hKLK1重组质粒、高表达hKLK1的慢病毒颗粒及其构建方法和应用与流程

本发明涉及病毒性心肌炎的治疗药物，尤其涉及抑制病毒性心肌炎心肌纤维化的hklk1重组质粒、高表达hklk1的慢病毒颗粒及其构建方法和应用。

背景技术：

病毒性心肌炎(viralmyocarditis，vmc)是心血管系统常见疾病之一，流行病学调查显示约15-25％的vmc患者会出现心肌纤维化，并演化为扩张性心肌病，两年死亡率高达50％。因此抑制vmc心肌纤维化，对于维持心脏结构，改善心功能，降低病死率具有重要意义。目前有多种药物，如曲尼司特、卡维地洛、卡托普利均可抑制vmc小鼠心肌纤维化，然而其临床疗效并未得到肯定。

根据发表的文献报道以及临床治疗经验，上述3种药物仅对vmc小鼠心肌纤维化的病理有所改善，对心脏功能的改善并不明显，同时临床上也极少使用上述药物治疗vmc心肌纤维化。导致上述缺点的原因为：这些药物的作用靶点并非vmc心肌纤维化的关键机制。

技术实现要素：

基于上述问题，本发明的目的在于提供一种hklk1重组质粒、高表达hklk1的慢病毒颗粒及其构建方法和应用，此重组质粒和病毒颗粒可以发挥抑制vmc心肌纤维化、改善心功能的作用，具有开发为药物的应用前景。

为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种hklk1重组质粒，为克隆hklk1基因的重组质粒，且基因序列如seqid:1所示。

本发明第二方面提供了一种构建hklk1重组质粒的方法，将所述hklk1基因连接至经典表达克隆pez-lv105而得。

较佳的，构建hklk1重组质粒的方法包括依次的如下步骤：

(1)以所述hklk1基因序列为模板，设计引物进行pcr扩增，所述引物为：

上游引物序列：5'-gcggtaggcgtgtacggt-3'

下游引物序列：5'-attgtggatgaatactgcc-3'；

(2)将步骤(1)获得的pcr扩增产物进行电泳，然后切胶回收、纯化，用限制性内切酶bstbi和xhoi酶切，使获得所述hklk1基因序列的两端带有bstbi和xhoi酶切位点；

(3)将步骤(2)获得的dna片段连接于pez-lv105载体上；

(4)利用pcr法筛选重组克隆、酶切鉴定。

其中，所述步骤(1)中的pcr扩增反应体系包括：

5×buffer，5μl；

10mmdntp，0.5μl；

20mmmg²⁺，2.5μl；

模板，1μl；

5pmol/l上游引物mfat-1-f，0.5μl；

5pmol/l下游引物mfat-1-r，0.5μl；

5u/μlultrapfdnapolymerase，0.2μl；

补去离子水至25μl。

所述步骤(1)中的pcr扩增反应程序为：98℃预变性1min，98℃变性10sec，退火至5℃保持30sec，于72℃下以1-4kb/min的速度进行延伸7min，共25个循环；最后于4℃下保存。

所述步骤(2)中pcr法筛选重组克隆的反应体系包括：

10×taqreactionbuffer(mgplus)，2.5μl；

10mmdntp，0.5μl；

5u/μltaq，0.2μl；

去离子水，4.8μl。

所述步骤(2)中的pcr扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，退火至58℃保持30sec，于72℃下以1kb/min的速度进行延伸7min，共25个循环；最后于4℃下保存。

本发明第三方面提供了一种高表达hklk1的慢病毒颗粒，为将前述的hklk1重组质粒或构建hklk1重组质粒的方法构建的重组质粒连接至慢病毒中而得。较佳的，其给药方式为一次性静脉注射，为基于hiv骨架的慢病毒包装质粒lenti-pac^tm。

本发明第四方面提供了一种高表达hklk1的慢病毒颗粒的构建方法，包括依次的如下步骤：

(1)慢病毒包装质粒lenti-pac^tm包装hklk1重组质粒；

(2)滴度测定。

较佳的，所述步骤(1)为采用endofectin^tmlenti和titerboost^tm转染试剂将hklk1重组质粒和慢病毒包装质粒lenti-pac^tm转染入293ta细胞进行共转染，更优选的，步骤(1)包括如下步骤：

①培养包装细胞

②制备dna-endofectin转染复合物

③转染包装细胞

④收获慢病毒颗粒。

本发明第五方面提供了前述的hklk1重组质粒或构建hklk1重组质粒的方法构建的hklk1重组质粒，或，高表达hklk1的慢病毒颗粒或高表达hklk1的慢病毒颗粒的构建方法所构建的高表达hklk1的慢病毒颗粒在制备治疗病毒性心肌炎心肌纤维化药物中的应用。

本发明第六方面提供了一种药物，包括前述的hklk1重组质粒或构建hklk1重组质粒的方法构建的hklk1重组质粒，或，高表达hklk1的慢病毒颗粒或高表达hklk1的慢病毒颗粒的构建方法所构建的高表达hklk1的慢病毒颗粒，以及药物载体。其中，药物载体为药物制备中可接受的载体。药物可通过将hklk1重组质粒或者hklk1重组质粒病毒颗粒按照常规工艺和药物载体、及常规辅料制成临床上可接收的剂型。

人组织激肽释放酶1(humantissuekallikrein，hklk1)是一种丝氨酸蛋白激酶,属于激肽释放酶-激肽系统(kks)的活性成分之一。本发明采用基因治疗的方法，利用本发明的病毒颗粒将hklk1基因带入到vmc小鼠体内，与对照组小鼠相比，小鼠心肌细胞间质内增生的胶原纤维明显减少，心肌胶原纤维增生明显轻，ⅰ/ⅲ胶原蛋白比值明显降低、心肌中转化生长因子β1(transforminggrowthfactor-beta1,tgf-β1)的表达显著下调，hklk1可通过下调tgf-β1的表达，发挥抑制vmc心肌纤维化、改善心功能的作用，具有开发为药物的应用前景。由于哺乳动物体内缺乏丝氨酸蛋白激酶，因此需要采用慢病毒载体或腺相关病毒载体将hklk1基因导入体内。

与现有技术相比，本发明的hklk1重组质粒(pez-lv105-hklk1)可以用于制备治疗病毒性心肌炎心肌纤维化的药物。以慢病毒为载体，利用基因重组技术构建高表达hklk1的慢病毒颗粒(ez.hklk1)，是一种安全无毒具备抑制vmc心肌纤维化的药物，能满足使用需求，构建方法简单，容易操作，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1的pcr产物电泳图。

图2为实施例1的pcr产物电泳图。

图3为实施例1的pez-lv105-hklk1质粒bsrgi和aflii酶切鉴定电泳图。

图4为实施例3的各组心脏体重比图。

图5为实施例3的各组小鼠心肌组织形态学观察显微图。

图6为实施例3的各组心肌ⅰ型和ⅲ型胶原蛋白的表达图。

图7为实施例3的各组心肌tgf-β1蛋白的表达图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。

实施例1：hklk1重组质粒(pez-lv105-hklk1)的构建，其基因序列如seqid:1所示，具体过程如下：

(1)pcr扩增

以hklk1基因序列为模板，设计引物进行pcr扩增，使获得hklk1基因序列两端带有bstbi和xhoi酶切位点，引物为：

上游引物序列：5'-gcggtaggcgtgtacggt-3'

下游引物序列：5'-attgtggatgaatactgcc-3'；

pcr反应体系如表1所示。

表1pcr反应体系

pcr扩增反应程序为：98℃预变性1min，98℃变性10sec，退火至5℃保持30sec，于72℃下以1-4kb/min的速度进行延伸7min，共25个循环；最后于4℃下保存。

将pcr产物进行电泳鉴定，其结果如图1所示，其中lane1：marker6000；lane2：hklk1(800bp)，对照marker估计dna片段的大小，选择出含目的片段的阳性克隆。并用omega的gelextractionkit胶回收纯化pcr产物。

(2)酶切

用限制性内切酶bstbi和xhoi酶切，酶切体系如表2所示。

表2酶切体系

将反应管放入37℃恒温水浴锅温育3h以上，取出酶切产物放入80℃水浴锅温育20min，使限制性内切酶失活；用omega的gelextractionkit回收酶切产物。

(3)连接

将目的dna片段和pez-lv105载体进行fast-fusiontm反应得fast-fusiontmclonase。在冰上配制克隆反应液，如表3所示。将1μlfast-fusiontmclonase加入混合均匀的反应液中，轻弹反应管壁使之分散均匀，在25℃下温育15min后于冰上保存。

表3反应液配方

(4)培养转化：

1.将感受态细胞从-80℃冰箱取出置于冰中融化。

2.从超净工作台中取出灭菌的1.5ml离心管，用marker笔在其管盖上标记相应的编号。

3.用移液枪取5μl连接产物到已标记好的1.5ml离心管的底部，置于冰中。

4.于超净台中用移液枪将融化的感受态细胞混匀，取50μl加到步骤3中的1.5ml离心管的底部，冰浴30min，此时将水浴锅设置为42℃。

5.静置于42℃水浴锅中热激45sec，迅速转移到冰盒冰浴2-4min。

6.于超净工作台中点燃酒精灯，用移液枪加入400μl的s.o.c培养基，然后放入37℃摇床，180rpm培养1h。

7.从摇床中取出转化物于超净工作台中用移液枪取200μl到相对应的已标记好的lb平板上，将转化物涂匀涂干后，将lb平板倒置放入37℃恒温培养箱，培养12-16h。

(5)pcr法筛选重组克隆

1.将lb平板倒置，常温下随机挑选平板上的单克隆并编号。

2.每个pcr管里分装16μlddh2o和正反向载体引物1μl(5pmol/μl)，用枪头在lb平板上轻点，然后将沾有菌体的枪头置于相应的pcr管中吹打数下。

3.将pcr其他组分配成pcrmix分装于每个pcr管里，使总体积达到25μl，然后混匀，盖紧管子，pcrmix配方如表4所示。

表4pcrmix配方

4.将混有菌体的pcr混合物短暂离心后置于pcr仪中，pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，退火至58℃保持30sec，于72℃下以1kb/min的速度进行延伸7min，共25个循环；最后于4℃下保存。

5.电泳检测pcr产物，其结果如图2所示，对照marker估计dna片段的大小，选择出含目的片段的阳性克隆。且其中，lane1为marker6000；lane2为菌落1pcr；lane3为菌落2pcr；lane4为菌落3pcr；lane5为菌落4pcr；lane6为菌落5pcr；lane6为菌落5pcr；lane7为菌落6pcr。

6.挑选阳性克隆接种到5mllb/含抗生素的液体培养基中，37℃摇床培养12-16h，准备提取质粒。

7.用omega的plasmidminikiti提取质粒dna。

(6)酶切鉴定

用限制性内切酶bsrgi酶切，酶切体系如表5所示。

表5酶切体系

将反应管放入37℃恒温水浴锅温育3h，取出反应管放入65℃或80℃水浴锅温育20min，使限制性内切酶失活。分别取0.5μl未被酶切的质粒和5μl酶切产物电泳检测酶切是否完全，如图3所示，其显示质粒酶切完全。其中，lane1为marker6000，lane2为plasmidofpez-lv105-hklk1-01，lane3为plasmidofpez-lv105-hklk1-01cutbybsrgi，lane4为plasmidofpez-lv105-hklk1-01cutbyaflii，lane5为marker3000，lane6为marker15000。将反应管放入37℃恒温水浴锅温3h以上，取出酶切产物放入80℃水浴锅温育20min，使限制性内切酶失活，用omega的gelextractionkit回收酶切产物。

(7)测序鉴定

质粒酶切正确，送测序验证，结果与genbank一致。测序结果正确，用omega无内毒素质粒小/中提试剂盒抽提无内毒素质粒。

实施例2：高表达hklk1的慢病毒颗粒的构建

通过慢病毒包装质粒lenti-pac^tm包装hklk1重组质粒后得到的病毒颗粒，且为基于hiv骨架的慢病毒包装质粒lenti-pac^tm，其构建方法如下：

(1)培养包装细胞

转染前两天将数量约为1.3×10⁶-1.5×10⁶的293ta细胞接种到10cm培养板，加入10ml含10％热灭活胎牛血清的dmem培养基，在5％co2、37℃的条件下铺板培养细胞。如293ta细胞在进行转染的当天达到70-80％融合率，则相对容易达到最佳包装效果。

(2)制备dna-endofectin转染复合物

往无菌ep管(a管)加入hklk1重组质粒2.5μg、lentipac^tm混合包装质粒5.0μl(0.5μg/μl)，再添加opti-memi补齐至200μl(此时，a管的质粒总量是5μg)。取另一无菌ep管(b管)，加入endofectinlenti转染试剂15μl，再添加opti-memi补齐至200μl。一边轻柔涡旋a管，一边往a管滴加b管的溶液(注意：请勿颠倒添加顺序)，直到b管溶液全部滴加完毕。溶液混合后，室温放置10-25min，即完成dna-endofectin转染复合物的制备。

(3)转染包装细胞

进行转染操作的当天，将第1步铺板培养的细胞从培养箱取出，将第2步制作的转染复合物均匀滴加至细胞板；吸取转染复合物的动作需轻柔，切勿反复吹打转染复合物。滴加后以8字形水平晃动细胞板(动作需轻柔)，使转染复合物均匀分散。完成转染后，在5％co2、37℃的条件下培养8-14h；转染操作的8-14h后，去除含有转染复合物的旧培养液，添加新鲜的、含2-5％热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的dmem培养液(例如10cm培养板需添加10mldmem)。在这一步骤，可向新鲜dmem培养液添加1/500体积的titerboost^tm滴度增强剂(例如10cm培养板需添加20μltiterboost)，并继续在5％co2、37℃的条件下培养，准备收获慢病毒颗粒。

(4)收获慢病毒颗粒

转染操作的48h后收集细胞培养液，以2000×g离心10min去除细胞碎片，即可获得慢病毒的粗病毒液。

(5)滴度测定

采用慢病毒感染滴度(tcid50)法测定所获慢病毒滴度，并计算病毒滴度(计算公式：1tu＝100病毒基因rna的拷贝数)，结果表明病毒滴度为2.4×10⁸tu/ml。

实施例3：高表达hklk1的慢病毒颗粒(ez.hklk1)治疗病毒性心肌炎心肌纤维化的效果

(1)vmc小鼠模型的建立

1.通过尾静脉注射方式将125mlpez-lv105-hklk1注射进vmc小鼠体内，空载体组(ez.null)小鼠通过尾静脉注射125ul的空载体(不能表达hklk1的慢病毒颗粒)，其余组(模型组(model)、正常组(sham))小鼠通过尾静脉注射125ul生理盐水，每组小鼠的数目为6个。

2.30天后，通过心脏超声检测小鼠心功能。

3.处死小鼠，保存心肌组织，检测心脏/体重比、心肌胶原含量、心肌ⅰ型和ⅲ型胶原水平以及心肌中转化生长因子β1(transforminggrowthfactor-beta1,tgf-β1)蛋白的表达。

(2)结果与讨论

1.心脏体重比

如图4所示，同sham组相比，model组心脏体重比增大，差异具有统计学意义(p＜0.05)。同model组相比，hklk1给药组(ez.hklk1)心脏体重比减小，差异具有统计学意义(p＜0.05)，ez.null组差异无统计学意义(p＞0.05)。

2.心脏超声

如表6所示，与同sham组相比，model组小鼠左心室舒张末期内径(lvedd)、左心室收缩末期内径(lveds)均增大，计算左心室缩短分数(fs)和射血分数(ef)下降，差异有统计学意义(p＜0.05)。同model组相比，ez.hklk1组lvedd、lveds均减小，fs、ef上升，差异具有统计学意义(p＜0.05)，而ez.null组差异无统计学意义(p＞0.05)。

表6各组小鼠lvedd、lveds、fs和ef的水平

3.心肌胶原含量测定

如表7所示，与同sham组相比，model组心肌胶原含量增多，差异有统计学意义(p＜0.05)。同model组相比，ez.hklk1组心肌胶原含量显著减少，差异具有统计学意义(p＜0.05)，而ez.null组心肌胶原含量差异无统计学意义(p＞0.05)。

表7各组心肌胶原含量

4.心肌病理组织学特征

如图5所示，sham组小鼠心肌细胞结构清晰，肌纤维排列整齐，连接完整，无任何炎症浸润、坏死、纤维化。model组小鼠可见明显的心肌纤维化，部分地方呈玻璃样变性，纤维化病灶与心肌相连，还可见少量淋巴细胞浸润。ez.null与model组基本相同，ez.hklk1组间质内增生的胶原纤维明显减少。

5.ⅰ型和ⅲ型胶原蛋白的表达

如图6所示，采用天狼猩红染色后显示sham组小鼠，心肌细胞间隙可见少量红色纤细的胶原；model组小鼠心脏间质可见ⅰ型及ⅲ型胶原，增生粗大的ⅰ型胶原反复重叠，排列无序，直径不均匀，有较强的双折射光；ez.hklk1组心肌胶原纤维增生明显轻于model组，有减轻趋势；而同model组相比，ez.null组小鼠心肌胶原纤维增生改变不明显。与sham比较，model组ⅰ/ⅲ胶原比值显著增高，差异有统计学意义(p＜0.05)，同model组相比，ez.hklk1组ⅰ/ⅲ胶原比值明显降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)，而ez.null组ⅰ/ⅲ胶原比值变化不明显，差异无统计学意义(p＞0.05)，如表8所示。

表8各组小鼠心肌ⅰ/ⅲ胶原比值

6.心肌tgf-β1的表达

如图7所示，同sham组相比，model组tgf-β1的表达均显著升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)。同model组相比，ez.null组tgf-β1的表达无显著差异(p＞0.05)，而ez.hklk1组tgf-β1的表达显著下调，差异具有统计学意义(p＜0.05)。研究中发现hklk1可通过下调tgf-β1的表达，发挥抑制vmc心肌纤维化、改善心功能的作用，具有开发为药物的应用前景。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>东莞市松山湖中心医院（东莞市石龙人民医院、东莞市第三人民医院、东莞市心血管病研究所）

<120>hklk1重组质粒、高表达hklk1的慢病毒颗粒及其构建方法和应用

<141>2020-05-19

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>863

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

catggccaatatgattttattttgactgatagtgacctgttcgttgcaacaaattgatga60

gcaatgcttttttataatgccaactttgtacaaaaaagcaggcttggaaggagttcgaac120

catgtggttcctggttctgtgcctcgccctgtccctgggggggactggtgctgcgccccc180

gattcagtcccggattgtgggaggctgggagtgtgagcagcattcccagccctggcaggc240

ggctctgtaccatttcagcactttccagtgtgggggcatcctggtgcaccgccagtgggt300

gctcacagctgctcattgcatcagcgacaattaccagctctggctgggtcgccacaactt360

gtttgacgacgaaaacacagcccagtttgttcatgtcagtgagagcttcccacaccctgg420

cttcaacatgagcctcctggagaaccacacccgccaagcagacgaggactacagccacga480

cctcatgctgctccgcctgacagagcctgctgataccatcacagacgctgtgaaggtcgt540

ggagttgcccaccgaggaacccgaagtggggagcacctgtttggcttccggctggggcag600

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gccttctgtcgccttcaaagtgc863