一种提高经济作物对黄瓜花叶病毒抗性的方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高经济作物对黄瓜花叶病毒抗性的方法。

背景技术：

黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus，cmv)是世界范围内流行的一种植物病毒，植株可在除生长点以外的任何部位发病。现有报道中，cmv可侵染主要经济作物和观赏植物1200多种。其中烟草受其危害最大，油菜和西蓝花等十字花科作物亦受到较大危害。通过现代分子生物学手段，利用转基因技术在经济作物中的应用，培育抗病或耐病新品种是解决cmv危害的主要方式。

为了适应环境，降低细菌、真菌和病毒等各类生物胁迫对植株的损害，植物进化出了复杂的防御机制来应对。在病毒侵染过程中，植物触发一系列细胞事件，通过几个平行的信号转导途径，调节特定转录因子的水平，最终导致编码合成参与病毒抗性的效应蛋白或代谢物的基因的上调或下调，从而增强对病毒的抵抗力和耐受性。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种提高经济作物对黄瓜花叶病毒抗性的方法，可有效的提高作物对于黄瓜花叶病毒的抗性。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种提高经济作物对黄瓜花叶病毒抗性的方法，包括以下步骤：

(1)于1/2ms平板或土壤中，光照培养作物12～16h后，再暗培养作物8～10h；

(2)将构建得到的过表达载体flag-ha-wrky30ox转入步骤(1)培育得到的植物材料的愈伤组织中；

(3)继代2～3次后，提取总rna，并筛选出成功转入wrky30ox的植株进行培养即可。

进一步地，作物为烟草、油菜或西蓝花。

进一步地，光照培养时间为16h，暗培养时间为8h。

进一步地，wrky30基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

进一步地，步骤(3)通过rt-pcr鉴定作物中wrky30基因的表达情况，并筛选出成功转入wrky30ox的植株。

进一步地，rt-pcr的反应体系包括：2μl10×pcrbuffer、1.6μldntps(2.5mm)、1.2μllprimer(100pmol/μl)、1.2μlrprimer(100pmol/μl)、0.2μltaqdnapolymerase(3u/μl)、1μlcdna，最后用ddh2o补足至20μl。

进一步地，rt-pcr的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min；51℃退火30s；72℃延伸30s；共30个循环，最后72℃延伸10min。

上述wrky30基因在分子生物学辅助育种技术中的应用。

上述wrky30基因编码的蛋白在提高作物对黄瓜花叶病毒抗性中的应用。

本发明的技术原理为：

wrky转录因子是调控植物非生物或生物胁迫反应的关键调控因子。以往的研究表明，wrky30的表达是由氧化应激处理、真菌诱导子、sa和aba诱导的。拟南芥wrky-dna结合蛋白30(wrky30)在调节cmv抗性中起着重要作用。wrky30的表达是由cmv感染诱导的，wrky30突变体表现出更高的易感性(包括更高的氧化损伤、诱导活性氧合成和更多的psii光化学损伤)，而wrky30的高表达植株(wrky30ox)表现出更强的抗cmv感染能力。说明wrky30在植物抗cmv过程中起着积极的调节作用。

本发明的有益效果为：

通过将wrky30基因导入作物中，使其在作物中成功表达，能够有效的提升作物对于黄瓜花叶病毒的抗病性，从而能够对作物品种进行定向改良，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为构建得到的过表达载体菌落pcr检测结果；

图2为过表达载体转入至植株后pcr检测结果；

图3为转基因烟草中wrky30基因表达情况的检测结果；

图4为转基因油菜中wrky30基因表达情况的检测结果；

图5为转基因西蓝花中wrky30基因表达情况的检测结果；

图6为转基因烟草接种cmv后，wrky30基因的表达情况监测结果；

图7为转基因烟草组接种cmv病毒后的未染病植株；

图8为未转基因烟草组接种cmv病毒后的染病植株。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1

1、材料准备

在1/2ms平板或土壤中，培育烟草、油菜及西蓝花和已感染cmv病毒的接种烟草，培育条件为：光照培育16h后，暗培养8h。

2、介导转化

通过农杆菌介导法，将已构建35s启动子驱动的过表达载体flag-ha-wrky30ox转入各植物材料的愈伤组织中，并通过pcr检测转化结果，其结果见图1和图2。

其中，图1为构建得到的过表达载体菌落pcr检测结果，根据图1的结果可知，成功构建了含有wrky30基因的过表达载体。

图2为过表达载体转入至植株后pcr检测结果，根据图2的检测结果可知，过表达载体成功已经成功转入至植株中。

3、rt-pcr验证

待继代2次(约1个月)，愈伤组织长出不定芽后，采用rneasy微型试剂盒(qiagen)从不同类型植物中提取并纯化总rna。以actin1基因为内参标准，未转基因的植株作为对照，通过反转录pcr(reversetranscription-pcr,rt-pcr)其反应体系见表1，反应程序见表2，引物序列见表3；鉴定植株的wrky30ox转基因表达情况。其结果见图3～5。

表1rt-pcr反应体系

表2rt-pcr反应程序

表3引物序列

图3为转基因烟草中wrky30基因表达情况的检测结果；图4为转基因油菜中wrky30基因表达情况的检测结果；图5为转基因西蓝花中wrky30基因表达情况的检测结果。根据检测结果可知，wrky30基因在转基因烟草、转基因油菜和转基因西蓝花中均成功表达。

4、转基因过表达植株培养

对通过rt-pcr验证，已成功转入wrky30ox的t0代幼苗，进行温室驯化培养，同时培养各类型未转基因的植株作为对照。

5、接种病毒

待幼苗正常生长后，采用人工汁液摩擦法，对t0代烟草、油菜和西蓝花及相应对照植株叶片进行cmv接种，每株接种3个叶片，每个处理保证50个幼苗。在土壤中种植4周后，进行抗性鉴定，并检测其中wrky30基因的表达情况，其结果见图6。

如图6所示，转基因烟草组(条带t0-1、t0-2和t0-3)中wrky30基因的表达量高于为转基因烟草，表明在植株在感染黄瓜花叶病毒后，其中的wrky30基因的表达量会增加。

并且，图7为转基因烟草组接种cmv病毒后的植株发育状况；图8为未转基因烟草组接种cmv病毒后植株发育状况。根据图7和图8的对比可知，转基因烟草组虽然接种了cmv病毒，但并未染病，而未转基因烟草组接种cmv病毒后则是感染上了cmv病毒。

6、病害鉴定及结果

cmv病害分级标准按行业标准yc/t391996规定执行。计算出t0代烟草、油菜和西蓝花的平均病情指数和抗性指数。

计算公式和表示如下：

平均病情指数＝(各级病株数×该病级数)×100/(调查总株数×最高级数)

抗性指数划分如下：

抗病：≤20；中抗：20-40；中感：40～60；感病：＞60。

鉴定结果见表4。

表4植株鉴定结果

由表1数据可知，转基因组的病情指数均远低于未转基因组，可以看出，在植株中导入wrky30基因能够有效的提升植株对于cmv病毒的抗性，能够应用于对作物品种进行定向改良。