一种早期快速诊断鸡白痢沙门氏菌的试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种早期快速诊断鸡白痢沙门氏菌的试剂盒。

背景技术：

鸡白痢沙门氏菌病是由鸡白痢沙门氏菌(salmonellapullorum)引起鸡的一种急性、败血性传染病，具有高度的适应性或专嗜性，多侵害0～3周龄内的雏鸡，多呈慢性或隐性感染，临床表现为不食、下痢以及器官的坏死性结节等症状，造成雏鸡急性全身性疾病和高死亡率，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。目前在许多发展中国家,鸡白痢沙门氏菌病仍是威胁养禽业的主要细菌传染病之一。此外鸡白痢沙门氏菌病的防治主要采用抗生素治疗，抗生素使用过量会导致抗药性的产生，早期快速无损伤的检测方法也是抗生素滥用转为针对病鸡精准用药的关键。

目前关于鸡白痢沙门氏菌病的检测方法主要有平板凝集试验、elisa、pcr和免疫荧光等，但这些检测方法存在操作复杂、耗时长和局限性较大等缺点。平板凝集试验是检测鸡白痢沙门氏菌最经典的血清学方法，但常出现漏检问题，需要多次重复才能确诊；elisa检测方法需要借助酶标仪才能读取结果，假阳性较高；而pcr技术和免疫荧光诊断方法往往对试验人员要求较高，且需要借助于昂贵的仪器设备才能完成试验操作，不适合在一些基层单位进行推广和应用。因此，迫切需要操作简便、可靠和现场可操作的鸡白痢沙门氏菌病的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种早期快速诊断鸡白痢沙门氏菌的试剂盒。

第一方面，本发明保护试剂盒；包括试纸条、特异引物对和金标探针；

所述试纸条包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被有链霉亲和素；所述质控区包被有质控探针；

所述特异引物对由引物f和引物r组成；

所述引物f如seqidno.1所示；所述引物r如seqidno.2所示；

所述引物f采用生物素修饰；所述引物r由区段a和区段b组成；所述区段a和区段b中间采用3个亚甲基修饰；

所述金标探针部分区段可与所述引物r的区段a互补配对，且该区段也可与质控探针互补配对；所述金标探针连接有纳米金；

所述质控探针采用生物素修饰；

所述试剂盒的用途为如下(1)或(2)或(3)：

(1)鉴定待测病原菌是否为鸡白痢沙门氏菌；

(2)检测待测样本中是否含有鸡白痢沙门氏菌；

(3)诊断或辅助诊断鸡白痢沙门氏菌病。

所述引物f的5’端采用生物素修饰；

所述质控探针的5’端采用生物素修饰。

所述区段a如seqidno.2自5’端第1-19位所示；

所述区段b如seqidno.2自5’端第20-49位所示。

所述金标探针如seqidno.3所示；所述质控探针如seqidno.4所示。

所述金标探针3'端连接c6-hs-sh，巯基中s可与纳米金连接。所述纳米金粒径为20-30nm。所述纳米金可通过常规柠檬酸盐还原法制备。所述连接有纳米金的金标探针制备方法具体如下：将纳米金与金标探针在避光条件下室温放置反应(反应时间具体可为16h)，然后加入pb缓冲液，再加入nacl水溶液，避光条件下室温放置反应(反应时间具体可为8h)，即得所述金标探针。得到所述金标探针的后处理步骤如下：离心，除上清；再用所述nacl水溶液和所述pb缓冲液重悬沉淀，备用。所述胶体金与所述金标探针的体积比具体可为25:1。所述pb缓冲液的浓度具体可为10mm。所述nacl水溶液的浓度具体可为0.3m。

所述检测区是将为4mg/ml～10mg/ml的链霉亲和素包被于反应膜上形成的；

所述质控区是将1mg/ml的链霉亲和素与100μm的质控探针室温下反应1～3小时然后包被于反应膜上形成的。

所述检测区更具体是将为5mg/ml的链霉亲和素包被于反应膜上形成的。

所述质控区更具体是将1mg/ml的链霉亲和素与100μm的质控探针室温下反应2小时然后包被于反应膜上形成的。

所述试剂盒中还可包括展开液。所述展开液具体可为tebuffer。

第二方面，本发明保护鉴定待测病原菌是否为鸡白痢沙门氏菌的方法，包括如下步骤：(1)提取待测病原菌的基因组dna；以所述基因组dna为模板，采用前文中所述的特异引物对进行raa反应；(2)将步骤(1)得到的反应产物、前文任一所述的金标探针和展开液混匀后加至前文任一所述的试纸条的样品吸收垫中；根据试纸条显色结果进行判断，如果质控区显色且检测区显色，则待测病原菌为鸡白痢沙门氏菌；如果质控区显色且检测区不显色，则待测病原菌不为鸡白痢沙门氏菌；若质控区不显色，则检测结果无效。

第三方面，本发明保护检测待测样本中是否含有鸡白痢沙门氏菌的方法，包括如下步骤：(1)提取待测样本的基因组dna；以所述基因组dna为模板，采用前文中所述的特异引物对进行raa反应；(2)将步骤(1)得到的反应产物、前文任一所述的金标探针和展开液混匀后加至前文任一所述的试纸条的样品吸收垫中；根据试纸条显色结果进行判断，如果质控区显色且检测区显色，则待测样本中含有鸡白痢沙门氏菌；如果质控区显色且检测区不显色，则待测样本中不含有鸡白痢沙门氏菌；若质控区不显色，则检测结果无效。

在第二方面和第三方面所述的方法中，所述展开液具体可为tebuffer。

所述步骤(1)中提取待测病原菌或待测样本的基因组dna前，可视情况进行增菌(增菌目的为使提取的基因组dna含量高于本方法检测限)；所述增菌方法为将待测病原菌或待测样本接种于四硫磺酸钠煌绿增菌液(ttb)内，37℃培养。

所述raa反应的反应体系具体可为：41.5μl的反应缓冲液、2μl的引物seep-f与2μl的引物seep-r、2μl的模板、2.5μl的bufferb。所述引物seep-f和引物seep-r均以引物溶液的形式加至反应体系，引物在引物溶液中的浓度为10μm。

所述raa反应的反应程序具体可为：37℃反应20min。

在所述步骤(1)后，可添加将反应产物进行纯化的步骤。

所述步骤(2)中，所述金标探针以溶液形式存在，溶液中的金标探针浓度为100μm。

所述步骤(2)中，将步骤(1)得到的反应产物、前文任一所述的金标探针和展开液混匀后加至前文任一所述的试纸条的样品吸收垫中后，室温(25℃)等待2-3min后进行结果判读。

第四方面，本发明保护前文所述的特异引物对。

第五方面，本发明保护引物探针组合，包括前文所述的特异引物对、金标探针和质控探针。

第六方面，本发明保护前文所述的特异引物对或引物探针组合在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(1)或(2)或(3)：

(1)鉴定待测病原菌是否为鸡白痢沙门氏菌；

(2)检测待测样本中是否含有鸡白痢沙门氏菌；

(3)诊断或辅助诊断鸡白痢沙门氏菌病。

以上任一所述病原菌具体可为鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、李斯特菌或金黄色葡萄球菌。

以上任一所述待测样本具体可为鸡粪便样本或鸡肛门拭子。

本发明提供了一种早期快速诊断鸡白痢沙门氏菌的试剂盒，并提供了鸡白痢沙门氏菌的快速检测方法，本发明具有以下优点：本发明的产品为基于重组酶介导链替换核酸扩增(raa)技术的检测鸡白痢沙门氏菌试纸条产品，与普通pcr相比，该方法操作简单快速，仅需水浴锅即可完成反应，反应时间仅为20min，结果可用裸眼进行判读，时间不超过3min，灵敏度及准确度高且成本较低。本发明提供的试剂盒具有操作简便，抗干扰能力强，灵敏度高，特异性强等优点，还可以实现现场无损伤检测，无论是家禽养殖场，还是禽产品加工厂，都可以现场及时检测鸡白痢沙门氏菌感染情况，将对公共健康的危害降到最低。本发明对于早期快速诊断鸡白痢沙门氏菌有重要意义。

附图说明

图1为本发明试剂盒检测原理。

图2为本发明试剂盒特异性实验的检测结果，从左至右依次为鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌。

图3为本发明试剂盒灵敏度实验的检测结果，从左至右分依次为浓度为10、1、10^-1、5×10^-2、10^-2、5×10^-3、10^-3、5×10^-4ng/μl的鸡白痢沙门氏菌核酸提取液的检测结果。

图4为实际样本raa检测结果，从左至右依次为10份样品的检测结果和阴性对照(ddh2o)检测结果。

图5为实际样本本发明方法检测结果，从左至右分依次为8份样本的检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、引物探针的设计、筛选和制备

进行大量序列分析、比对获得了用于快速检测鸡白痢沙门氏菌的若干引物和探针。将各个引物、探针进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到一套用于快速检测鸡白痢沙门氏菌的引物探针组合，具体信息如表1所示。其余引物特异性很差，不满足检测要求。

表1引物探针信息

注：表1中，正向引物seep-f的5'端修饰有生物素(biotin表示)；反向引物seep-r包括两区段，两区段中间修饰3个亚甲基(ispc3)；金标探针5'端起部分序列(下划线标注)与反向引物的尾部区段(下划线标注)互补配对，金标探针的3'端连接c6-hs-sh(自5’-3端依次为探针-c6-hs-sh)，巯基中s可与纳米金连接；质控探针5'端起部分序列(下划线标注)与反向引物的尾部区段(下划线标注)相同，与金标探针5'端起部分序列(下划线标注)互补配对，质控探针的5'端修饰有生物素(biotin表示)。

表1中，引物seep-f和引物seep-r可实现对鸡白痢沙门氏菌的有效扩增，扩增产物大小为249bp，可单独使用引物seep-f和引物seep-r对模板进行常规pcr扩增或者raa扩增，如果扩增产物中含有249bp的片段，可以判断模板中含有鸡白痢沙门氏菌的核酸。为了使鸡白痢沙门氏菌的检测更加快速准确，特设计下述检测方法及其配套试剂盒。

实施例2、快速检测鸡白痢沙门氏菌的试剂盒的制备

快速检测鸡白痢沙门氏菌的试剂盒包括试纸条、正向引物seep-f和反向引物seep-r和金标探针溶液。

一、试纸条的制备

试纸条是将样品垫(上海杰一生物技术有限公司，gl-b04)，包被检测区和质控区的反应膜(德国赛多利斯(sartorius)集团，nc膜-sartoriuscn140型号)，吸水垫(上海捷宁生物技术有限公司，h5076)依次按照顺序黏贴在底板(上海捷宁生物技术有限公司，底板j-b6)上得到的。

包被检测区和质控区的反应膜的制备方式如下：将链霉亲和素(购自北京百诺威生物科技有限公司)按照浓度5mg/ml修饰在反应膜上形成检测区；将1mg/ml的链霉亲和素与100μm的质控探针(表1)在室温(25℃)下反应两个小时后，在反应膜上做为质控区，得到包被检测区与质控区的反应膜。

二、金标探针溶液的制备

将500μl纳米金(20-30nm，采用常规柠檬酸盐还原法制备)与20μl(100μm)表1中的金标探针在避光条件下室温(25℃)放置16h，然后加入10mm的pb缓冲液(购自北京百诺威生物科技有限公司)56μl，加入2m的nacl溶液使其终浓度至0.3m，避光条件下室温(25℃)放置8h，然后4℃、16100×g离心30min，弃上清，将沉淀重悬于0.3mnacl、10mmpb缓冲液中置于4℃备用。

三、试剂盒的使用方法

试剂盒的检测原理见图1。采用一对特异引物(正向引物seep-f和反向引物seep-r)对待测样本的基因组dna进行扩增，其中，正向引物5'端修饰有生物素、反向引物5'端一段碱基可与金标探针互补配对。将扩增产物与金标探针结合后滴加在试纸条上，混合液通过毛细管作用向前流动。当有目标扩增产物存在时，目标扩增产物一端可与金标探针结合，接着液相继续向前流动到达检测区，固定在检测区的链霉亲和素将一端修饰有生物素的扩增产物捕获，即被扩增产物一端结合的胶体金都停留在检测线处，产生红色的条带。多余的胶体金继续层析，与质控区上的质控探针序列互补配对，使质控线产生红色的条带。当目标扩增产物不存在时，胶体金无法停留在检测区，而与质控区上的质控探针序列互补配对，质控区还是产生红色的条带。

检测方法如下：

1、取待测样本，适当增菌，然后按照细菌全基因组核酸提取试剂盒(takara公司)说明书进行提取基因组dna。此处增菌目的为使提取的基因组dna含量高于本方法检测限，增菌方法为将样本接种于四硫磺酸钠煌绿增菌液(ttb)内，37℃培养。

2、以步骤1提取的基因组dna为模板，采用raa基础型核酸扩增试剂盒(购自杭州众测生物科技有限公司)进行raa扩增。

raa反应体系：41.5μl的反应缓冲液、2μl的正向引物seep-f与2μl的反向引物seep-r、2μl的模板、2.5μl的bufferb。正向引物、反向引物均以引物溶液的形式加至反应体系，引物在引物溶液中的浓度为10μm。

raa反应程序：37℃反应20min。

3、目的片段纯化(可选)

使用纯化试剂盒对步骤2得到的扩增产物进行纯化。

4、取4μl步骤2得到的扩增产物或步骤3得到的纯化产物，与10μl的步骤二制备的金标探针溶液(探针溶液中的探针浓度为100μm)和50μl展开液(tebuffer)混匀后递交至步骤一制备的试纸条的样品吸收垫中，室温(25℃)等待2-3min后进行结果判读，如果质控区显色且检测区显色，结果为阳性；如果质控区显色且检测区不显色，结果为阴性；若质控区不显色，则试纸条无效。

实施例2、特异性

待测菌：鸡白痢沙门氏菌(atcc19945)、肠炎沙门氏菌(bncc103134)、鼠伤寒沙门氏菌(bncc103281)、单增李斯特氏菌(bncc185988)、大肠埃希氏菌(bncc336435)、金黄色葡萄球菌(bncc186335)。

1、提取待测菌的基因组dna。

2、以基因组dna为模板，采用raa基础型核酸扩增试剂盒(购自杭州众测生物科技有限公司)进行raa扩增。

raa反应体系：41.5μl的反应缓冲液、2μl的正向引物seep-f与2μl的反向引物seep-r、2μl的模板、2.5μl的bufferb。正向引物、反向引物均以引物溶液的形式加至反应体系，引物在引物溶液中的浓度为10μm。

raa反应程序：37℃反应20min。

3、取4μl步骤2得到的扩增产物，与10μl的步骤二制备的金标探针溶液和50μl展开液(tebuffer)混匀后递交至步骤一制备的试纸条的样品吸收垫中，室温(25℃)等待2-3min后进行结果判读，如果质控区显色且检测区显色，结果为阳性；如果质控区显色且检测区不显色，结果为阴性；若质控区不显色，则试纸条无效。

结果如图2所示。结果显示，仅鸡白痢沙门氏菌检测区显色，肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌测试线均未显色，证明本方法特异性好。

实施例3、灵敏度

提取鸡白痢沙门氏菌的基因组dna，将其稀释为浓度为10、1、10^-1、5×10^-2、10^-2、5×10^-3、10^-3、5×10^-4ng/μl共8个浓度，以稀释后不同浓度的dna溶液为模板，按照实施例2中相同的方法进行结果。

结果如图3所示。结果显示，本发明最低检测限为5×10^-3ng/μl，具有较广的检测范围。

实施例4、实际样本检测

待测样本：10份从养鸡场采集的鸡白痢沙门氏菌病鸡的肛门拭子。

一、本发明的方法检测

1、取待测样本，增菌8小时后，按照细菌全基因组核酸提取试剂盒(takara公司)说明书进行提取基因组dna。

2、以步骤1提取的基因组dna为模板，采用raa基础型核酸扩增试剂盒(购自杭州众测生物科技有限公司)进行raa扩增。

raa反应体系：41.5μl的反应缓冲液、2μl的正向引物seep-f与2μl的反向引物seep-r、2μl的模板、2.5μl的bufferb。正向引物、反向引物均以引物溶液的形式加至反应体系，引物在引物溶液中的浓度为10μm。

raa反应程序：37℃反应20min。

3、取4μl步骤2得到的扩增产物或步骤3得到的纯化产物，与10μl的步骤二制备的金标探针溶液和50μl展开液(tebuffer)混匀后递交至步骤一制备的试纸条的样品吸收垫中，室温(25℃)等待2-3min后进行结果判读，如果质控区显色且检测区显色，结果为阳性；如果质控区显色且检测区不显色，结果为阴性；若质控区不显色，则试纸条无效。

检测结果如图5和表2中的第六列所示。

二、raa检测

1、取待测样本，增菌8小时后，按照细菌全基因组核酸提取试剂盒(takara公司)说明书进行提取基因组dna。

2、以步骤1提取的基因组dna为模板，采用raa基础型核酸扩增试剂盒(购自杭州众测生物科技有限公司)进行raa扩增。

raa反应体系：41.5μl的反应缓冲液、2μl的正向引物seep-f与2μl的反向引物seep-r、2μl的模板、2.5μl的bufferb。正向引物、反向引物均以引物溶液的形式加至反应体系，引物在引物溶液中的浓度为10μm。

raa反应程序：37℃反应20min。

3、取扩增产物进行电泳检测。如果扩增产物中含有约为249bp的片段，可以判断模板中含有鸡白痢沙门氏菌的核酸。

检测结果如图4和表2中的第三列所示。

三、血清型和传统生化反应检测

参照gbt17999.8-2008方法进行待测样本的血清型检测和生化反应(卫矛醇发酵和鸟氨酸脱羧酶反应)检测。

结果如表2中的第二列、第四列和第五列所示。

表2养鸡场分离的鸡白痢沙门氏菌生化反应结果

上述结果表明，本发明的方法可以检测实际样本中的鸡白痢沙门氏菌。

序列表

<110>中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所

<120>一种早期快速诊断鸡白痢沙门氏菌的试剂盒

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgtacaataagggattatgttaaaccacg29

<210>2

<211>49

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ttggtcgtggtggtggttttgttaattcagagtaaagaccagttaacac49

<210>3

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aaaccaccaccacgaccaattttttttttttttt34

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ttggtcgtggtggtggttt19