一种降解铜离子转运蛋白Atox1和CCS的小分子抑制剂及其应用的制作方法

本发明涉及分子靶向药物领域，具体涉及靶向降解铜离子转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂及其应用，特别涉及靶向降解铜离子转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂及其在抑制三阴性乳腺癌细胞增殖与肿瘤发生过程中的应用。

背景技术：

乳腺癌是一种常见的发病率、死亡率极高且预后差的恶性肿瘤。三阴性乳腺癌是雌激素受体(enstrogenreceptor,er)、孕激素受体(progesteronereceptor,pr)和人表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2,her2)均表达为阴性的乳腺癌，约占全部乳腺癌的10-20％。三阴性乳腺癌相较于er阳性乳腺癌和her2阳性乳腺癌，具有高转移性和高异质性的特征，尚缺乏有效的治疗手段。寻找三阴性乳腺癌中的关键靶点并设计针对关键靶点的分子靶向药物为临床上治疗三阴性乳腺癌提供新思路。

人体内铜作为酶的辅因子在抗氧化、铁稳态和细胞呼吸等一系列生物化学反应中扮演重要作用。因而，细胞内游离铜离子的浓度对于细胞稳态维持至关重要。研究表明，在多种肿瘤细胞(如肺癌细胞、三阴性乳腺癌细胞和人脑髓母细胞瘤细胞)中游离铜离子的浓度明显升高并促进细胞增殖与转移，其中具体的分子机制尚不清楚。细胞内铜离子转运蛋白atox1和ccs可以将细胞质中的铜运输到特定的靶蛋白上。在癌细胞内特异性地抑制高表达的atox1和ccs的活性或者直接降解atox1和ccs可以有效地抑制铜的传递，从而抑制细胞增殖与肿瘤发生与转移。

2001年，加州理工大学的raymondj.deshaies教授和耶鲁大学的craigm.crews教授首次提出了蛋白水解靶向嵌合体(protac)的概念。protac分子是由靶向臂，降解臂和连接子三个部分组成的异双功能嵌合体。靶向臂一般为识别细胞内的靶标蛋白质的小分子或多肽。protac分子与靶标蛋白结合的同时，其降解臂会将靶标蛋白牵引到e3连接酶上，并通过蛋白酶体途径将靶标蛋白质降解。蛋白水解靶向嵌合体技术具有优于常规靶向疗法的优势。这项技术可以选择性降解细胞内蛋白，而不是仅抑制靶标蛋白的活性。目前，蛋白水解靶向嵌合体已被广泛用于降解多种靶向蛋白质，包括核受体，蛋白质激酶和酶。这些蛋白质的异常表达是导致肿瘤发生的重要因素之一。

技术实现要素：

本发明提供一种降解铜离子转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂及其应用，利用protac技术设计一种特异性靶向降解三阴性乳腺癌细胞内铜转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂，命名为da-protac，分子式为c46h50brf2n7o8s2，da-protac能够抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖与侵袭。

本发明采取的技术方案是：一种特异性靶向降解三阴性乳腺癌细胞内铜转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂，分子式为c46h50brf2n7o8s2，命名为da-protac，结构式如下：

本发明所述一种特异性靶向降解三阴性乳腺癌细胞内铜转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂靶向模块是：将与atox1和ccs结合的小分子dc_ac50作为da-protac的靶向模块：结构式如下：

本发明所述一种特异性靶向降解三阴性乳腺癌细胞内铜转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂降解模块是：将与e3连接酶结合的小分子vhlligand1作为da-protac的靶向模块，结构式如下：

本发明所述一种特异性靶向降解三阴性乳腺癌细胞内铜转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂连接体是：将c7h12o6作为连接靶向模块与降解模块的连接体，结构式如下：

本发明所述一种特异性靶向降解三阴性乳腺癌细胞内铜转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂的合成方法，步骤如下：

第一步：合成中间产物

在二氯甲烷中加入降解模块，在0℃条件下加入连接体，酸胺缩合试剂hatu和二异丙基乙胺，将反应混合物在20℃条件下搅拌12小时，反应结束后，用石油醚和乙酸乙酯1:3混合试剂对反应混合物进行纯化，得到所需要的中间产物；

第二步：合成da-protac

在二氯甲烷中加入中间产物，在0℃条件下加入靶向模块，酸胺缩合试剂hatu和二异丙基乙胺，反应混合物在20℃条件下搅拌12小时，反应结束后，用乙腈和水1:4混合试剂对反应混合物进行纯化，得到终产物da-protac。

合成的具体步骤如下：

一种降解铜离子转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂在制备抑制三阴性乳腺癌的药物中的应用。

一种降解铜离子转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂在制备降解atox1和ccs蛋白中的应用。

本发明的积极效果：

选择dc_ac50作为靶向模块的原因是dc_ac50可以与atox1和ccs蛋白发生相互作用。选择vhlligand1作为降解模块的原因是dc_ac50可以与e3连接酶发生相互作用。基于以上结论，da-protac既能与atox1和ccs蛋白结合，同时可以将复合体与e3连接酶结合，使得atox1和ccs的泛素化水平升高，并通过蛋白酶体途径实现atox1和ccs蛋白的降解。

da-protac可以降解atox1和ccs蛋白而非抑制atox1和ccs活性。

da-protac可以通过其靶向模块(dc_ac50)与肿瘤细胞内的atox1和ccs蛋白结合，同时通过降解模块(vhlligand1)与细胞内的e3连接酶结合，并通过蛋白酶体途径降解atox1和ccs蛋白，在200nm的da-protac处理下，atox1和ccs蛋白水平明显降低，da-protac可降解atox1和ccs蛋白，而dc_ac50不能降解atox1和ccs蛋白。

da-protac对于三阴性乳腺癌细胞(mda-mb-231)增殖和迁移抑制能力优于dc_ac50，在mda-mb-231细胞中，da-protac可以靶向降解atox1和ccs蛋白而非仅仅抑制atox1和ccs活性(如dc_ac50)。如图1和图2所示，da-protac对mda-mb-231细胞增殖和迁移的抑制作用优于dc_ac50。

da-protac抑制三阴性乳腺癌细胞(mda-mb-231)成瘤能力。

由图3可知，于裸鼠腋下进行皮下注射5×10⁶个da-protac处理48小时的mda-mb-231细胞，经过4周时间解剖肿瘤并拍照。结果显示，相较于dmso处理的mda-mb-231细胞，da-protac处理的mda-mb-231细胞形成肿瘤的体积明显减小，这说明da-protac在体内可明显抑制三阴性乳腺癌细胞的成瘤能力，这为临床上治疗三阴性乳腺癌提供新思路。

附图说明

图1是da-protac降解atox1和ccs图；

图2是da-protac抑制三阴性乳腺癌细胞增殖能力图；

图3是da-protac抑制三阴性乳腺癌细胞增殖能力图；

图4是da-protac抑制三阴性乳腺癌细胞迁移能力图；

图5是da-protac抑制三阴性乳腺癌细胞迁移能力图；

图6是da-protac抑制三阴性乳腺癌细胞成瘤能力图。

具体实施方式

一种特异性靶向降解三阴性乳腺癌细胞内铜转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂，分子式为c46h50brf2n7o8s2，命名为da-protac，结构式如下：

本发明所述一种特异性靶向降解三阴性乳腺癌细胞内铜转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂靶向模块是：将与atox1和ccs结合的小分子dc_ac50作为da-protac的靶向模块：结构式如下：

本发明所述一种特异性靶向降解三阴性乳腺癌细胞内铜转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂降解模块是：将与e3连接酶结合的小分子vhlligand1作为da-protac的靶向模块，结构式如下：

本发明所述一种特异性靶向降解三阴性乳腺癌细胞内铜转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂连接体是：将c7h12o6作为连接靶向模块与降解模块的连接体，结构式如下：

本发明所述一种特异性靶向降解三阴性乳腺癌细胞内铜转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂的合成方法，步骤如下：

第一步：合成中间产物

在二氯甲烷中加入降解模块，在0℃条件下加入连接体，酸胺缩合试剂hatu和二异丙基乙胺，将反应混合物在20℃条件下搅拌12小时，反应结束后，用石油醚和乙酸乙酯1:3混合试剂对反应混合物进行纯化，得到所需要的中间产物；

第二步：合成da-protac

在二氯甲烷中加入中间产物，在0℃条件下加入靶向模块，酸胺缩合试剂hatu和二异丙基乙胺，反应混合物在20℃条件下搅拌12小时，反应结束后，用乙腈和水1:4混合试剂对反应混合物进行纯化，得到终产物da-protac。

合成的具体步骤如下：

一种降解铜离子转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂在制备抑制三阴性乳腺癌的药物中的应用。

一种降解铜离子转运蛋白atox1和ccs的小分子抑制剂在制备降解atox1和ccs蛋白中的应用。

下边通过具体实验例来进一步说明本发明的效果。

实验例1、da-protac在降解atox1和ccs蛋白中的应用

将8×10⁵的mda-mb-231细胞接种于6cm培养皿，用含10％fbs的dmem培养基培养，得到mda-mb-231细胞培养体系。分别向mda-mb-231细胞培养体系中分别加入等体积的dmso,dc_ac50及不同浓度(100nm,200nm,500nm,1000nm)的da-protac，处理24小时后利用westernblotting实验检测细胞内atox1和ccs水平。

结果表明(图1)：在200nm的da-protac处理下，atox1和ccs蛋白水平明显降低。说明da-protac可降解atox1和ccs蛋白。

实验例2、da-protac在抑制三阴性乳腺癌细胞(mda-mb-231)增殖、迁移和成瘤中应用。

一、da-protac在调控肿瘤细胞增殖和迁移能力中的应用

1、da-protac对肿瘤细胞增殖能力的影响

(1)将mda-mb-231细胞接种到6孔板中，每孔接种500个细胞，使用含有10％(体积分数)fbs的dmem培养基培养，得到mda-mb-231细胞培养体系。

(2)分别按照如下各处理组进行细胞处理：

处理组1(dmso)：在mda-mb-231细胞培养体系中加入等体积的dmso。

处理组2(dc_ac50)：在mda-mb-231细胞培养体系中加入等体积的dc_ac50(溶剂为dmso)，使dc_ac50在细胞培养体系中的浓度为5μm。

处理组3(da-protac)：在mda-mb-231细胞培养体系中加入等体积的da-protac溶液(溶剂为dmso)，使da-protac在细胞培养体系中的浓度为5μm。

(3)处理后培养10天，pbs洗涤细胞，并用0.1％结晶紫染色(图2)。用软件imagej对菌落数进行计数，利用prism软件分别统计各处理组的菌落面积(克隆形成的面积)，每个处理组三次平行重复试验(图3)。

如图2和图3所示。结果表明在加入da-protac后，克隆形成的面积明显减小。说明da-protac可抑制三阴性乳腺癌细胞增殖能力。

2、da-protac对肿瘤细胞迁移能力的影响

(1)将mda-mb-231细胞接种在6孔板中，使用dmem培养基(含有10％fbs)培养至密度为95％。然后用枪头沿划直线，pbs洗细胞3次，洗去悬浮的细胞。

(2)在步骤(1)得到的6孔板中加入不含有fbs的dmem培养基，得到mda-mb-231细胞培养体系。

处理组4(dmso)：在mda-mb-231细胞培养体系中加入等体积的dmso。

处理组5(dc_ac50)：在mda-mb-231细胞培养体系中加入等体积的dc_ac50(溶剂为dmso)，使dc_ac50在细胞培养体系中的浓度为5μm。

处理组6(da-protac)：在mda-mb-231细胞培养体系中加入等体积的da-protac溶液(溶剂为dmso)，使da-protac在细胞培养体系中的浓度为5μm。

(3)处理24小时后，用显微镜观察迁移距离并拍照(图4)。imagej软件测量迁移距离，利用prism软件分别统计各处理组的迁移距离。每个处理组三次平行重复试验(图5)。

结果如图4和图5所示。结果表明在加入da-protac后，细胞迁移距离明显减小，说明da-protac可抑制三阴性乳腺癌细胞迁移能力。

二、da-protac在调控癌细胞成瘤能力中的应用

采用裸鼠成瘤实验检测da-protac对癌细胞成瘤能力的影响。具体步骤如下：

(1)分别按照如下处理组对mda-mb-231细胞进行处理：

处理组7(ctrl)：在mda-mb-231细胞培养体系中加入等体积的dmso，处理48小时。

处理组8(da-protac)：在mda-mb-231细胞培养体系中加入等体积的da-protac，使da-protac在细胞培养体系中的浓度为10μm，处理48小时。

(2)将5×10⁶个mda-mb-231细胞于裸鼠腋下进行皮下注射(balb/cnude，四周龄，雌鼠，是北京维通利华实验动物技术有限公司的产品)。每个处理组5只小鼠，处理时间为4周，取各处理组小鼠皮下肿瘤并拍照。

结果如图6所示。结果表明在da-protac处理mda-mb-231细胞后，裸鼠成瘤体积减小。说明da-protac可抑制三阴性乳腺癌细胞成瘤能力。