一种干酪乳杆菌及其在防治肾炎中的应用的制作方法

本申请涉及生物技术领域，特别涉及一种干酪乳杆菌及其在防治肾炎中的应用。

背景技术：

肾炎是一种免疫性疾病是肾免疫介导的炎性反应，是不同的抗原微生物感染人体后，产生不同的抗体，结合成不同的免疫复合物，中国科学院肾病检测研究所认为沉积在肾脏的不同部位造成的病理损伤，形成不同的肾炎类型。肾炎是肾脏疾病中最常见的一种，其症状表现为乏力、腰部疼痛、肉眼血尿、水肿、高血压、肾功能异常及尿量减少等等。同时，在肾脏手术、肾移植和体外震波碎石等过程中，均可发生不同程度的再灌注损伤，它是急性肾衰最常见的原因。肾脏由于其血流高灌注的特性，缺血再灌注损伤发生率较高。

乳酸菌(lacticacidbacteria，lab)是一群革兰氏阳性、能发酵糖类产乳酸的细菌总称，其在自然界中广泛存在。其中的乳杆菌与人类生活关系密切，广泛应用于食品发酵，工业乳酸发酵及医疗保健领域中的有益微生物之一。乳杆菌是最重要的益生菌菌属，表现出极强的益生特性，如耐胃肠道消化液和胆盐，在胃肠液中定殖生长等等。同时，益生菌的干预可以增加肠道菌群中有益菌的含量，抗炎细菌的比例，提高机体免疫力。目前尚未发现对减缓肾脏慢性炎症的进程，促进肾脏损伤的修复，对肾脏功能具有保护作用的乳酸菌。

技术实现要素：

本申请的目的之一在于提供一株干酪乳杆菌lc-10(lactobacilluscaseilc-10)。

本申请的目的之二在于提供干酪乳杆菌lc-10(lactobacilluscaseilc-10)在预防和辅助治疗肾脏炎症中的应用。

本申请的目的之三在于提供干酪乳杆菌lc-10在制备直投式发酵剂、发酵乳制品和益生菌固体饮料、片剂的功能性保健品中的应用。

本申请的目的是通过如下技术方案实现的：

本申请所述的干酪乳杆菌(lactobacilluscaseilc-10)分离自锡林郭勒大草原自然发酵的酸马奶，具体地，是通过如下方法分离筛选得到的：

1.样品中的乳杆菌分离于自然发酵的酸马奶，分别吸取2ml所述酸马奶于灭菌小试管中并封口，1ml于装有灭菌caco3粉的无菌采样瓶中(容积为2ml)，拧紧螺旋帽作为备用样品保藏在4℃冰箱内，尽快将乳酸菌进行分离；

2.将乳杆菌分离时，吸取1ml酸马奶样品接种于10ml灭菌石蕊牛乳培养基中，置于30-37℃恒温箱内增菌培养至酸化凝固，在培养基颜色变为粉红时将其取出，用灭菌接种环划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的bl琼脂培养基上；

3.放入gaspak厌氧培养罐中，置于30-37℃条件下，培养48～72h。待菌落形成后，用接种环或接种针挑取菌落，接种于tpy液体中，置于30-37℃条件下，培养24～48h；

4.待菌株生长良好后，再次划线接种于bl琼脂培养基中培养(培养温度和时间同上)，仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并同时进行过氧化氢酶试验；

5.将所述乳杆菌进一步纯化培养，并采用低温真空冷冻保存；将从酸马奶样品中分离的乳杆菌菌株，经分析鉴定后的制成供试菌液，吸取菌悬液10μl接种于5mlph值为3.5的mrs液体培养基，置于37℃培养24h；同时吸取菌悬液1.0ml与9.0mlph值为3.0的人工胃液。其中，人工胃液制备法：nacl0.2％、胃蛋白酶(pepsin，sigma)0.35％，用1mol/lhcl调整ph值为3.0后，过滤除菌备用。混合后，于37℃培养，分别在开始时间0h和3h后取样，使用bcp琼脂培养基测定活菌数并计算菌株存活率；

6.通过以上方法筛选出具有高耐酸性生长和耐胃酸的乳杆菌菌株，并进一步测定其在不同人工胃液和肠液中的存活能力以及通过体外耐胆盐试验和降低胆固醇试验，由此获得干酪乳杆菌。

本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：cgmccno.17343；分类命名为：干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2019年3月18日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；该菌株的检测结果为存活。

乳杆菌的鉴定：分离纯化的乳杆菌(lactobacilluscaseilc-10)，经生理生化学特性分析和16srdna序列分析的方法鉴定，其微生物学特性如表1所示。

表1lactobacilluscaseilc-10的生物学特性

与现有技术相比，本申请提供的干酪乳杆菌(lactobacilluscaseilc-10)以及与之相关的技术方案具有如下有益效果：

本申请中经体外耐酸性试验和胆盐耐受性试验筛选出在肠道环境中生存能力较强的潜在益生菌干酪乳杆菌(lactobacilluscaseilc-10)，并通过动物实验证实了其对急性肾缺血灌注损伤具有保护作用，减少炎症因子的分泌和纤维化程度；减缓肾脏慢性炎症的进程；促进肾小管的再生修复；减少肾缺血灌注慢性纤维化引起的肾脏细胞凋亡，对肾脏功能具有保护作用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请乳酸菌的分离、纯化及保存操作流程图；

图2为lactobacilluscaseilc-10改善肾脏缺血再灌注损伤实验设计图；

图3为小鼠肾脏观察结果；

图4为小鼠左肾的肾脏系数柱形图；

图5为小鼠右肾的肾脏系数柱形图；

图6为小鼠尿素氮的柱形图；

图7为小鼠肌酐的柱形图；

图8为pas染色检测肾脏肾小管细胞损伤结果；

图9为f4/80mrna表达定量结果；

图10为vegf-amrna表达定量结果；

图11为肾组织免疫荧光染色结果；

图12为肾脏组织细胞增殖再生分子ki67表达结果；

图13为masson及天狼新红染色结果；

图14为纤维化标记蛋白α-sma在急性模型中mrna表达量柱形图；

图15为纤维化标记物icam-1在急性模型中mrna表达量柱形图；

图16为tgf-β1在慢性模型中mrna表达量柱形图；

图17为纤维化标记物icam-1在慢性模型中mrna表达量柱形图；

图18为肾脏纤维化蛋白水平结果。

具体实施方式

本申请提供一株干酪乳杆菌lc-10(lactobacilluscaseilc-10)，所述干酪乳杆菌(lactobacilluscaseilc-10)采集分离于中国内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗自然发酵的酸马奶中，是一株具有良好的胃肠液和胆盐耐受性的益生菌菌株；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：cgmccno.17343；分类命名为：干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)；保藏时间：2019年3月18日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；该菌株的检测结果为存活。

实施例1样品中乳杆菌的分离与纯化

样品中干酪乳杆菌分离与纯化过程参见图1。

1.样品中的乳杆菌分离于自然发酵的酸马奶，分别吸取2ml所述酸马奶于灭菌小试管中并封口，1ml于装有灭菌caco3粉的无菌采样瓶中(容积为2ml)，拧紧螺旋帽作为备用样品保藏在4℃冰箱内，尽快将乳酸菌进行分离；

2.将乳杆菌分离时，吸取1ml酸马奶样品接种于10ml灭菌石蕊牛乳培养基中，置于30-37℃恒温箱内增菌培养至酸化凝固，在培养基颜色变为粉红时将其取出，用灭菌接种环划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的bl琼脂培养基上；

3.放入gaspak厌氧培养罐中，置于30-37℃条件下，培养48～72h。待菌落形成后，用接种环或接种针挑取菌落，接种于tpy液体中，置于30-37℃条件下，培养24～48h；

4.待菌株生长良好后，再次划线接种于bl琼脂培养基中培养(培养温度和时间同上)，仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并同时进行过氧化氢酶试验；

5.将所述乳杆菌进一步纯化培养，并采用低温真空冷冻保存；将从酸马奶样品中分离的乳杆菌菌株，经分析鉴定后的制成供试菌液，吸取菌悬液10μl接种于5mlph值为3.5的mrs液体培养基，置于37℃培养24h；同时吸取菌悬液1.0ml与9.0mlph值为3.0的人工胃液。其中，人工胃液制备法：nacl0.2％、胃蛋白酶(pepsin，sigma)0.35％，用1mol/lhcl调整ph值为3.0后，过滤除菌备用。混合后，于37℃培养，分别在开始时间0h和3h后取样，使用bcp琼脂培养基测定活菌数并计算菌株存活率；

6.通过以上方法筛选出具有高耐酸性生长和耐胃酸的乳杆菌菌株，并进一步测定其在不同人工胃液和肠液中的存活能力以及通过体外耐胆盐试验和降低胆固醇试验，由此获得干酪乳杆菌。

实施例2干酪乳杆菌(lactobacilluscaseilc-10)的鉴定

分离纯化的干酪乳杆菌(lactobacilluscaseilc-10)，经生理生化学特性分析和16srdna序列分析的方法鉴定，其微生物学特性如表1所示。

表1lactobacilluscaseilc-10的生物学特性

实施例3干酪乳杆菌(lactobacilluscaseilc-10)的耐酸性及其人工胃肠液中的耐受性分析。

从酸马奶样品中分离鉴定的50株乳杆菌中，经过ph值为3.5的mrs液体培养基中生长试验及在ph值为3.0的人工胃液中的存活率测定，筛选得到1株耐酸性极强的乳杆菌，即干酪乳杆菌(lactobacilluscaseilc-10)。

lactobacilluscaseilc-10菌株经过ph值为3.5的mrs液体培养基中生长试验及在ph值为3.0的人工胃液中的存活率测定，结果见表2。

表2lactobacilluscaseilc-10在ph3.5及ph3.0人工胃液中生长情况

注：表中菌数均为两次实验的平均值。

结果显示，本申请的干酪乳杆菌(lactobacilluscaseilc-10)具有较强的耐性和耐酸生长特性、能够耐受人工胃肠消化液，尤其在脱脂乳液中能够耐受ph值为2.0的人工胃液。

实施例4干酪乳杆菌(lactobacilluscaseilc-10)对胆盐的耐受性分析

将本申请的lactobacilluscaseilc-10接种于含有0.3％胆盐的培养基中，厌氧培养观察分析了胆盐对其生长的影响，结果如表3所示。

表3lactobacilluscaseilc-10对胆盐的耐受性(n＝3，x±sd)

将本申请的lactobacilluscaseilc-10接种于含不同浓度胆盐的tpy琼脂和液体培养基中，通过对其生长情况的观察，分析了能够耐受胆盐的最高浓度，结果如表4所示：lactobacilluscaseilc-10耐受的最高胆盐浓度达1.8％。

表4lactobacilluscaseilc-10对不同浓度胆盐的耐受性

注：δa620为0h和12h吸光值之差，结果为三次实验的平均值，+表示有菌落生长，-表示无菌落生长，nd为测试。

由于本申请的干酪乳杆菌(lactobacilluscaseilc-10)的这种特性，所述干酪乳杆菌作为益生菌能够抵御消化道环境的不利影响并在肠道内很好的黏附和定植。益生菌的干预可以增加肠道菌群中有益菌的含量，抗炎细菌的比例，提高机体免疫力。肠道免疫力的调节进一步影响毒素的生成，减缓肾脏慢性炎症的进程，促进肾脏损伤的修复，对肾脏功能具有保护作用。随着人们对乳酸菌代谢和遗传特性的深入了解以及对其机理的认识，已经广泛接受了乳酸菌这类保健制品。另外，口服是益生菌进入肠道的主要途径，益生菌只有在经受胃酸和小肠中高浓度胆盐影响的情况下成活率高的菌株，才可发挥作用；同时，产品中稳定的活菌数或者微生态制剂中活菌的数量是其发挥作用的关键，所以，活菌制剂的应用要求单位产品达到一定的活菌数，以符合有效治疗剂量标准。

因此，该菌株适用于功能性发酵乳制品的生产、也可作为功能性食品添加剂或保健制剂应用于调节免疫功能的各个方面。

实验例1lactobacilluscaseilc-10改善肾脏缺血再灌注损伤

选用雄性小鼠分三组，见表5。

表5lactobacilluscaseilc-10改善肾脏缺血再灌注损伤实验设计内容

造模采用双侧肾动脉夹闭缺血30min，sham组仅切开腹腔，游离两侧肾蒂，但不阻断任何动脉，实验设计见图2；将本申请的lactobacilluscaseilc-10制备成2.0×10⁹cfu/g的微生态制剂，用量为2x10⁹cfu/d/只进行喂食。

缺血再灌注损伤后5d(早期)，肾脏体积稍增大，益生菌组没有模型组增大明显。缺血再灌注损伤后28d(晚期)，肾脏体积缩小，模型组缩小较益生菌组明显，参见图3至图5；益生菌组、模型组肌酐及尿素氮均高于对照组，模型组肌酐及尿素氮明显高于益生菌组，参见图6和图7。说明益生菌lc-10可以缓解缺血灌注带来的急性肾损伤。

pas染色检测肾脏肾小管细胞损伤(包括扩张、坏死、管型等)，sham、益生菌组明显低于模型组；sham、益生菌组肾脏损伤因子kim-1明显少于模型组；sham、益生菌组ltl染色近端小管刷状缘面积与模型组比较增多，见图8。进一步表明l.caseilc-10对急性肾缺血灌注损伤的保护作用。

肾脏组织巨噬细胞标记物f4/80在益生菌组较i/r组明显减少；益生菌组血管生成因子vegf-a较模型组也明显增加，参见图9和图10。表明益生菌干预可以减缓肾脏慢性炎症的进程。益生菌组较模型组相比m2型巨噬细胞增多，m1型巨噬细胞减少，参见图11。表明益生菌通过调节m1和m2巨噬细胞的平衡改善慢性炎症的形成。

模型组早期大部分细胞增殖位于间质内，晚期间质仍可见部分细胞增殖，表明模型组的增殖细胞主要作用可能是诱导炎性或纤维化；益生菌组早期大部分细胞增殖位于肾小管上，晚期肾小管上仍可见增殖细胞，见图12。表明益生菌干预主要可能作用于促进了肾小管的再生修复。

masson及天狼新红染色显示小鼠肾脏缺血再灌注损伤28d后已出现纤维化，见图13；益生菌组纤维化程度明显低于模型组，纤维化标记物icam-1在急性和慢性模型中均显著降低，见图15和图17。进一步表明益生菌对肾缺血灌注损伤具有保护作用。

益生菌组肾脏纤维化标记蛋白α-sma水平明显低于模型组，见图14。同时β型血小板源性生长因子受体pdgfrβ和凋亡基因bax表达在慢性模型中均显著降低，见图16和图18，表明益生菌可以减少肾缺血灌注慢性纤维化引起的肾脏细胞凋亡，对肾脏功能具有保护作用。

综上所述，益生菌lc-10改善肾脏缺血再灌注损伤可能的机理是通过调节肠道免疫，减少毒素的生成、巨噬细胞浸润，抑制炎症反应及氧化应激并促进小管修复，减轻纤维化。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的申请后，将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。