产物基因序列与已公布的序列进行遗传进化关系分析。

实施例2

一种棘沟赖利绦虫鉴定的pcr方法，提供棘沟赖利绦虫种属鉴定的18srdna和its-2rdna两种基因检测引物，所述方法包括以下步骤：

步骤1，棘沟赖利绦虫的收集与形态学鉴别：收集绦虫感染鸡病例，放血法处死病鸡，取出完整消化道，小心剪开肠道，将发现的绦虫与肠道一起置于清水中，待绦虫头节脱离肠黏膜并充分舒展后转入生理盐水中清洗，清洗干净后将每条虫体进行单独保存，一部分虫体冻存于-80℃冰箱，准备提取虫体dna，一部分虫体固定于体积分数为2.5％的戊二醛水溶液(配方为：10ml体积分数为25％戊二醛水溶液加入50ml0.2m磷酸缓冲液和40ml蒸馏水，调ph＝7.4，加入蒸馏水补至100ml，其中0.2m磷酸缓冲液配方为：向磷酸二氢钠2.6g和磷酸氢二钠29g中加入蒸馏水补至500ml，调ph＝7.4)中，做扫描电镜观察，一部分虫体置于质量/体积分数为4％g/ml多聚甲醛水溶液(配方为：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入0.1mol/l磷酸缓冲液800ml，加热至55℃，持续搅拌使粉末完全溶解，滴加1mol/l的naoh使溶液清亮，最后补足0.1mol/l的磷酸缓冲液至1000ml)中固定，做苏木素-伊红染色；

扫描电镜观察：剪取2cm用体积分数为2.5％戊二醛水溶液固定4h的虫体片段，用含质量/体积分数1％g/ml四氧化锇的0.2m的甲次砷酸钠水溶液孵育1h，梯度乙醇(体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％)脱水，co2临界点干燥和喷金后置于扫描电子显微镜下观察。

苏木素-伊红染色：剪取2cm用质量/体积分数为4％多聚甲醛水溶液固定24h的虫体片段，自来水充分清洗后置于染色缸中，用苏木素-伊红染液染色虫体片段1h，体积分数为1％的盐酸酒精调色30s，梯度乙醇(体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％)脱水、二甲苯透明后用中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

步骤2，dna提取：绦虫虫体30mg，用组织dna提取试剂盒(购自天根生物科技公司)提取绦虫虫体dna；

步骤3，pcr扩增：

(1)引物设计：

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18srdna基因上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示：18s-f:5′-ctgagaaacggctaccact-3′

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18srdna基因下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示：18s-r:5′-acgccagacgaactacac-3′；

用于鉴定棘沟赖利绦虫的its-2rdna基因上游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示：its-2-f:5′-tattgcggccataggttt-3′

用于鉴定棘沟赖利绦虫的its-2rdna基因上游引物的核苷酸序列如seqidno.4所示：its-2-r:5′-cgtgagtacccgctgaac-3′；

(2)pcr反应：

准备200μl的第一pcr反应管和200μl的第二pcr反应管，第一pcr反应管中加入25μl2×mastermix(中科瑞泰公司)，1μl步骤2提取的绦虫虫体dna为模板，18srdna上、下游引物各1μl，浓度为0.5μm，去离子水为22μl，进行pcr反应，反应体系为50μl；第二pcr反应管中加入25μl2×mastermix(中科瑞泰公司)，1μl步骤2提取的绦虫虫体dna为模板，its-2rdna上、下游引物各1μl，去离子水为22μl，进行pcr反应；第一pcr反应管和第二pcr反应管进行pcr反应的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸30秒，扩增40个循环。制备琼脂糖凝胶溶液用tae电泳缓冲液，凝胶凝固前加入gelred荧光染料(biotium公司)为琼脂糖凝胶溶液的1/10000，以示踪凝胶电泳中的pcr扩增产物；凝胶凝固后向点样孔中加入8μlpcr扩增产物溶液，在150v电压条件下电泳40min，在凝胶成像仪下观察pcr扩增产物分子大小及电泳条带清晰度，拍照；18srdnapcr产物长度为1623bp；its-2rdnapcr产物长度为564bp。

步骤4，pcr扩增产物测序：用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(购自天根生物科技公司)将第一pcr反应管和第二pcr反应管pcr扩增产物的电泳条带进行回收，分别将回收得到的18srdna与its-2rdnapcr扩增产物与pmd19-t载体连接，连接pmd19-t载体后转化入dh5α感受态细胞，用含50μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂平板培养基对pmd19-t载体转化的dh5α感受态细胞进行阳性筛选，阳性菌落扩大培养后对菌落进行pcr测序，获得18srdnapcr扩增产物基因序列(如seqidno.5所示)和its-2rdnapcr扩增产物基因序列(如seqidno.6所示)；

步骤5，序列分析：分别将18srdna和its-2rdnapcr扩增产物基因序列与genbank数据库中公布的赖利属绦虫18srdna、its-2rdna序列进行比对，用mega软件分别将18srdna和its-2rdnapcr扩增产物基因序列与已公布的序列进行遗传进化关系分析。

实施例3

一种棘沟赖利绦虫鉴定的pcr方法，提供棘沟赖利绦虫种属鉴定的18srdna和its-2rdna两种基因检测引物，所述方法包括以下步骤：

步骤1，棘沟赖利绦虫的收集与形态学鉴别：收集绦虫感染鸡病例，放血法处死病鸡，取出完整消化道，小心剪开肠道，将发现的绦虫与肠道一起置于清水中，待绦虫头节脱离肠黏膜并充分舒展后转入生理盐水中清洗，清洗干净后将每条虫体进行单独保存，一部分虫体冻存于-80℃冰箱，准备提取虫体dna，一部分虫体固定于体积分数为2.5％的戊二醛水溶液(配方为：10ml体积分数为25％戊二醛水溶液加入50ml0.2m磷酸缓冲液和40ml蒸馏水，调ph＝7.4，加入蒸馏水补至100ml，其中0.2m磷酸缓冲液配方为：向磷酸二氢钠2.6g和磷酸氢二钠29g中加入蒸馏水补至500ml，调ph＝7.4)中，做扫描电镜观察，一部分虫体置于质量/体积分数为4％g/ml多聚甲醛水溶液(配方为：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入0.1mol/l磷酸缓冲液600ml，加热至58℃，持续搅拌使粉末完全溶解，滴加1mol/l的naoh使溶液清亮，最后补足0.1mol/l的磷酸缓冲液至1000ml)中固定，做苏木素-伊红染色；

扫描电镜观察：剪取2cm用体积分数为2.5％戊二醛水溶液固定4h的虫体片段，用含质量/体积分数1％g/ml四氧化锇的0.2m的甲次砷酸钠水溶液孵育1h，梯度乙醇(体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％)脱水，co2临界点干燥和喷金后置于扫描电子显微镜下观察。

苏木素-伊红染色：剪取2cm用质量/体积分数为4％多聚甲醛水溶液固定24h的虫体片段，自来水充分清洗后置于染色缸中，用苏木素-伊红染液染色虫体片段1h，体积分数为1％的盐酸酒精调色30s，梯度乙醇(体积分数70％、体积分数80％、体积分数95％和体积分数100％)脱水、二甲苯透明后用中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

步骤2，dna提取：绦虫虫体30mg，用组织dna提取试剂盒(购自天根生物科技公司)提取绦虫虫体dna；

步骤3，pcr扩增：

(1)引物设计：

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18srdna基因上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示：18s-f:5′-ctgagaaacggctaccact-3′

用于鉴定棘沟赖利绦虫的18srdna基因下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示：18s-r:5′-acgccagacgaactacac-3′；

用于鉴定棘沟赖利绦虫的its-2rdna基因上游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示：its-2-f:5′-tattgcggccataggttt-3′

用于鉴定棘沟赖利绦虫的its-2rdna基因上游引物的核苷酸序列如seqidno.4所示：its-2-r:5′-cgtgagtacccgctgaac-3′；

(2)pcr反应：

准备200μl的第一pcr反应管和200μl的第二pcr反应管，第一pcr反应管中加入25μl2×mastermix(中科瑞泰公司)，1μl步骤2提取的绦虫虫体dna为模板，18srdna上、下游引物各1μl，浓度为0.5μm，去离子水为22μl，进行pcr反应，反应体系为50μl；第二pcr反应管中加入25μl2×mastermix(中科瑞泰公司)，1μl步骤2提取的绦虫虫体dna为模板，its-2rdna上、下游引物各1μl，去离子水为22μl，进行pcr反应；第一pcr反应管和第二pcr反应管进行pcr反应的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸30秒，扩增40个循环。制备琼脂糖凝胶溶液用tae电泳缓冲液，凝胶凝固前加入gelred荧光染料(biotium公司)为琼脂糖凝胶溶液的1/8000，以示踪凝胶电泳中的pcr扩增产物；凝胶凝固后向点样孔中加入6μlpcr扩增产物溶液，在140v电压条件下电泳35min，在凝胶成像仪下观察pcr扩增产物分子大小及电泳条带清晰度，拍照；18srdnapcr产物长度为1623bp；its-2rdnapcr产物长度为564bp。

步骤4，pcr扩增产物测序：用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(购自天根生物科技公司)将第一pcr反应管和第二pcr反应管pcr扩增产物的电泳条带进行回收，分别将回收得到的18srdna与its-2rdnapcr扩增产物与pmd19-t载体连接，连接pmd19-t载体后转化入dh5α感受态细胞，用含50μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂平板培养基对pmd19-t载体转化的dh5α感受态细胞进行阳性筛选，阳性菌落扩大培养后对菌落进行pcr测序，获得18srdnapcr扩增产物基因序列(如seqidno.5所示)和its-2rdnapcr扩增产物基因序列(如seqidno.6所示)；

步骤5，序列分析：分别将18srdna和its-2rdnapcr扩增产物基因序列与genbank数据库中公布的赖利属绦虫18srdna、its-2rdna序列进行比对，用mega软件分别将18srdna和its-2rdnapcr扩增产物基因序列与已公布的序列进行遗传进化关系分析。

图1中a1/a2：绦虫头节；b1/b2：绦虫成熟节片；c1/c2：绦虫孕卵节片；d：绦虫整体。sc：头节；su：吸盘；r：顶突；h：小钩；gp：生殖孔；cp：雄茎囊；t：睾丸；sp：受精囊；ec：卵囊；on：六钩蚴。

图2中用本发明中pcr方法扩增出的条带单一、清晰，18srdnapcr产物长度为1623bp；its-2rdnapcr产物长度为564bp。

图3中本发明扩增的18srdna序列准确比对到已公布的赖利属绦虫18srdna序列。

图4中本发明扩增的18srdna与已公布的棘沟赖利绦虫18srdna序列具有最近的遗传进化关系。raillietinaechinobothridashanxi为本发明扩增的18srdna序列。

图5中本发明扩增的its-2rdna序列准确比对到已公布的赖利属绦虫its-2rdna序列。

图6中本发明扩增的its-2rdna与已公布的棘沟赖利绦虫its-2rdna序列具有最近的遗传进化关系。raillietinaechinobothridashanxi为本发明扩增的its-2rdna序列。

序列表

seqidno.1：

ctgagaaacggctaccact

seqidno.2：

acgccagacgaactacac

seqidno.3：

tattgcggccataggttt

seqidno.4：

cgtgagtacccgctgaac

seqidno.5：

ctgagaaacggctaccacttccaagggaggcagcaggcgcgcaaattacccactcccagcacggggaggtggtgacgaaaaataccgatgcgggactcctatgaggctccgtaatcggaatgagtggactctaaatcctttcacgaggatcaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaactccagctccaatagcgtatattaaagttgctgcagttaaaaagctcgtagttggatctcggtcgcatttttgcctgttggtattattgggcggcggtgctaggctgccggcgtgtcgtgcttgtgtaccggtacccggaagggtccgcgcatgggtgcgtgcgtgggcagtctgttgaatgcgcagtcgtcccaagctggcatggcgaggatgtaacctgtaagccatgtctgtggagtaacatccacaggtgtatgcgggtgtcgggcagtgcactgcacttgttgtggagcctgtcggcccgtgtgcatgccctcttggtgcccttaaaaaggtgtcggggggcggatggcacgtttactttgaacaaatttgagtgctcaaatcaggccgatgttgcctgaatacttttgcatggaataatggaataggacttcggttctatttcgttggttttcggatccgaagtaatgatcaaaagagacaggcggggacgtttgtatggctgcgctagaggtgaaattcgtggaccgtagccagacaaactaaagcgaaagcattcgtcaagcatgttttcattgaccatgagcgaaagtcagaggctcgaagacgatcagataccgtcctagttctgaccataaacgatgccaactgacgatccgtggtggtagttataaccttccccacgggcagtccccgggaaacctttaagtctttgggttccgggggaagtatggttgcaaagctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacgggaaaactcacccgggccggacactwtgaggattgacagattgatagctctttcttgatttggtggttggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtctggttaattccgataacgaacgagactccagcctgctaattagtgcgtttgtccactgcccctgctggacggcgttgaatgcggctgctagtgggtttcggcctgctctgcggctagtcagacggcgttagtcctcgggggcggcgcgaatgctcacttcttagagggacaagcgggagaagccgcacgaaatagagcaataacaggtctgtgatgcccttagatgtccggggccgcacgcgcgctacaatggcggtgtcaacgagtgagaccttctggcccgaaagggttggataaactggtcaatcaccgtcatgacagggatcggggcttggaattgttccccgtgaacgaggaattcctagtaagtgcaagtcataagcttgcgctgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctactaccgattgaatggtttagtaaggtccttggatcgacgcctttgtagctgccaccgaaaggtgtgtagttcgtctggcgt

seqidno.6：

tattgcggccataggtttacctgtggccacgtctgtccgagcgtcggcttataaactatcactgcgccttaaaagcagtggcttgggagactgccgtgttatcgtaaccttgtatgtgtgtgtgtgtgtgtatatgcgtacgtgcaaataggtctgcgatatggcatggcttctctttaaggaatggtcacctatggtggcgttgagcttgtggttgtgctacgaccgctgactgcggctcgagtcgtcgtacgtgagtatgtgtgtgtgtgtgcgagcgagcgctgttctgggggtgaaggcgctcgtgcgtgtgtactctccttgtctcgacttgggccgtgtctgcagttgaacaaccgtggcctagggtaacttctgctgccagagacacgaattgttcgctgtggctgtaaacgttacgtggttgtggtgctcaactcaagacgtgcaaatatgtggtgagtgtttacgtgtgtgtgcataatgtggtaaacctcatcatcatggtcgcttttgcgcattgcttcctgacctcggatcagtcgtgagtacccgctgaac

序列表

<110>山西农业大学

<120>一种棘沟赖利绦虫鉴定的pcr方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>棘沟赖利绦虫(raillietinaechinobothrida)

<400>1

ctgagaaacggctaccact19

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>棘沟赖利绦虫(raillietinaechinobothrida)

<400>2

acgccagacgaactacac18

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>棘沟赖利绦虫(raillietinaechinobothrida)

<400>3

tattgcggccataggttt18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>棘沟赖利绦虫(raillietinaechinobothrida)

<400>4

cgtgagtacccgctgaac18

<210>5

<211>1623

<212>dna

<213>棘沟赖利绦虫(raillietinaechinobothrida)

<400>5

ctgagaaacggctaccacttccaagggaggcagcaggcgcgcaaattacccactcccagc60

acggggaggtggtgacgaaaaataccgatgcgggactcctatgaggctccgtaatcggaa120

tgagtggactctaaatcctttcacgaggatcaattggagggcaagtctggtgccagcagc180

cgcggtaactccagctccaatagcgtatattaaagttgctgcagttaaaaagctcgtagt240

tggatctcggtcgcatttttgcctgttggtattattgggcggcggtgctaggctgccggc300

gtgtcgtgcttgtgtaccggtacccggaagggtccgcgcatgggtgcgtgcgtgggcagt360

ctgttgaatgcgcagtcgtcccaagctggcatggcgaggatgtaacctgtaagccatgtc420

tgtggagtaacatccacaggtgtatgcgggtgtcgggcagtgcactgcacttgttgtgga480

gcctgtcggcccgtgtgcatgccctcttggtgcccttaaaaaggtgtcggggggcggatg540

gcacgtttactttgaacaaatttgagtgctcaaatcaggccgatgttgcctgaatacttt600

tgcatggaataatggaataggacttcggttctatttcgttggttttcggatccgaagtaa660

tgatcaaaagagacaggcggggacgtttgtatggctgcgctagaggtgaaattcgtggac720

cgtagccagacaaactaaagcgaaagcattcgtcaagcatgttttcattgaccatgagcg780

aaagtcagaggctcgaagacgatcagataccgtcctagttctgaccataaacgatgccaa840

ctgacgatccgtggtggtagttataaccttccccacgggcagtccccgggaaacctttaa900

gtctttgggttccgggggaagtatggttgcaaagctgaaacttaaaggaattgacggaag960

ggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacgggaaaactcacccgg1020

gccggacactwtgaggattgacagattgatagctctttcttgatttggtggttggtggtg1080

catggccgttcttagttggtggagcgatttgtctggttaattccgataacgaacgagact1140

ccagcctgctaattagtgcgtttgtccactgcccctgctggacggcgttgaatgcggctg1200

ctagtgggtttcggcctgctctgcggctagtcagacggcgttagtcctcgggggcggcgc1260

gaatgctcacttcttagagggacaagcgggagaagccgcacgaaatagagcaataacagg1320

tctgtgatgcccttagatgtccggggccgcacgcgcgctacaatggcggtgtcaacgagt1380

gagaccttctggcccgaaagggttggataaactggtcaatcaccgtcatgacagggatcg1440

gggcttggaattgttccccgtgaacgaggaattcctagtaagtgcaagtcataagcttgc1500

gctgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctactaccgattgaatggttt1560

agtaaggtccttggatcgacgcctttgtagctgccaccgaaaggtgtgtagttcgtctgg1620

cgt1623

<210>6

<211>564

<212>dna

<213>棘沟赖利绦虫(raillietinaechinobothrida)

<400>6

tattgcggccataggtttacctgtggccacgtctgtccgagcgtcggcttataaactatc60

actgcgccttaaaagcagtggcttgggagactgccgtgttatcgtaaccttgtatgtgtg120

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cgtggcctagggtaacttctgctgccagagacacgaattgttcgctgtggctgtaaacgt420

tacgtggttgtggtgctcaactcaagacgtgcaaatatgtggtgagtgtttacgtgtgtg480

tgcataatgtggtaaacctcatcatcatggtcgcttttgcgcattgcttcctgacctcgg540

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