一种焦磷酸酶活性检测方法与流程

本发明属于生物化学分析领域，具体涉及一种焦磷酸酶活性检测方法。

背景技术：

焦磷酸酶（pyrophosphatase,ppase)[ec3.6.1.1.]是作用于双磷酸键上的酸酐水解酶，催化水解一分子焦磷酸盐转化为两分子磷酸盐离子。焦磷酸水解是个高的放能反应，所以酶水解过程可以释放能量驱动一些反应完成。

焦磷酸酶活性的准确测定在生物学中的应用扮演着十分重要的作用，例如产酶菌株的筛选、改造以及疾病的诊断方面。目前酶活检测普遍采用的方法有：酶催化法、荧光法以及比色法等。这些方法的基本原理都是以焦磷酸作为底物，通过测定酶水解底物后产物的增加量或底物的减少量来度量酶活大小。

酶催化法是用荧光素酶的自身荧光来达到酶活的检测，例如jonaseriksson等人利用焦磷酸钠能抑制荧光素酶活性，而它又能被焦磷酸酶水解，从而恢复荧光素酶的荧光，最终达到焦磷酸酶活的检测的目的(analyticalbiochemistry,2001,293(1):67-70.)。荧光法是在目标底物上键合荧光基团，当焦磷酸酶催化水解底物时，其荧光信号会随酶催化反应而发生改变。目前mao等用了一种新的比色法检测焦磷酸酶利用铜离子与焦磷酸钠的结合能力强于与半胱氨酸的结合能力来调节纳米金聚集/分散，然后焦磷酸酶催化水解焦磷酸，纳米金恢复聚集，通过纳米金颜色的改变，实现实时检测焦磷酸酶的活性(analyticalchemistry,2013,85(19):9409-15.)。现有的方法还有酶联免疫吸附测定（elisa）、滴定法。这些方法虽各有长处，但还有各种局限性没有成为主流的方法，例如：灵敏度不高，误差大；特异性不强；费时费力，不适合酶的高通量检测。

中国专利cn104237193a公开了一种检测焦磷酸酶的荧光传感器及其制备方法，该方法在检测焦磷酸酶活性时，需要制备叠氮香豆素，制备过程需要加入高能叠氮化物，具有一定的危险性。中国专利cn108051418a公开了一种新型无机焦磷酸酶活性检测方法，该方法在制备二维金属有机骨架材料cu-bdc-mof纳米片时，过程耗时（不包括其它步骤，仅反应就需要24-48小时）且需要n，n-二甲基甲酰胺和乙腈等有机溶剂，对环境会造成一定的危害。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种焦磷酸酶活性检测方法。此方法首次发现焦磷酸盐能够在溶液中稳定硫化镉量子点，将这一现象和焦磷酸酶活性检测相结合。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

(1)采用焦磷酸盐作为焦磷酸酶的底物，缓冲溶液调节底物溶液的ph值；

(2)焦磷酸酶反应动力学曲线：向步骤(1)中调节好ph的反应液中加入不同活性浓度的焦磷酸酶溶液、混匀，恒温水浴加热不同的时间，然后依次向其中加入一定体积的可溶性硫盐和可溶性镉盐溶液、混匀，用荧光分光光度计测定反应体系的荧光强度，以荧光强度变化的绝对值的大小△|f470|作为纵坐标，反应时间作为横坐标，绘制焦磷酸酶反应动力学曲线。

(3)焦磷酸酶活性检测标准曲线：将步骤(1)中调节好ph的反应液分别加入到不同活性浓度的焦磷酸酶溶液，在适宜的温度和ph条件下分别反应相同的时间后，然后向其中依次加入可溶性硫盐和可溶性镉盐溶液、混匀，测定反应体系的荧光强度；以荧光强度变化的绝对值的大小△|f470|为纵坐标，焦磷酸酶活性浓度作为横坐标，绘制焦磷酸酶标准曲线。

本发明所述的焦磷酸酶活性检测方法，步骤(1)所述的缓冲液为tris-hcl缓冲溶液，该缓冲液的浓度及具体用量为本领域技术人员所理解和掌握。

本发明所述的焦磷酸酶活性检测方法，所述步骤(1)中加入缓冲溶液将底物焦磷酸盐的ph调至7.0-8.5。

本发明所述的焦磷酸酶活性检测方法，所述步骤(2)中恒温水浴温度为30℃-45℃。

本发明所述的焦磷酸酶活性检测方法，所述步骤(2)中，可溶性硫盐和可溶性镉盐的摩尔比为1:3-10。

本发明所述的焦磷酸酶活性检测方法，所述步骤(2)中，加入可溶性硫盐和可溶性镉盐混匀后的反应时间为3-10min。

本发明所述的焦磷酸酶活性检测方法，所述步骤(3)中，焦磷酸酶的水解时间为10-30min。

本发明公开了一种简单、快速地检测焦磷酸酶活性方法，在未加入焦磷酸酶，只有底物焦磷酸盐存在时，焦磷酸盐能够稳定硫化镉形成量子点，具有较强的荧光强度；当焦磷酸酶存在时，焦磷酸酶能够水解焦磷酸盐使得形成的硫化镉量子点减少，反应体系的荧光强度降低且荧光强度和加入的焦磷酸酶的活性之间存在线性关系；本发明具有操作简单、分析速度快、成本低，灵敏度高等优点。

由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：

本发明通过焦磷酸盐稳定硫化镉量子点，并在此基础上建立了一种简单、快速、灵敏的焦磷酸酶活性检测方法。

附图说明

图1为基于硫化镉量子点荧光法检测焦磷酸酶活性的示意图。

图2为不同种类的缓冲溶液对量子点荧光强度的影响图；其中，a为tris-hcl缓冲溶液，b为磷酸一氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，c为硼酸–硼砂缓冲溶液，d为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，e为纯水。

图3为加入不同活性浓度的焦磷酸酶(0、0.1u/ml、0.5u/ml、1.0u/ml)反应的酶活性动力学曲线图。

图4为不同的水浴反应温度对焦磷酸酶活性检测的影响图。

图5为焦磷酸酶活性浓度与荧光强度的拟合曲线图。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

缓冲溶液种类对量子点荧光强度的影响

首先配制2mmol/l的焦磷酸钠溶液、10mmol/l硫化钠和100mmol/l的氯化镉溶液，在10ml比色管中分别加入tris-hcl、磷酸一氢钠-磷酸二氢钠，硼酸–硼砂以及磷酸氢二钠-柠檬酸四种缓冲溶液（ph为7.5，体积为3.0ml，浓度为0.1mol/l）以及纯水，然后再加入250μl的焦磷酸钠溶液，补充蒸馏水使其最终体积为5ml，在40℃下进行恒温水浴反应，然后用移液器再依次加入70μl，10mmol/的硫化钠和30μl，100mmol/l的氯化镉溶液，蒸馏水定容至10ml，混匀反应5min，用荧光分光光度计测定荧光强度(激发波长：ex＝310nm，发射波长：em＝400-620nm，最大发射波长：470nm)。实验结果如图2所示，可以看出焦磷酸钠稳定的硫化镉量子点在tris-hcl缓冲溶液中的荧光强度最大，因此在接下来的实验中选择tris-hcl作为焦磷酸酶活性检测的缓冲溶液。

实施例2

焦磷酸酶活性动力学曲线

在10ml比色管中加入ph为7.5，3.0ml，0.1mol/l的tris-hcl缓冲溶液中，然后加入250μl的焦磷酸钠溶液，接着再分别加入不同活性浓度的焦磷酸酶溶液(0、0.1u/ml、0.5u/ml，1.0u/ml)，补充蒸馏水使其最终体积为5ml，混匀，在40℃下水浴反应不同的时间，然后再向其中依次加入70μl，10mmol/的硫化钠和30μl，100mmol/l的氯化镉溶液，蒸馏水定容至10ml，混匀反应5min，直接测定荧光强度(激发波长：ex＝310nm，发射波长：em＝400-620nm，最大发射波长：470nm)，以反应时间为横坐标，加入焦磷酸酶反应前后荧光强度的变化值为纵坐标，做酶活性动力学曲线，结果如图3所示。可以看到，随着反应时间的增加，荧光强度变化值越来越大，表示焦磷酸钠逐渐被水解，且相同的反应时间，焦磷酸酶的活性浓度越大，底物焦磷酸钠被水解的也越多，荧光强度变化值越大。

实施例3

反应温度对焦磷酸酶活性检测的影响

分别在6个10ml比色管中加入ph为7.5，3.0ml，0.1mol/l的tris-hcl缓冲溶液中，然后加250μl的焦磷酸钠溶液，接着再加入0.5u/ml活性浓度的焦磷酸酶溶液，补充蒸馏水使其最终体积为5ml，混匀，水浴温度依次为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和45℃，反应15min后，依次向其中加入70μl，10mmol/的硫化钠和30μl，100mmol/l的氯化镉溶液，蒸馏水定容至10ml，混匀反应5min，直接测定荧光强度(激发波长：ex＝310nm，发射波长：em＝400-620nm，最大发射波长：470nm)，结果由图5可以看出，25℃和50℃的荧光强度变化值都较低，30℃、35℃、40℃、45℃的荧光强度变化值接近，这是因为25℃时焦磷酸酶的活性较低，水解底物焦磷酸钠的能力较弱，故荧光强度变化值较小，而反应温度在50℃时，焦磷酸酶可能会部分失去活性，水解底物焦磷酸钠的能力更弱，故荧光强度变化值最小，因此选择焦磷酸酶的反应温度为30℃-45℃。

实施例4

焦磷酸酶活性标准曲线的绘制

与实施例2相此，区别点仅在于：向底物焦磷酸钠溶液中分别加入不同活性浓度焦磷酸酶溶液，15min后测定各自的荧光光谱；焦磷酸酶的活性浓度依次为：0.01u/ml、0.05u/ml、0.1u/ml、0.25u/ml、0.5u/ml。以焦磷酸酶的活性浓度为横坐标，加入焦磷酸酶反应前后荧光强度的变化值为纵坐标，即可绘制焦磷酸酶的标准曲线(如图5所示)，焦磷酸酶的浓度在0.01-0.5u/ml呈现良好的线性关系（△|f470|=478.08cppase+16.59，r^²=0.9988），检出限为0.008u/ml（s/n=3）。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。