用于鼻咽癌筛查的方法和装置与流程

本申请为2014年10月3日提交的，发明名称为“用于鼻咽癌筛查的方法和装置”，申请号为2014800574061的专利申请的分案申请。相关申请案的交叉引用本申请要求保护2013年10月4日提交的美国临时申请第61/886,807号的优先权的权益，其内容通过引用整体并入本文。本公开涉及用于筛查鼻咽癌的方法、组合物和装置。发明背景鼻咽癌症(npc)是流行地区如太平洋和地中海沿岸国家及亚北极地区中年受试者高度流行的恶性肿瘤。npc是中国南方因病死亡的主要原因。遗传和环境因素促成肿瘤风险，并且在npc流行区的高发病率和高人口密度使得npc成为全球的常见癌症。估计全球的高危人群为13-15亿人。每年在北美约有500个新病例，在香港和台湾有5000个病例并且全世界有100,000个病例(ung1999)。npc因为其与人γ疱疹病毒4、爱波斯坦-巴尔病毒(epstein-barrvirus)(ebv)密切、接近绝对的关联，所以是不常见的癌症，每个肿瘤细胞隐匿多个拷贝的在早期、侵袭前病变中已经可检测的相同病毒克隆(pathmanathan1995)。npc出现在鼻后远侧空间，这里npc可发展很少症状，并且在转移组织中首次诊出并不罕见，因此预后不良(skinner1990；ho1998)。尽管在相关人口中发病率和意识越来越高，但是npc的现实仍受后期诊断而控制，通常通过鼻咽镜检查，在早期检测到的肿瘤预后良好(liu1998)。数十年来，ebv和npc之间的密切关联已经吸引了为改进对npc风险的临床诊断的尝试。raab-traub(1987)证明所有组织学子集的npc均含ebvdna。虽然ebv血清学的大型调查描绘了显著关联(例如zeng1986)，但是几乎所有人类的泛在ebv载体状态妨碍ebv血清学得到临床应用(ho1998)。血清学高度灵敏但是缺乏特异性。1992年首次证明了通过分子生物学手段检测ebv基因组进行鼻后活检的诊断希望(feinmesser1992)。虽然生物样品中ebv基因组的分子检测已经成为健全常规程序，但是从小型学术研究(tune1999)到常规流动式应用的转变因为缺乏专用、一次性活检仪器并且需要快速、局部dna分离以免dna降解，所以很困难。两者均提出挑战，尤其是在具有不同技术基础设施水平的流行区。发明概述本发明人已经开发了一种用于筛查鼻咽癌症的高特异性和高灵敏度方法。因此，本公开提供了一种在测试受试者中检测npc或发展npc的风险的方法，其包括(a)提供鼻咽样品，(b)从所述样品分离dna及(c)使用实时pcr由所述dna扩增并检测至少一个ebv靶序列，其中小于或等于31.5的实时pcr循环阈值次数表明所述测试受试者有鼻咽癌或发展鼻咽癌的风险。在一个实施方案中，28至31.5的实时pcr循环阈值次数表明所述测试受试者有发展鼻咽癌的风险。在另一个实施方案中，小于或等于28的实时pcr循环阈值次数表明所述测试受试者有鼻咽癌。循环阈值(ct)可用于计算爱波斯坦-巴尔病毒检测水平(edl)。具体而言，ct值可用于通过使用以对照ebv样品生成的标准曲线测定ebv拷贝数。ebv拷贝数的对数提供了edl。表15展示了ct值、ebv拷贝和edl之间的相关性。在一个实施方案中，大于或等于2.7的edl表明受试者患有npc。在另一个实施方案中，小于1.7的edl表明受试者未患npc。再一个实施方案中，介于1.7和2.6之间的edv是不明确的结果并且测试受试者应在合适的间隔，例如6至8周复检。在一个实施方案中，由刷拭活检提供鼻咽样品。在另一个实施方案中，鼻咽样品包含上皮细胞。在另一个实施方案中，由40-60ng，任选约50ng的dna扩增所述至少一个ebv靶序列。在另一个实施方案中，所述至少一个ebv靶序列在ebna1基因中。在另一个实施方案中，使用对应于seqidno:1和2的引物扩增所述至少一个ebv靶序列。在另一个实施方案中，使用对应于seqidno:4的探针检测所述至少一个ebv靶序列，其中所述探针在5’-末端标记有报告因子荧光团而在3’-末端标记有猝灭因子荧光团。本发明人还已开发了用于获得刷拭活检的改进装置。在一个实施方案中，刷拭活检装置用于获得可以用于本文描述的方法中的鼻咽样品。因此，本公开提供了一种用于获得刷拭活检样品的装置，其包括具有第一端和第二端的纵轴，其中至少两个刷头从所述轴的第二端延伸。在一个实施方案中，所述至少两个刷头包括连接到刷轴上的接触区，所述刷轴从所述轴的第二端延伸。在另一个实施方案中，接触区包括采样表面。在另一个实施方案中，采样表面包括带毛表面、锯齿形表面、蜂巢表面、锯齿表面或多孔表面。在另一个实施方案中，所述至少两个刷头通过颈区连接到所述轴的第二端。在另一个实施方案中，颈区呈0至90度，任选地约65至75度角延伸到所述轴的纵轴线。在另一个实施方案中，刷头从颈区呈0至90度，任选地约65至75度角延伸。在另一个实施方案中，所述至少两个刷头通过刷接头区相互连接。在另一个实施方案中，所述两个刷头相互平行。在另一个实施方案中，所述两个刷头之间的距离为0.5cm至5.0cm，任选地约1.0至2.0cm。在另一个实施方案中，所述两个刷头从所述第二端向外延伸形成v形。在另一个实施方案中，所述v形的角度为10至150度，任选地约20至90度。在另一个实施方案中，在v形的最宽处所述两个刷头之间的距离为0.5至5.0cm，任选地1.0至2.0cm。在另一个实施方案中，接触区可从刷轴上拆卸。在另一个实施方案中，所述轴呈叶片或杆状。在另一个实施方案中，所述轴长度为5至30cm或任选地长度为约13至19cm。本公开还提供了一种用于获得刷拭活检样品的装置，其包括具有第一端和第二端的纵轴及从所述轴的第二端延伸的至少一个刷头，其中所述至少一个刷头可在第一未充气位置和第二充气位置之间移动。在一个实施方案中，刷头在第一未充气位置未伸长而在第二充气位置伸长。在另一个实施方案中，刷头为1至10cm，任选地3至7cm，在所述第二伸长位置比在所述第一未伸长位置更长。在另一个实施方案中，刷头包括可充气接触区和刷轴。在另一个实施方案中，刷头的接触区包括用于提供活检样品的采样表面。在另一个实施方案中，采样表面包括少于50％、40％、30％、20％或10％的接触区。在另一个实施方案中，采样表面在第一未充气位置在接触区的内部而在第二充气位置在接触区的外部。在另一个实施方案中，采样表面包括带毛表面、刷面、锯齿形表面、蜂巢表面、锯齿表面或多孔表面。在另一个实施方案中，轴包括用于为刷头充气的工具。在另一个实施方案中，轴连接到手柄，手柄包括用于为刷头充气的工具。在另一个实施方案中，手柄可从轴上拆卸。在另一个实施方案中，所述装置包括从所述轴的第一端延伸的手柄，手柄包括发光体。在另一个实施方案中，发光体定向为沿着所述轴的纵轴线提供照明。在另一个实施方案中，手柄可从轴上拆卸。在另一个实施方案中，所述轴的第一端可插入手柄上的插孔内。本公开还提供了提供来自于受试者的鼻咽样品的方法，所述方法包括使受试者的鼻咽部与本文描述的任一装置接触。在一个实施方案中，所述方法经口进行。本公开还提供了一种提供来自于受试者的口腔、口咽或下咽部样品的方法，所述方法包括使受试者的口腔、口咽或下咽部与本文描述的装置接触。附图简述现将关于附图对本公开进行描述，其中：图1示出了经口刷拭过程。(a)用轻微正向压力，将毛刷压在鼻咽壁上并且开始刷拭运动以从鼻咽表面采集上皮细胞样品。(b)经口刷拭装置。图2(a)示出了描绘刷尖在鼻后壁的定位的内窥镜图像。图2(b)示出了显示出最少浸渍出血的刷拭后粘膜表面的内窥镜图像。图3示出了各种电子显微镜图像。(a)示出了未用的经口刷尖。(b)示出了具有截留的np组织的刷尖的低倍放大图。(c)示出了收获的大部分完整的np上皮细胞的中等放大图(150x)。(d)示出了带有具有细胞粘附的完整上皮细胞层的np组织收获物的高倍放大图(600x)。图4示出了npc实体瘤和正常受试者的edl值的分布模式。两种组织病理学类型之间明显的显著界限展示出这种测定法区别无npc分子标记的患者与有npc分子标记的患者的潜力。图5示出了经刷拭的npc肿瘤和正常受试者的edl值的分布模式。所述两组用除一个假阴性结果以外的单独曲线清楚地描绘。图6示出了实时pcr中的4个主要阶段；线性基态期、早期对数期、对数-线性期和平台期。图7示出了abisds的典型扩增曲线。图8示出了具有分叉刷头的刷拭活检装置。(a)是刷拭活检装置(b)的分叉刷头的放大图。图9示出了分叉刷头的不同构造。(a)和(b)示出了非平行分叉刷头。(a)是(b)的刷拭活检装置的非平行分叉刷头的放大图。(c)和(d)示出了平行分叉刷头。(c)是(d)的刷拭活检装置的平行分叉刷头的放大图。图10示出了可用在采集样品的刷拭活检装置上的各种表面。(a)示出了多孔表面，(b)示出了蜂巢环形表面，(c)和(d)示出了锯齿形或锯齿表面。图11示出了可以与刷拭活检装置一起使用的各种轴。(a)描绘了叶片，(b)描绘了杆并且(c)详述了颈部接头区和刷头的角度。图12(a-c)示出了可拆式刷头。图13描绘了使用中的可充气刷头。(a)描绘了充气之前(在鼻咽下方)的可充气刷头而(b)描绘了充气之后(在鼻咽内部)的可充气刷头。图14描绘了呈其未充气((a)和(d))和充气((b)和(e))形式的可充气刷头。(c)是沿线i-i截取的图13(b)的充气刷头的横截面图。图15描绘了仅在充气后露出接触表面的可充气刷头。(c)描绘了接触表面未露出的未充气刷头而(d)描绘了接触表面露出的充气刷头。(a)是沿(c)的线i-i截取的未充气刷头的横截面图。(b)是沿(d)的线ii-ii截取的充气刷头的横截面图。图16描绘了在可充气刷头的轴内的空气通道。图17(a)和(b)描绘了包括用于为刷头充气的工具的可充气刷头。图18(a)和(b)描绘了连接到装有用于为刷头充气的工具的手柄上的可充气刷头。发明详述本公开的方法本发明人已经开发出一种用于筛查鼻咽癌症的高特异性和高灵敏度方法。因此，本公开提供了一种在测试受试者中检测鼻咽癌或发展鼻咽癌的风险的方法，其包括：a.提供来自于所述受试者的鼻咽样品，b.从所述样品分离dna，c.使用实时pcr由所述dna扩增并检测至少一个ebv靶序列，其中小于或等于31.50的实时pcr循环阈值次数表明所述测试受试者有鼻咽癌或发展鼻咽癌的风险。如本文中所用，术语“鼻咽癌症(nasopharyngealcancer)”或“鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma)(npc)”是指从鼻咽粘膜上皮产生的恶性赘生物或癌症。鼻咽癌的分期基于临床和放射性检查：i期是限于鼻咽的小肿瘤，ii期是局部区域扩大的肿瘤，或是具有有限颈部(结节)疾病的任何证据的肿瘤，iii期是有或无颈部疾病的大型肿瘤，或有双侧颈部疾病的肿瘤而iv期是涉及颅内或颞下区域、广泛性颈部疾病和/或任何远端转移的大型肿瘤。鼻咽癌与感染爱波斯坦-巴尔病毒(ebv)相关。爱波斯坦-巴尔病毒(ebv)是人dna肿瘤病毒。每个npc肿瘤细胞携带促成肿瘤发展的附加体ebv拷贝。如本文中所用，措辞“检测鼻咽癌症”还指在症状发生前的受试者中检测鼻咽癌症。“检测鼻咽癌症”还包括检测鼻咽癌症的严重程度、进展和/或分期，或放射或化学治疗后局部或区域性复发的出现。措辞“检测鼻咽癌症”还包括预测鼻咽癌症的预后、治疗结果以及存活时间。如本文中所用，措辞“提供鼻咽样品”是指从受试者获得鼻咽的样品或活检的任何方式。鼻咽是咽部最上面的部分。提供或获得鼻咽样品的方法在本领域中公知。“提供鼻咽样品”包括提供来自于鼻咽表面的组织和/或细胞样品。在一个实施方案中，细胞为上皮细胞如鳞状上皮细胞和呼吸道上皮细胞。在其它实施方案中，细胞为淋巴样细胞(淋巴细胞)或血细胞。可经鼻或经口获得样品。在一个优选实施方案中，经口获得样品，因为与可能不适且在患者中难以进行的经鼻途径相比，这是相对舒适且无创伤的进入鼻咽的方式，极少出血或不出血。在经鼻方法中涉及从贯穿鼻部的鼻咽两侧通过前后鼻腔的活检。经口方法同样地通过一个入口点进入鼻咽的两侧。在一个实施方案中，使用毛刷或拭子从鼻咽获得组织和/或细胞，优选上皮细胞的样品。使用毛刷获得的组织和/或细胞的样品也称为“刷拭活检”。下面更加详细地描述了用于获得鼻咽样品的刷拭活检装置的实例。本方法包括从鼻咽样品分离dna。在一个实施方案中，dna为总dna。从组织或细胞样品分离或提取dna的方法在本领域公知。例如，可使用商业试剂盒如来自于rochediagnostics的magna核酸分离液和magna纯lcdna分离试剂盒提取dna。再如，使用dna提取机器人提取dna，如来自于9604型的qiagen自动化dna提取。提取之后，任选地为dna定量并标准化为特定浓度。dna定量方法在本领域公知。例如，任选地使用荧光结合染料结合荧光测定法为dna定量。在一个实施方案中，将dna浓度标准化为8-12ng/μl，任选地10或约10ng/μl。本方法包括对dna进行实时pcr。在一个优选实施方案中，在dna已经标准化为特定浓度之后，对dna进行实时pcr。在一个实施方案中，对约5μl约10ng/μl的等分试样或50ng的总dna进行实时pcr。本领域的技术人员将认识到可以使用其它dna浓度(例如，1至50ng/μl，任选地5至20ng/μl)和量(例如，10至100ng，任选地25至75ng的dna)。“实时pcr”或“实时聚合酶链式反应”是一种用于扩增并同时量化核酸序列的方法。该程序按照聚合酶链式反应(pcr)的一般原理。pcr为本领域的技术人员公知。pcr依赖于为了dna解链和核酸酶促复制的反应的重复加热和冷却循环。含有与靶区互补的序列的引物连同dna聚合酶使得选择性重复扩增成为可能。随着pcr进行，生成的dna本身用作复制的模板并且因此dna模板随着反应的进行呈指数性扩增。在实时pcr中，在反应进行时检测反应的产物。检测实时pcr中的产物的两种常用方法是：(1)插入任何双链dna的非特异性荧光染料，和(2)由标记了仅允许在探针与其互补dna靶标杂交之后检测的荧光报告因子的寡核苷酸组成的序列特异性dna探针。如本文中所用，术语“ebv靶序列”是指ebv基因组中存在的核酸序列。ebv基因组序列的实例为基因库登录号v01555的ebvb95.8基因组序列。ebv靶序列任选地长度为10-200、15-150、20-120、30-110、40-100、50-90、60-85或70-80个核酸残基。在一个实施方案中，ebv靶序列是ebv基因组中存在但是在受试者的基因组中不存在的核酸序列。在另一个实施方案中，ebv靶序列是已知编码在ebv相关恶性肿瘤如鼻咽癌症中表达的病毒蛋白的ebv基因中存在的核酸序列。ebv靶序列的实例包括ebna1基因中所含的序列。ebna1也称为爱波斯坦-巴尔核抗原1并且编码ebv病毒蛋白。例如，在以下ebv基因组中可以找到ebna1序列：●人疱疹病毒4完整野生型基因组○171,823bp环状dna○登录号：aj507799.2；gi:86261677●爱波斯坦-巴尔病毒(ebv)基因组，菌株b95-8○172,281bp环状dna○登录号：v01555.2；gi:94734074●1型人疱疹病毒4，完整基因组○171,823bp环状dna○登录号：nc_007605.1；gi:82503188●人疱疹病毒4菌株mutu，完整基因组○171,687bp环状dna○登录号：kc207814.1；gi:428161102ebv靶序列的实例包括其它ebv基因中所含的序列，包括但不限于ebv核抗原2(ebna2)、ebna-3a、ebna-3b、ebna-3c、ebna-lp、lmp-1(ebv潜伏膜蛋白1)、lmp-2a、lmp-2b和eber(eber1和eber2；与爱波斯坦-巴尔病毒相关的小核rna)。本领域的技术人员将易于理解如何设计用于通过实时pcr扩增ebv靶序列的引物。如本文中所用的术语“引物”是指当处于包括合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时(即在核苷酸和诱导剂如dna聚合酶的存在下并且在合适的温度和ph下)，能够起到合成点的作用的核酸序列。引物必需足够长以在诱导剂的存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于多种因素，包括温度、引物的序列和所用的方法。引物通常含15-25个或更多个核苷酸，虽然其可以含有更少的，例如，5、10、12或15个核苷酸。确定引物的适当长度所涉及的因素易于为本领域的普通技术人员所知。用于扩增ebna1中的ebv靶序列的引物的实例包括seqidno:1(5'-gtcgtctcccctttggaatg-3’)和seqidno:2(5'-aataacagacaatggactcccttagc-3')。seqidno:1和2扩增ebna1的75个碱基对的片段(seqidno:3；gtcgtctcccctttggaatggcccctggacccggcccacaacctggcccgctaaggagtccattgtctgttatt)。本领域的技术人员还将易于理解如何设计用于通过实时pcr检测ebv靶标的探针。如本文中所用的术语“探针”是指将与ebv靶序列杂交的核酸序列。本领域的技术人员将理解，ebv探针应设计为检测属于扩增序列范围内的序列(例如，位于正向和反向引物之间的区域)。探针的长度取决于杂交条件及探针和ebv靶序列的序列。在一个实施方案中，探针长度为至少8、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、400、500个或更多个核苷酸。术语“杂交”是指与互补核酸的序列特异性非共价结合相互作用。在一个实施方案中，在至少中等严格条件下进行杂交。在一个优选实施方案中，在至少中等严格杂交条件下进行杂交。用“至少中等严格杂交条件”，意为选择促进溶液中两种互补核酸分子之间的选择性杂交的条件。可对所有或一部分核酸序列分子发生杂交。杂交部分长度通常为至少15个(例如20、25、30、40或50个)核苷酸。本领域的技术人员将认识到，核酸双链体或杂交体的稳定性由tm决定，tm在含钠缓冲液中是钠离子浓度和温度的函数(tm＝81.5℃-16.6(log10[na+])+0.41(％(g+c)-600/i)，或类似方程式)。因此，洗涤条件中决定杂交体稳定性的参数为钠离子浓度和温度。为了鉴定与已知核酸分子类似但不相同的分子，可采取1％错配以引起tm降低1℃，例如若寻找具有>95％序列同一性的核酸分子，则最终洗涤温度将降低约5℃。基于这些考虑，本领域的技术人员将能够容易地选择适当的杂交条件。在优选实施方案中，选择严格杂交条件。举例而言可采用以下条件以实现严格条件：基于以上方程式在5x氯化钠/柠檬酸钠(ssc)/5xdenhardt溶液/1.0％sds中在tm-5℃下杂交，接着0.2xssc/0.1％sds在60℃下洗涤15分钟。中等严格杂交条件包括在42℃下于3xssc中15分钟的洗涤步骤。然而，应理解，使用替代缓冲液、盐和温度可达到等效严格性。另外的关于杂交条件的指导可在以下找到：currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,n.y.,1989,6.3.1-6.3.6和sambrook等，molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,2000,第三版。用于检测ebv靶标的探针包括可检测标记。在一个实施方案中，探针标记有荧光团(荧光探针)。在另一个实施方案中，探针包括在一个末端的报告因子和在探针另一端的猝灭因子。用于本方法的荧光探针的一个实例为在5’末端经报告因子(fam)且在3’末端经猝灭因子(tamra)双重标记的taqman探针。用于检测ebv靶序列的一种taqman探针的序列为seqidno:4(5'-(fam)cctggacccggcccacaacc(tamra)-3’)。seqidno:4检测ebna1基因位于正向和反向引物(分别为seqidno:1和2)之间的区域。用于本方法中的其它探针可具有不同的设计和荧石(flour)组合。实例包括mgb探针和scorpion探针。在一个实施方案中，除非裂解掉荧石或其与猝灭因子分离，否则荧光探针不发荧光。可使用的其它荧石/报告因子包括但不限于vic、tamra和sybr绿。在另一个实施方案中，在实时pcr反应期间共同扩增并检测内部对照。内部对照任选为人类基因如rna酶p基因中所含的靶序列。本领域的技术人员可易于设计内部对照的引物和探针。在一个实例中，使用tagmanrna酶p检测试剂盒扩增并检测rna酶p基因靶序列。在实时pcr期间，扩增并检测ebv靶序列。在一个实施方案中，pcr扩增循环为2'/50℃、5'/95℃、40x{20"/95℃、60"/62℃}。pcr可具有许多不同条件。本领域的技术人员将能够容易地优化pcr反应。例如，反应体积可在5μl至200μl之间变化。在其它实施方案中，杂交时间可在10秒至1分钟之间变化并且杂交温度可在50℃或更低至72℃之间变化。如本文中所用，术语“ct”是指循环阈值次数。循环阈值次数是来自于扩增序列的信号首次被记录为在统计上显著强于本底信号的pcr循环。起始模板中存在的靶序列越多，对于该荧光强度而言超过阈值需要的pcr循环将更少。本领域的技术人员将认识到，ebv靶序列的ct值将取决于用于检测的荧光探针的独特发射光谱。在一个实施方案中，ebv靶序列的ct值是taqman探针的ct值(ct(fam))。ebv靶序列的ct值指示受试者是否有npc或处于发展npc的风险。在一个实施方案中，小于31.50的ct值指示受试者有npc。大于31.50的ct值指示受试者没有npc，或受试者有npc的可能性低。在另一个实施方案中，介于31.50和40.00之间的ct值指示ebv相关的npc可能性低。虽然受试者或许应在适当间隔，例如6至8周后复检，但在没有其它临床发现时，认为受试者正常。在另一个实施方案中，介于28.00和31.50之间的ct值指示受试者处于高于正常的发展npc的风险。在另一个实施方案中，小于28.00的ct值指示受试者有npc。ct值可以转换为爱波斯坦-巴尔病毒检测水平(edl)。具体而言，ct值可用于测定ebv拷贝数，因为样品中存在的ebv越多，检测ebv所需的pcr循环越少，ct值与ebv数量成反比。一旦确定ct值，就可使用以对照ebv样品生成的标准曲线将其与ebv拷贝数关联起来。ebv拷贝数的对数提供了edl。表15展示了ct值、ebv拷贝和edl之间的相关性。因此，本公开还提供了：a.提供来自于所述受试者的鼻咽样品，b.从所述样品分离dna，c.使用实时pcr由所述dna扩增并检测至少一个ebv靶序列，及d.计算edl并确定测试受试者是否有或处于发展鼻咽癌的风险。在一个实施方案中，大于或等于2.7的edl指示受试者有npc。在另一个实施方案中，低于1.7的edl指示受试者没有npc。再一个实施方案中，介于1.7和2.6之间的edl是不明确的结果并且测试受试者应在合适的间隔，例如6至8周复检。本文描述的方法也适用于在测试受试者中检测其它类型的癌症、癌或发展其它类型的癌症。在一个实施方案中，本文描述的方法用于在受试者中检测口咽癌症的存在。口咽是咽的中间部分并且包括舌的后三分之一、喉的侧壁和后壁和扁桃体。口咽癌症是发生在该区域内的上皮细胞癌症。约70％的口咽癌症与人乳头瘤病毒(hpv)，特别是菌株hpv16相关。在另一个实施方案中，本文描述的方法用于在受试者中检测口腔中癌症的存在。口腔是包括舌、口腔侧壁(颊粘膜)、硬颚和软腭、口腔底和齿龈的空腔的一部分。在另一个实施方案中，本文描述的方法用于在受试者中检测在下咽部和/或喉部中癌症的存在。下咽部是在邻近喉部的舌根下方的咽下面部分。喉部由声带及上方(声门上)和下方(声门下)区域组成。因此，在本公开的一个实施方案中，提供了在测试受试者中检测口腔、口咽、下咽和/或喉部癌症或发展口腔、口咽、下咽和/或喉部癌症的风险的方法，所述方法包括：a.提供来自于受试者的口腔、口咽、下咽部或喉部样品，b.从样品分离dna，c.使用实时pcr由所述dna扩增并检测至少一个hpv16靶序列，其中小于或等于特定数值的实时pcr循环阈值次数表明测试受试者有口腔和/或口咽、下咽或喉部癌症。在一个实施方案中，将循环阈值次数转换为用于确定测试受试者是否有口腔和/或口咽、下咽或喉部癌症的edl。使用hpv16引物和探针，例如，geneprobe和roche提供的hpv16引物和探针，任选地扩增并检测hpv16靶序列。在另一个实施方案中，使用如本文所述的刷拭活检装置获得口腔、口咽、下咽和/或喉部样品。刷拭活检装置本发明人已经开发了用于获得活检样品的新型装置。因此，本公开提供了特别设计用于从体表如鼻腔、鼻咽、口腔、口咽、下咽部和喉部收获组织和/或细胞的刷拭活检装置。如上所述，鼻咽癌症(npc)起源于鼻咽。鼻咽是咽部最上面的部分并且未经适当训练和不使用特殊医疗仪器如内窥镜可难以进入和可视化。在一个实施方案中，本文描述的装置用于从鼻咽获得活检样品，优选刷拭活检样品。如本文中所用，术语“刷拭活检样品”是指通过用毛刷或拭子刷拭或刮擦体表以从采样区取下细胞和/或组织采集的细胞和/或组织。在其它实施方案中，所述装置用于从颈部、口咽、口腔、舌根、扁桃体区、会厌(vallecular)和/或下咽部获得刷拭活检样品。所述装置可用于从前述任何区域采样和/或取回各种细胞类型，包括但不限于淋巴样细胞、上皮细胞和粘膜细胞。一旦获得细胞样品，就可进行细胞的细胞学分析以确定癌症存在或不存在。例如，除从鼻咽取回样品以检测爱波斯坦-巴尔病毒和检测鼻咽癌外，本文描述的装置也可用于取回样品以检测人乳头瘤病毒dna和检测口腔、口咽、下咽部和/或喉部癌症。所述装置也可用于检测鳞状细胞癌、乳头瘤或其它病毒引起的肿瘤的存在。所述装置也可用于检测细菌和病毒。在其它实施方案中，所述装置用于刷拭扁桃体表面以取回用于细胞遗传学或流式细胞术研究的样品以检测淋巴瘤或其它淋巴细胞增生性病症。所述装置也可用于刷拭口腔和口咽以检测爱波斯坦-巴尔病毒以诊断单核细胞增多症。分叉刷拭活检装置用于从鼻咽处获得活检样品的现有技术装置的一个局限性在于其仅允许在单一部位采集。在npc处于其早期的情况下，并不一定所有鼻咽表面均含癌细胞。从一个以上的鼻咽区域获得样品增加了可以使用本文描述的方法，检测鼻咽癌症，特别是早期鼻咽癌症的可能性。下面描述的装置允许同时从两个不同的鼻咽区域取活检样品。具体而言，分叉刷头允许装置进入npc通常发生的罗森米勒窝(fossaeofrosenmuller)(也称为鼻咽后外侧隐窝)的两个区域。参考图8，示出了具有分叉刷头的刷拭活检装置1。该装置具有纵轴2和两个刷头3，包括分叉刷头。刷头3通过颈区4连接到轴2。刷头包括接触区5和刷轴6。接触区5用于从鼻咽或其它解剖区域获得活检样品。刷轴6连接到颈区4。在一个实施方案中，每个刷头3经由大致垂直于颈区4延伸的刷接头区7从颈区4延伸。在另一个实施方案中，刷头3直接从轴上延伸，未使用颈区和/或刷接头区。参考图9，刷头3的不同构造是可能的。如图9(a)和(b)所示，刷头3可呈不平行或“v形”相互远离延伸，使得两个刷头的接触区5比两个刷头的刷轴6更加相互远离。在一个实施方案中，一个或两个刷头呈一定角度(x)从刷接头区7延伸。角度(x)任选小于90度，任选为45至85度。在另一个实施方案中，两个刷头呈10至150度，任选地呈20至90度角从彼此延伸。在一个实施方案中，在v形最宽处两个刷头之间的距离(a)为0.5cm至5.0cm，任选地1.0至2.0cm。在一个实施方案中，在v形范围最窄部分两个刷头之间的距离(b)为0.1cm至5cm，任选地0.2至1cm或约0.2或0.5cm。在另一个实施方案中，在v形最窄部分两个刷头之间的距离(b)对应于轴2的宽度。刷头的垂直长度(c)任选为1至5cm或2至3cm，任选为约3cm。如图9(c)和(d)所示，在另一个实施方案中刷头3相互平行延伸。在一个实施方案中，两个刷头3之间的距离任选地范围从0.5cm至5cm，任选地约1.0至2.0cm。在另一个实施方案中，两个刷头之间的距离对应于轴的宽度。刷头的垂直长度任选为1至5cm或2至3cm，任选为约3cm。接触区5可以呈对获得活检样品有用的任何形状。在一个实施方案中，接触区呈杆状或圆柱体形状。在另一个实施方案中，接触区呈叶片状。图10中示出了接触区5的各个实施方案。接触区5可包括用于从体表如鼻咽获得组织和/或细胞样品的任何采样表面10。有用的采样表面10的实例包括带毛表面、刷面、如图10a所示的多孔表面、如图10(b)所示的蜂巢表面及如图10(c)和(d)所示的锯齿形或锯齿表面。采样表面10任选地仅覆盖接触区的一部分(例如小于50％、40％、30％、20％或10％的接触区，接触区的一侧(参见例如图14中的表面10)或任选地在整个接触区上方延伸(例如呈图10(b)中所示的环状排列)。各种材料均可用于采样表面10，包括但不限于塑料、聚合物、不锈钢微丝、尼龙(nylon)、碳钢、铜、硅浸渍尼龙和聚酰胺纤维(tynex)。不同的轴可与本文描述的刷拭活检装置一起使用。在一个实施方案中，如图11(a)所示，轴2具有叶片形状。叶片大致平坦，具有宽度(w)。宽度(w)任选为1至5cm，任选为2至4cm或约3cm。在一个实施方案中，颈区4具有与轴2近似的宽度。在另一个实施方案中，如图11(b)所示，轴2为杆状。在一个实施方案中，轴2的长度为5至30cm，任选地13至19cm并且优选为约15cm。在另一个实施方案中，颈区4为杆状并且任选地具有与轴2近似的直径。各种材料均可用于轴和/或颈区如塑料或金属。在一个实施方案中，轴为刚性或半刚性。在另一个实施方案中，轴可顺应性弯曲。如图11(c)所描绘，颈区4任选地呈一定角度(a)从轴2上延伸。角度(a)任选为0至90度或0至-90％(即尖端朝下)并且优选为65至75度(或在向下方向上为-65至75度)。如图11(c)进一步所示，刷头3任选地呈一定角度(b)从颈区4延伸。角度(b)任选为0至90度并且优选为65至75度。成角度的刷头利于从鼻咽、口咽或下咽部采集样品。在一个实施方案中，颈区4具有与轴2近似的宽度。刷头和/或接触区5在已经采集样品之后任选地可从活检装置上拆卸。接触区可从刷轴(例如图12(a)-(c)所示)上拆卸或整个刷头可从活检装置的其余部分拆卸。一旦拆卸，刷头和/或接触区就可储存在组合物如运输缓冲液中。可充气刷拭活检装置从鼻咽或口咽获得活检样品的另一难点在于可能难以进入采样部位，同时确保患者最小限度的不适或咽反射。本文描述了包括可纵向延伸的可充气刷头的刷拭活检装置。如图13所示，刷拭活检装置可呈其未充气形式插入患者体内(图13(a))。一旦正确定位于患者体内，就可为刷头充气，使得刷头延伸/延长以允许进入鼻咽(图13(b))，或类似地，进入下咽部。本文描述的可充气刷拭活检装置优于现有技术中的刷拭活检装置的优点包括毛刷伸长或延长使其进入鼻咽或口咽。在一个实施方案中，延伸是对鼻咽特定的，为3-7cm长。另一个优点是在一个实施方案中，采样表面只有在毛刷处于其充气/延伸位置时才显露。这种构造将活检之前表面与咽部组织的接触减到最少并且减少了咽反射的机会。进一步地，在另一个实施方案中，采样表面仅在刷头的一侧。这种构造允许单面刷拭，将对软腭或并非旨在活检的咽部区域的损伤减到最少。在另一个实施方案中，延伸是对口咽特定的，为3-10cm长。参考图14，示出了可充气刷头13。可充气刷头包括可充气接触区15和刷轴15。图14(a)和(e)中示出了呈其未充气形式的可充气接触区15并且图14(b)和(f)中示出了呈其充气形式的可充气接触区15。呈其充气形式时，接触区15任选地比呈其未充气形式时长1至10或3至7cm。在另一个实施方案中，接触区延伸的长度对应于鼻咽腔、下咽部或口咽的长度。参考图14(c)，接触区任选地包括在接触区15上的采样表面10。采样表面10可包括用于从体表如鼻咽获得组织和/或细胞样品的任何表面。接触区还任选地包括经充气允许刷头13延长/延伸的内部气囊17。图14(d)，是沿图14(b)的线i-i截取的接触区的横截面，描绘了包括锯齿形表面的采样表面10。采样表面10仅部分地在接触区15周围延伸。在一个实施方案中，用于接触鼻咽的采样表面在接触区的一侧。与环形表面相反，仅有单个用于刷拭的表面可以将对软腭或咽部侧壁的损伤减到最少。在另一个实施方案中，采样表面10在整个接触区(例如呈环状排列)延伸。在一个实施方案中，刷头充气允许接触区打开以接触鼻咽。例如，在图15描绘的实施方案中，呈图15(a)和(c)所示的未充气形式时，用于接触鼻咽的表面10装在接触区5内。呈图15(b)和(d)所示的充气形式时，用于接触鼻咽的表面在接触区5的外部。本领域的技术人员将易于认识到，各种工具均可用于为可充气刷头充气。如图16所示，可充气刷头的轴2任选地包括允许空气进入可充气刷头的空气通道21(箭头指向刷头的方向)。可通过各种工具通过空气通道将空气引入可充气刷头。在一个实施方案中，活检装置包括用于为可充气头充气的工具。在一个实施方案中，用于为可充气刷头充气的工具包括可手动操作的触发器。可手动操作的触发器30任选地处于轴2(图17(a)和(b))上，从轴2延伸的手柄40(图18(a)和(b))上。在一个实施方案中，手柄40可从轴2上拆卸。可手动操作的触发器从第一位置到第二位置移动为可充气刷头充气。在一个实施方案中，触发器可操作地连接到弹簧或线圈23上，弹簧或线圈23任选地通过气囊22可操作地连接到空气通道21。弹簧或线圈23任选地位于轴2内。空气通道21通向可充气刷头13。将触发器从第一位置移动到第二位置后，线圈或弹簧被压缩，将空气移入空气通道2内，任选地先通过气囊22，并进入可充气刷头13，从而为其充气。可充气刷拭活检装置的其它构造将对本领域的技术人员显而易见。例如，在另一个实施方案中，所述装置包括两个可充气刷头。所述两个可充气刷头任选地呈类似于本文描述的分叉刷头装置的刷头的方式构造。具有发光手柄的毛刷从体内获得生物样品的另一难点涉及待采样区域的可视化。例如，取鼻咽的刷拭活检样品时，需要为鼻咽照明。常常这伴有发光体和刷拭装置的双重使用。然而，此类系统需要操作人员使用双手。本发明人已经开发了用于从体表如鼻咽获得样品的毛刷装置，其中所述装置还包括发光体。该装置仅需一只手来为体腔照亮和获得样品。因此，本文描述的分叉刷拭活检装置和可充气毛刷装置也可与发光手柄一起使用。在一个实施方案中，所述装置的轴可收到包括发光体，任选led灯的手柄中。该发光体定向为使其允许照亮待采样的区域。手柄任选地包括用于容纳轴的插孔。优选地，插孔部分具有足够强度来支撑叶片以允许舌头凹陷。在另一个实施方案中，手柄还包括用于为可充气刷头充气的触发器。在一个实施方案中，刷拭活检装置为一次性，而发光手柄可重复使用。手柄还任选地包括用于为可充气刷头充气的工具。以上公开总体上描述了本公开。通过参考以下具体实施例可以获得更全面的理解。描述这些实施例仅仅是为了说明的目的而非旨在限制本公开的范围。当环境可能建议或提供权宜之计时，考虑到了形式上的变化和等效方案的取代。虽然本文已经采用了特定术语，但是此类术语意在描述性意义上而不是为了限制的目的。以下非限制性实施例说明了本公开：实施例实施例1：鼻咽癌症筛查方法新开发的定量pcrnpc风险检测测定法进行临床试验。npc的筛查和检测使用来自于primexlaboratory,vannuys,california的经口刷拭活检/q-pcrebvdna检测系统(npscreentm)进行。试剂盒包括与dna保存液和运输瓶配对的一次性、经口np上皮ebvdna收获毛刷装置。研究受试者、部位和设计：入选标准：进行刷拭活检的患者包括治疗前的npc确认患者；居住在香港的高危国人或来自于高危流行区的居住在加拿大多伦多的第一代中国移民；有npc家族史的个人；由于存在疑似npc的临床症状，或仅仅是患者由于家族性风险因素而自己要求由初级医生送交进行常规ent筛查和/或ent评估的患者。排除标准：排除npc治疗后的患者；年龄小于20岁的患者；免疫抑制个体；或不能坚持2年的研究随访评估期的患者。总共来自于两个国家的600名研究受试者(中国香港：radiationoncologyclinic、queenmaryhospital、universityofhongkong；radiationoncologyclinicandtheheadandneckclinic,queenelizabethhospital。加拿大多伦多：otolaryngology-headandneckclinic、rougevalleyhealthsystem、centenarysite、scarborough和多伦多两大ent医务所)。所有先证者均由在npc诊断学上具有长期专业知识的有经验的ent外科医生/或肿瘤学家进行彻底的临床ent/头颈部检查，接着使用软式内窥镜进行鼻咽的经鼻检查。经口刷拭过程：所有受试者根据生产商说明用所述装置进行np的经口刷拭。患者直立定位并使用压舌板露出口腔，经口毛刷指向后咽部区域。倾斜尖端轻轻地放在np壁上，进行轻轻刷拭和旋转以获取np上皮样品(图1a)。样品的保存、制备和运输：将毛刷从口腔取出之后，将刷尖从毛刷手柄上拆卸并插入运输瓶中，其中如同生产商说指示的那样，将样本浸入dna保存/运输缓冲液中。用条形码id编号标识样品，在室温下本地存储并且在5天之内分批运输到分析实验室。npc诊断：npc阴性：ent检查正常，包括鼻咽镜检查正常的受试者如果在临床和内窥镜检查上保持阴性两天，则被归类为npc阴性。进行活检并且具有除npc外的最终组织病理学诊断的患者被归类为npc阴性。npc阳性：仅通过内窥镜检查具有疑似np病变的受试者根据实践标准进行活检。组织病理学阳性的受试者被归类为npc阳性。通过内窥镜检查被归类为非npc，但是具有初步ebv阳性刷拭结果的受试者在3至4个月时进行再次刷拭并且定期随访长达2年。如果2年随访这些受试者在临床和/或内窥镜检查上保持阴性，则将初步和/或再次刷拭阳性结果视为假阳性(fp)。另外，ebv刷拭阳性但活检阴性的受试者也被归类为刷拭fp。结果不明确的受试者在3个月内再次刷拭并且随访ent和np内窥镜检查长达2年。样品处理和定量聚合酶链式反应dna(q-pcr)分析：由primex实验室使用abiprism7700序列检测系统(appliedbiosystems(abi),fostercity,ca)处理样品。使用9604型qiagen自动化dna提取机器人(valencia,ca)提取来自于刷拭样品的dna。通过荧光测定法测量dna并调节至10ng/μl。用42份重复刷拭样品(5μl)和复制标准品(5000、500、50、5和0个ebv拷贝)接种taqman96孔板。taqman通用pcr主要混合物、尿嘧啶n糖基化酶和人基因组小核糖体亚基基因座的内标引物/探针组购自abi。爱波斯坦-巴尔病毒dna载量的q-pcr和测定(爱波斯坦-巴尔病毒检测水平-edl)：试验涉及使用实时聚合酶链式反应(q-pcr)的体外核酸杂交，以检测、扩增和定量爱波斯坦-巴尔病毒(ebv)dna。试验扩增ebv基因组的特定区域并且经由荧光染料检测。这些染料为寡核苷酸探针，其与扩增产物特异性结合。使用经primex实验室测定提供与npc诊断相关的最高灵敏度和特异性的ebv-ebna-1引物/探针(5’-3’)。监测pcr运行期间的荧光强度允许检测并定量积累的产物。输出的是达到预定强度水平的循环分数(ct)，然后使用建立的标准曲线将其转换为爱波斯坦-巴尔病毒dna检测水平(edl)。揭开条形码后，将其与临床数据匹配。还对32个经组织学确认的活检npc实体瘤样本进行q-pcr分析并且与20个组织学阴性的实体样本比较。然后将来自于实体瘤的edl的分布模式与来自于经口刷拭活检的实体瘤的edl分布曲线做比较。edl结果报告和阐述：根据实验室参考指南，将npscreentm的结果归类为正常/阴性(edl低于1.7)；不明确(edl为1.7至2.6)；异常/阳性(edl等于或大于2.7)。统计学：通过曼-惠特尼检验(mann-whitneytest)分析数值。通过费希尔精确检验(fisher’sexacttest)比较群组。使用woolf近似法计算优势率。所有检验均为双尾并且显著性设为5％。结果经口刷拭总共分析的600名患者使用npscreentm进行经口刷拭。该过程通常在1分钟内完成并且除两名患者外，全部对该过程耐受良好。未记录到不良事件，包括出血、过度疼痛、恶心或呕吐。所有患者离开诊所，无并发症。两名患者有过度活跃的咽反射并且不能耐受该过程。这两名患者在离开之前未报告任何不良事件。总共11名患者刷拭未完成，导致dna结果不足。在研究早期(在前100名患者中)收集了10份不足样品。随后，所有剩余的刷拭都成功，仅一个失败。报告dna不足的原因是由于刷拭者最初缺乏经验和/或不能进入鼻咽；或施加的刷拭压力不足以取回足够的表面上皮细胞层进行采样。经口刷拭似乎提供了进入np罗森米勒窝两侧的适当入口。这通过几张并行的内窥镜引导的照片确认，使毛刷定位在np空间的两侧。刷拭后内窥镜检查还证明上皮表面的浸渍最少，出血可以忽略(若有)(图1b、2a、2b)。因此，通过刷尖收获的组织似乎在最表面。通过在组织收获之前(图3a)和之后(图3b、3c)对塑料刷面的扫描电子显微镜检查证实鼻咽上皮组织截留在多孔刷面上。重要的是，上皮细胞保持粘附(图3d)，组织破坏很少，表明主要收获的是完整上皮细胞。样品分析：最初600名患者中，最后一个群组为578名。这是在排除dna不足的13份样品之后(11份样品由于刷拭经验不足而失败并且2份由于患者过度作呕而刷拭未完成)。8名患者不能够坚持2年随访评估并且也从研究中排除。结果持续不明确，无临床疾病证据的一名患者也被排除。研究人口由263名女性(平均年龄：53；范围28-82)和315名男性(平均年龄：52；范围：20-86)组成。npc实体瘤和刷拭活检样品的edl分布当分析并比较来自于npc实体组织与组织病理学阴性np组织的edl值时，这两组之间的edl值不存在重叠(图4)。类似地，用除edl为1.6的一个假阴性无关项外的独立曲线清楚地描绘刷拭活检结果的edl分布(图5)。这名无关患者具有阳性内窥镜检查结果和阳性组织学检查。最初有12次假阳性刷拭。在这12名假阳性中，一名患者内窥镜检查为阳性，但是后续活检为阴性。这名患者的edl恰好高于不明确范围。一名患者的内窥镜检查为阴性而鼻咽的后续活检在组织学上为阴性。在12次假阳性刷拭中，11次内窥镜检查为阴性。这些患者中有3名(3/11)最终在临床上呈现组织学上确认的npc，6名(6/11)在复检时恢复正常，1名(1/11)未经活检确认的患者在复检时保持他升高的ebv，2年内无其它npc临床证据。因此，这产生最终总共3个假阳性刷拭结果。最初13名患者在刷拭时具有不明确的结果。5名(5/13)进行再次刷拭而这些患者中的4(4/5)名在再次刷拭时恢复正常。1名(1/5)在再次刷拭时仍不明确并且正受监测。8名(8/13)患者未进行再次刷拭并且失访。对578名患者进行的刷拭和测定产生98.9％的灵敏度和99.3％的特异性，阳性预测值为96.9％而阴性预测值为99.7％％(表1)。对于内窥镜检查，有131例，有某种形式的异常或疑似内窥镜检查结果，并且对101名患者进行活检。所有临床医生对于进行npc的诊断性内窥镜检查经验丰富。尽管如此，也有14个内窥镜检查假阳性，导致活检阴性，产生13.8％的假阳性率(14/101)。14个内窥镜检查假阳性(npc活检阴性受试者)全部没有使用刷拭方法检测的ebvdna。在组织学上发现有npc并且明显也有阳性刷拭的患者中也存在5个内窥镜检查假阴性。表2展示了鼻内窥镜检查的结果。肿瘤分期在67名组织学阳性npc患者中可用。发现刷拭确认了15个t1和31个t2病变。在表3中说明了比较鼻内窥镜检查和刷拭活检的结果。来自于内窥镜检查假阴性组的所有患者均具有阳性edl刷拭结果。表1：通过鼻内窥镜检查筛查产生14个假阳性结果和5个假阴性结果，产生94％的灵敏度和97.1％的特异性。表2：通过刷拭方法筛查产生3个假阳性结果和1个假阴性结果，产生98.9％的灵敏度和99.3％的特异性。表3：肿瘤分期在67名组织学阳性npc患者中可用。刷拭活检能够诊断早期疾病并且至少比得上鼻内窥镜检查。讨论鼻咽癌是在我国南方常见的头颈癌，我国南方是世界上人口最密集的地区之一并且是这种疾病的高危流行区(wei和sham)。由于是包括美国、加拿大和欧洲在内全世界的庞大中国移民人口，所以有大量全球高危人口(ferlay等，jia等，cao等)。因为解剖位置模糊并且缺乏早期体征或症状，所以大部分npc病例在晚期诊出，尽管在放射和化学疗法上有重大进步，仍预后不良且存活率低。不幸的是，可用于提供对这种疾病的大规模人口筛查的高度灵敏且有效的工具仍然极少。除鼻内窥镜检查外，ebv血清法和血浆ebvdna是当前可用的检测方法(lo等1999a，lo等1999b，lo等2000，tsang等，cheng等)。然而，90％以上的成年个体先前暴露于ebv感染，致使单独的血清法成为不良筛查试验(maeda等，savard等，gulley等，macsween等)。研究已经证实通过将血清法与血浆ebvdna检验相结合提高了灵敏度和特异性(teresa等，leung等)。然而，血浆法依赖于获得足够量的血浆ebvdna或其部分降解片段用于检测。dna极其不稳定，使得当存在多个医生采样部位，并且检验实验室地点遥远时，含dna的血浆样品的保存可能是挑战。而且，在检测早期或小的局部肿瘤中血浆方法的值仍未知(stevens等，le等，anker等)。理想的筛查和检测试验应为非侵入性，相对便宜；易于进行；具有较高的患者依从潜力；并且对疾病的大规模稳健检测高度灵敏且有特异性。使用前述参数作为指导，这项研究试图评价新开发的基于遗传的流动式npc检测系统并将其与内窥镜检查，当前npc检测的黄金标准方法做比较。从临床医生和耳鼻喉科医师的观点看，方便舒适地进入并且从np获得适足样品一直是一个挑战。先前公开的研究(tune等，adham等)已经描述了获得用于ebvdna分析的np组织的经鼻方法。然而这种方法可因在前鼻腔中的解剖阻塞如鼻中隔偏曲或鼻甲肥大而复杂化和受阻。患者的不适是广泛采用经鼻方法的主要障碍。此外，经由鼻腔覆盖np两侧的双侧刷拭增加的采用和患者依从性很少。用当前的经口方法，所述方法可以使用单个入口经由口腔进行以进入左侧和右侧罗森米勒窝(npc通常发生的区域)并采样。这在刷拭位置的几张内窥镜视图中得到清楚地展示和确认。在这项试验的早期，发现12份样品没有足够的dna用于分析。这种失败很可能归因于刷拭者缺乏经验和/或难以控制/限制患者作呕。似乎刷拭压力过度也不一定能获得足量的上皮样品，因为大多数患者并未从刷拭开始时记录过度作呕反应。在进一步刷拭训练之后，后续组的患者记录仅显示一例dna不足。总的来说，发现所述方法安全；易于接受和学习，并且可由非医生如护理从业者进行。直接进入np进行细胞ebvdna检测可以具有几大优点。正如使用电子显微镜术所证明的那样，在这项研究中通过刷拭获得的样品主要是完整新脱落的上皮层。因此，测量的ebvdna应反映实际上皮细胞内肿瘤dna载量，与测量从坏死细胞或通过凋亡释放的血浆ebvdna或其片段相反(mutirangura等，fournie等)。经口刷拭似乎取回的样品极其类似于来自于传统的直接活检方法的样品，正如两种方法之间几乎相同的ebvedl分布模式所证明那样。这种与即时dna保存配对的快速取样方法也可允许精确定量有微少降解或变化的细胞内ebvdna载量。当肿瘤ebvdna载量非常小并且在血浆中不可检测时，直接活检和进入原发肿瘤部位可能是检测早期疾病更好且更灵敏的方式。例如，坏死和细胞死亡可以忽略的早期、肿瘤前np病变可能在血液中没有足够的ebvdna，但通过表面刷拭活检仍可检测。临床npc检测的当前黄金标准是与疑似病变的活检相结合的鼻内窥镜检查。鼻内窥镜检查存在相当大的缺点。npc往往在粘膜下扩散并且除非与多次活检相结合，内窥镜检测遗漏一半以上早期病变(low等，sham等)。在这项研究中，无内窥镜检查异常的5名npc患者可通过刷拭方法检测。其中一名假阴性内窥镜检查患者，尽管np发现极少，但具有t3晚期转移性颈部疾病。此外，有许多常见病状如鼻出血及可以模拟隐匿性或早期npc的非特异性内窥镜np发现。内窥镜检查的技术依赖性和主观性结合对于谨慎的固有偏差可引起麻烦的患者焦虑和不必要的活检。在这项研究中，14％基于阳性内窥镜检查的活检并未导致对npc的最终诊断。在高病例载量的流行区，鼻内窥镜检查提出了另一挑战，因为内窥镜需要昂贵的清洁和高压灭菌，周转时间长，大大地减少了每天可以筛查的受试者的数量，更不必说另外的患者舒适度/由于经鼻过程的半侵入性质引起的焦虑。这项研究的结果确认了使用npscreentm检测npc，比得上且优于前述一些基于研究实验室的经鼻研究(tune等，tong等，adham等)以及公开的ebv血清法或血浆ebvdna结果(leung等，liu等2011，liu等2012，xang等，bortolin等，lin等)的高灵敏度(98.9％)和特异性(99.3％)。然而，当前这种方法提供了用于直接取回经ebv感染的上皮细胞的np的入口和取样的事实可能是优于用于早期检测的其它方法的显著优势。这种假设受几个刷拭阳性npc案例内窥镜检查为阴性的观察结果所支撑，很可能表示具有最小肿瘤体积的早期粘膜下疾病。刷拭也有助于鉴定有重大家族史，随后通过活检确认为有npc的无症状且内窥镜检查为阴性的患者。使用刷拭方法检测很大比例(46/67，69％)的t1和t2期npc。内窥镜检查阴性且活检阴性但是刷拭结果为阳性的患者之一在进行初次刷拭1年后发展为内窥镜检查和组织病理学阳性。这一发现表明刷拭方法在肿瘤在临床上显而易见之前可具有长达一年的前置时间。考虑到许多npc粘膜下扩散，为收获阳性肿瘤细胞的表面刷拭活检的总体高灵敏度仍然是一个谜。观察结果表明npc肿瘤细胞不一定保持与肿瘤邻近，而是随着要脱落的正常上皮一起迁移到鼻后np空间。如果正确，则这不但将解释在表面刷拭样品中npc检测的效率，而且还将表明npc肿瘤维持正常上皮细胞生理学的核心方面。在这项研究中，鉴定出两个假阳性刷拭结果。edl正好在不明确范围的外部界限的fp患者之一通过内窥镜检查在np中具有持续异常性淋巴样组织。虽然遗漏极小病变的活检的可能性仍很遥远，但是有经验的ent外科医生的多象限深层活检未能揭示任何组织学异常。可选地，该患者在np中可能具有持续性ebv感染或ebv隐匿性淋巴/上皮组织，促成假阴性结果。具有假阳性刷拭结果的另一名患者具有重大npc家族史并且在再次刷拭之后edl持续性升高。不能够完全排除两名患者均隐匿小的隐匿性或肿瘤前npc的可能性。在临床上未经定期内窥镜检查监测两名患者。在当前研究中，13名患者的edl值在不明确范围内。对于不明确edl的临床暗示，可能隐匿ebvdna的活性和持续性ebv感染的上皮组织促成阳性结果的来源。3个月后再次刷拭之后，4名患者恢复到正常刷拭结果，表明急性感染过程的消退可导致阳性刷拭结果的消退。具有持续性不明确edl的这1名患者可隐匿隐匿性癌或在刷拭区域具有持续性ebv感染的淋巴或上皮细胞。因此，有急性上呼吸道感染或相关症状的患者应避免刷拭，直至急性症状消退。其余8名患者的临床和edl状态不能确定，因为它们在2年的研究时间范围内失访。在正常临床情况下，或许具有不明确的edl的患者应经内窥镜检查监测并且定期再次刷拭。ebvdna阳性程度(ebv基因组拷贝当量数)与临床状态或治疗结果之间的生物学关系不完全清楚。在许多研究中已经证明预处理和放疗后的血浆ebvdna水平在预测治疗结果中有预后价值，包括复发和转移(lo等1999a，lin等，gulley等，lo等，chan等，leon等，usudel等，shao等，anker等)。考虑到刷拭方法直接进入np并且收获新鲜npc肿瘤细胞，所以这种方法可能是测定细胞内ebvdna实际载量的另一途径。总的来说，在香港和加拿大的几个流动诊所/实践地点通过采集鼻后np刷拭样品测试这种新的npc检测试剂盒的实用性中，研究证明新的经口刷拭方法提供了在临床上有用的dna用于检测组织携带的ebvdna。这种非侵入性手术耐受良好，并且经过培训的医生容易学习。与更昂贵、耗时的主观鼻咽镜检查相比，可在流动环境下快速地进行。这种系统基于高通量实时基因组定量pcr。总的来说，本研究验证经口刷拭方法为大量人口灵敏性和特异性的npc筛选的良好候选方案。需要对定期进行经口刷拭手术的受试者的预期、以人群为基础的研究以确定如果可以始终如一地检测出早期疾病并改变npc的人口统计和预后。实施例2：对npc的筛查测定下面描述的测定法提供了关于源自高危npc患者的后鼻咽的样本中ebvdna状态的信息。测定结果于参考标准做比较以确定患者当前的npc风险。测定概述：1)样本采集使用经口鼻咽刷采集样本。2)样本运送使用运送培养基固定样本并运送到实验室。3)dna释放和提取使用rochemagna核酸分离站和magna纯lcdna分离试剂盒从样本中分离总dna。4)dna定量使用dna结合性荧光染料(dsdna定量试剂盒、分子探针、p-7589)结合荧光测定法(fluoroskanascentfl、thermolabsystems、5210460)为总dna定量，然后将总dna标准化为10ng/μl浓度。5)实时pcr模板由50ng(＝5μl的～10ng/μl)总dna组成。检测ebna1和人rna酶p靶序列并使用引物和探针在abi7000sds平台上共同扩增。ebna1是在临床上相关的分析物，而rna酶p分析物用作定量扩增内部对照以及定量测定法对照。ebvdna参考材料用作定量外部对照。实时pcr循环阈值次数，ct(fam)(对于ebna1检测而言)和ct(vic)(对于rna酶p检测而言)为输出结果。6)实时pcr结果的验收(a)批特异性对照：如果对照表现不出所料并且在规定的上下限范围内，则接受实时pcr运行，否则拒收该批次。(b)样品特异性对照：当有效对照表现不出所料并且在规定的上下限范围内时，接受每位患者的每个试验结果，否则不报告该结果。7)npc风险评估(临床)ebna1检测结果，ct(fam)>31.50，与npc低临床风险相关联。样本采集：使用经口鼻咽刷从后鼻咽采集样品。采集后，将鼻咽样本固定在2ml装有500μl下述运输缓冲液的塑料旋盖管中。运输缓冲液：运输缓冲液是用于将核酸降解减到最少的高渗维持培养基。dna释放分离并标准化为10ng/μl浓度：在实验室使2ml运输管旋转60秒并吸取200μl悬浮液进行dna提取。使用magna核酸分离站和magna纯lcdna分离试剂盒，代码：03003990001(rochediagnostics,in)使总dna(dna)释放并从悬浮液中分离。使用dna结合性荧光染料(dsdna定量试剂盒、分子探针、p-7589)结合荧光测定法(fluoroskanascentfl、thermolabsystems、5210460)为dna分离物定量，然后使用分子级水将dna标准化为10ng/μl浓度。对于实时pcr分析而言使用两份5μl等分试样，因此必须有至少115ng的dna(＝2～5μl～10ng/μl+15％尖端残余损失等)可用于试验，否则重复dna提取过程或，在来自于天然样本的可提取dna不足的情况下，患者必须经再次刷拭。引物/探针靶标：在pcr反应期间检测并共同扩增位于ebvebna1基因和人rna酶p基因中的靶序列。对于患者样品而言，ebna1是在临床上相关的分析物，而rna酶p用作定量内部对照以及定量测定法对照。ebv引物/探针：由从基因库下载的原型ebvb95.8基因组序列(登录号v01555，长度＝172,281bp)开发实时pcr引物和探针(引物和探针)。引物扩增位于ebna1基因内的75bp(空位＝0/75)片段，核苷酸编号109,559至109,633。探针是序列特异性双重荧光团标记的dna寡核苷酸偶联物(荧光探针)。一个荧光团称为报告因子(5’-末端)而另一个是猝灭因子(3’-末端)。探针(长度＝20bp)对位于正向和反向引物之间的区域有特异性。与ebna1探针缔合的报告因子和猝灭因子荧光团分别为fam和tamra。引物和探针由appliedbiosystems,fostercity,ca合成并且在使用之前经内部验证。ebv扩增子(b95.8基因组核苷酸：109,559至109,633)：gtcgtctcccctttggaatggcccctggacccggcccacaacctggcccgctaaggagtccattgtctgttatt[seqidno:3](对应于以下所列引物的序列加有下划线)正向引物：5-gtcgtctcccctttggaatg-3'[seqidno:1]反向引物：5’-aataacagacaatggactcccttagc-3’[seqidno:2]探针：5'-(fam)cctggacccggcccacaacc(tamra)-3'[seqidno:4]rna酶p引物/探针：每个单倍体基因组呈单拷贝存在的人rna酶p基因的实时pcr引物和探针用作定量扩增内部对照以及定量方法对照。rna酶p检测试剂盒4316831(rnp)(appliedbiosystems,fostercity,ca)用于扩增并检测rna酶p基因靶序列。与rna酶p基因探针缔合的报告因子和猝灭因子荧光团分别为vic和tamra。实时pcr技术：实时pcr化学方法在abi7000sds平台(appliedbiosystems,fostercity,ca)上进行。在pcr期间正向和反向引物限定扩增子的端点并且为测定提供一级的分析特异性。在pcr反应的退火/延伸阶段，与正向和反向引物之间的特异性互补区域杂交的荧光探针提供二级的分析特异性。荧光探针在5’-末端标记有报告因子荧光团而在3’-末端标记有猝灭因子荧光团并且只要报告因子和猝灭因子荧光团保持紧密靠近，则报告因子的发射光谱猝灭。在实时pcr期间，如果存在靶标扩增子，则探针与扩增子杂交并且在taq聚合酶的5’-核酸外切酶活性期间探针分裂开，释放报告因子以发射可测量的荧光信号。pcr循环期间记录荧光信号并且与反应中扩增到该点的扩增子产物的量成比例。起始模板中存在的靶序列越多，荧光团增长到通过仪器检测到信号的时间点所需的pcr循环越少。将首次记录荧光信号在统计上显著高于本底的循环数定义为阈值循环数，ct，并且是为测定报告的结果。可共同扩增几个核酸靶标并且通过其报告因子荧光团的独特发射区分其各自的ct值，即靶向ebna1基因的探针的ct(fam)和靶向rna酶p基因的探针的ct(vic)。如图6所示，在实时pcr中存在4个主要阶段：线性基态期、早期对数期、对数-线性期和平台期。线性基态期期间，ct<15，pcr刚刚开始，并且每次循环的荧光发射不高于本底。在早期对数期，荧光的量达到其显著高于本底水平的阈值。交点或这出现时的循环数为ct。起始模板中存在的靶序列越多，荧光强度超过阈值所需的pcr循环越少。如图7所示，对于源自正常患者的样品中的ct(fam)检测的ct(fam)以fam-a5＝36.031和fam-a6＝35.206为代表，而对于源自npc阳性患者的样品的值以ct(fam)值为代表；fam-a7＝21.418，fam-a8＝21.416和fam-a9＝22.683。该测定法的pcr设置和运行说明：表4中详述了pcr反应设置并且在表5和表6中详述了扩增条件。在每个反应中包括尿嘧啶n糖基化酶以防污染。为检查污染，每次运行包括两个非目标对照(ntc)，其中用无核酸酶的h2o代替模板。各自来自于9.3fg(＝5μlx1.85fg/μl)和92.5fg(5μlx18.50fg/μl)两个浓度的ebvdna参考材料的3个重复样品用作定量外部对照。人rna酶p基因(每个单倍体基因组呈单拷贝存在)用作定量内部对照以监测对pcr反应的抑制并且因为定量已知，即大约15,000个拷贝(50ng/3.30pg)，所以也用作方法对照。表4.实时pcr设置。表5.热循环条件(abisds)表6.基线设置(abisds)检测器fam(ebv)vic(rnp)基线阈值0.050.25基线起点(循环)11基线终点(循环)151596孔板样品绘图：对于最多44份样品：吸取5μl的样品浓缩液到孔a2至d7(包括f01至f44)，然后吸取两份5μl的样品浓缩液到孔e7至h12(包括s01至s44)并且记录两份样品之间的关联，即fn，n＝1,2,3...44，与sn，n＝1,2,3...44相关联。详情参见下面的表7。对于无模板对照(ntc)而言吸取5μl的ddh2o到孔g1和h1中。在孔a1、b1和c1中吸取3份重复的5μl的10个拷贝/μl的ebvdna对照。在孔d1、e1和f1中吸取3份重复的5μl的100个拷贝/μl的ebvdna对照。表7.对于96孔光反应板的样品绘图质量控制：该测定法旨在提供关于从采集自后鼻咽的样本分离的dna样品中的ebv状态的信息。这通过荧光探针和ebv基因组靶标之间的杂交及后续产生通过abi序列检测系统检测的可识别信号而实现。np测定法的分析灵敏度取决于杂交过程和信号检测系统的组合效率。该测定法并入一系列定量对照以验证构成分析过程的组合要素如预期的那样起作用并且在规定的上下限内，表8和表9。对于试验的每份样品，测定对照结果必须在规定极限内，否则不接受该结果。表8.用于验证测定结果的对照总结表9.样品流量和对照定量外部对照：定量外部对照用于验证pcr主要混合物和试剂制备正确以引起靶dna序列的扩增并且监测ebv污染。对于该测定法而言这些对照由3份重复的9.25fg(50个拷贝)和3份重复的92.50fg(500个拷贝)的表征清楚的ebvdna参考材料组成，其与患者样品并行但是在外部运行。通过比较原始实时pcr输出值ct(fam)估计回收率，达到验收标准，对于92.50fg量而言26.40≤ct(fam)≤28.60并且对于9.25的量而言29.96≤ct(fam)≤32.96，(表11)。频率：每张96孔反应板6个。定量内部对照(rna酶p)：定量内部对照用于验证在dna分离和纯化过程中可能已经携带的干扰物质不抑制或增强pcr。np测定起始模板经定量(50ng总dna)并且原则上由人dna(>99.995％)组成，因此通过比较与每个单倍体基因组呈单拷贝存在的人rna酶p基因的检测相关的输出值ct(vic)可以评估受抑制的反应(或受增强的反应)，达到验收标准，23.00≤ct(vic)≤28.00(表12)。阈值ct(vic)＞28.00，可指示pcr受抑制。频率：为试验的每份样品内源性。定量方法对照(rna酶)：定量方法对照用于验证所述方法正确进行。人dna是该过程的所有分析前和分析阶段期间存在的方法。dna分离期间将总dna标准化为10ng/μl浓度并且试验50ng(＝5μl×10ng/μl)。测定起始模板原则上由人dna(>99.995％)组成并且通过比较与人rna酶p基因的检测相关的原始、实时pcr输出值ct(vic)估计回收率，达到验收标准，23.00≤ct(vic)≤28.00(表12)。落在预期参考范围内的阈值ct(vic)验证了所述方法。频率：为试验的每份样品内源性。无模板对照-(外部水空白)：设计方法空白或无模板对照(ntc)以检查样品处理和pcr分析从头到尾的污染。在pcr设置期间除分子级无菌水代替dna模板外，使用与试样相同的样品试剂制备、送样和pcr程序引入无模板对照。如果无反应性，则接受ntc结果，表11。频率：外源性，每张96孔反应板两个。测定标准化-公认参考标准(ars)：使用市场上可买到的爱波斯坦-巴尔病毒b95.8定量病毒dna对照，产品目录号08-926-000(advancedbiotechnologies,inc.md21046)，为该项测定建立公认参考标准(ars)(ct真值)。表10.该项测定的公认参考标准方差预算板特异性对照：实时pcr运行的验收：在接受实时pcr运行之前必须满足两个标准。ebvdna对照用作定量外部对照以验证反应试剂盒仪器系统如同预期那样作用。3份9.25fgebvdna重复样品和3份92.50fgebvdna重复样品与临床样品并行运行。如果定量外部对照的每个ct值都在表11提供的上下限内，则接受实时pcr运行。一个或两个对照的失败可表明引物或探针降解、对照降解、技术人员出错、系统问题或污染。由分子级水代替模板组成的两个无模板对照(ntc)在pcr设置期间未向反应引入污染性靶核酸。如果ntcct结果表明未反应，则接受实时pcr运行，表11。表11.板特异性对照样品特异性对照：单项试验结果的验收：试样中的显性dna分离物是人dna(>99.995％)。每个人类基因组呈单拷贝存在的人rna酶p基因的pcr检测和扩增用作定量内部对照。rna酶p基因是从样本采集到最终pcr存在的方法并且用于证实单项试验结果。临床研究确定在50ng人dna试验质量中rna酶p靶序列的ct真值对应于ct(vic)＝25.50±2.50，并且如果定量内部对照的ct(vic)值在这些预期界限内，则接受单项试验结果。越高的ct值可指示反应受抑制或失败、dna提取阶段的误差、荧光测量和标准化误差、移液误差、受损试剂或系统问题。越低的ct(vic)值可指示荧光测量和标准化误差、移液误差、受损试剂或系统问题。试验患者样品，一式两份。可由移液误差或经过热循环仪加热块的差示热分布或其它可指定过程或设备误差引起重复试验之间大的变化。可通过监测重复试验之间的差异限制来自这些误差的影响。基于临床研究，重复试验之间的最大容许差异：△ct(fam)<3和△ct(vic)<3。表12.样品特异性对照期望值：试验患者样品，一式两份并且报告附属ct(fam)结果。如表13所示，31.50<ct(fam)≤40.00或edl<1.7的测定结果指示ev相关的npc的低可能性。28.00≤ct(fam)≤31.50或edl≥1.7和edl≤2.6的测定结果在指示患者可能处于高于正常的发展npc的风险的不明确结果中。ct(fam)<28.00或edl>2.6的测定结果指示ebv相关的npc的高可能性。表13.分析结果的临床意义(ct(fam)和edl)灵敏度和特异性：在表14中呈现了对于该项测定在截止值ct＝31.50时，对应于临床诊断的临床表现。具有‘初始’假阳性结果(fp)的患者的‘最终’临床状态；3名患者(3/10)最终在临床上呈现(对于npc而言)，6名患者(6/10)复检时为阴性并且因此恢复正常(tn)并且1名患者(1/10)复检时保持其假阳性状态，无npc的临床证据。表14.在截止值ct＝31.50时的初始和最终测定表现；在截止值ct＝31.50时的初始和最终测定表现。tp＝真阳性，fn＝假阴性，tn＝真阴性，fp＝假阳性表15用于np筛查的换算表[edl＝log(ebv拷贝数)]表16.序列表seqidno：1∶5′-gtcgtctcccctttggaatg-3′seqidno：2∶5′-aataacagacaatggactcccttagc-3′seqidno：3∶gtcgtctcccctttggaatggcccctggacccggcccacaacctggcccgctaaggagtccattgtctgttattseqidno：4∶5′-cctggacccggcccacaacc-3′参考文献1.unga,chencj,levineph,etal.familialandsporadiccasesofnasopharyngealcarcinomaintaiwan.anticancerres1999；19∶661-665.2.pathmanathanr,prasadu,sadlerr,flynnk,raab-traubn.clonalproliferationsofcellsinfectedwithepstein-barrvirusinpreinvasivelesionsrelatedtonasopharyngealcarcinoma.nengljmed1995；333∶693-698.3.skinnerdw，vanhc.nasopharyngealcarcinoma：methodsofpresentation.earnosethroatj1990；69∶237-240.4.hos,teop,kwanwh,choip,tjongj,johnsonpj.stagingandigavcatitreinpatientswithnasopharyngealcarcinoma：changesovera12-yearperiod.oraloncol1998；34∶491-495.5.liumt,yehcy.prognosticvalueofanti-epstein-barrvirusantibodiesinnasopharyngealcarcinoma(npc).radiatmed1998；16∶113-117.6.zengy,pigh,dengh,etal.epstein-barrvirusseroepidemiologyinchina.aidsres1986；2suppl1∶s7-15.7.feinmesserr,miyazakii,cheungr,freemanjl,noyekam,doschh-m.diagnosisofnasopharyngealcarcinomabydnaamplificationoftissueobtainedbyfine-needleaspiration.nengljmed1992；326∶17-21.8.tunece,liavaagpg,freemanjl,etal.nasopharyngealbrushbiopsiesanddetectionofnasopharyngealcancerinahigh-riskpopulation.jnatlcancerinst1999；91∶796-80.9.shimm.enablinglarge-scalepharmacogeneticstudiesbyhigh-throughputmutationdetectionandgenotypingtechnologies.clinchem2001；47∶164-172.10.hardinja,sherrdh,demariam,lopezpa.asimplefluorescencemethodforsurfaceantigenphenotypingoflymphocytesundergoingdnafragmentation.jimmunolmethods1992；154∶99-107.11.zweigmh,campbellg.receiver-operatingcharacteristic(roc)plots：afundamentalevaluationtoolinclinicalmedicine.clinchem1993；39∶561-577.12.lowwk,leongjl,gohyh，fongkw.diagnosticvalueofepstein-barrviral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