一种人类免疫缺陷病毒HIV-1的检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种人类免疫缺陷病毒hiv-1的检测试剂盒，属于hiv分子生物学检测
技术领域：
。
背景技术：
：艾滋病(acquiredimmunedeficiencysyndrome,aids)是一种危害极大的病毒性传染疾病，严重威胁着全球公共卫生。目前全世界约有3700万人已感染人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,hiv)，且每年新增加约180万感染者。我国自1989年在云南省瑞丽市首次发现吸毒人群感染hiv/aids以来，吸毒途径一直是我国感染艾滋病的主要途径之一，特别是在注射吸毒人群中由于共用针具、共用棉球等高危行为的存在，使其更易成为艾滋病的受累人群。我国吸毒人群及其艾滋病感染分布多与地理位置分布有关。由于毗邻著名的毒品生产基地“金三角”，云南省的吸毒现象较内地更普遍。高效抗逆转录病毒疗法(highlyactiveantiretroviraltherapy,haart)能有效地控制血浆中hiv-1病毒复制，抑制hiv-1病毒到不可检测水平，但是art不能清除潜伏病毒库。潜伏病毒库是art治疗中断后病毒再爆发的主要来源，是清除潜伏的hiv-1病毒的主要障碍。在aids的siv(simianimmunodeficiencyvirus)模型中证实在病毒感染后1-3天内就建立了病毒库，因此即使hiv-1病毒感染3天后就使用haart治疗，也不能阻止持续感染的建立。因此，需要开发新型的hiv病毒潜伏库检测手段，为“功能”治愈hiv/aids患者打下技术基础。与蛋白免疫检测相比，基于分子(核酸)的诊断检测有众多优势，特别是在检测灵敏度和特异型方面。但是，传统的核酸检测(nucleicacid-basedtests，nats)需要处理大量的样本、训练有素的操作人员及专门的设备。现场检测(on-sitedetection)病原体和其他疾病标志物可以提高医疗质量，降低医疗成本。hiv诊断的金标准是dnapcr，dnapcr能检测存在于周边血单核细胞中的前病毒dna。即使当hiv病毒载量被抑制到很低的水平，hivdna检测也是可靠的。不幸的是，hivdnapcr不适合在贫困地区进行，因为pcr需要昂贵的设备、电力、专门的实验室空间及训练有素的技术人员。因此，需要一种基于dna检测的即时(point-of-care)hiv检测技术，它可以快速提供结果，使更多的患者能够了解他们的hiv状况并更快地开始治疗。与其它常规的分子方法相比，等温扩增技术具有快速、操作简单及花费低的优点，非常适合于临床应用。目前，病毒感染诊断一般包括病毒分离和鉴定、病毒核酸和抗原的直接检出以及特异性抗体的检测，不仅耗时长，而且对医疗设备和操作人员的专业水准要求很高。因此，如果能开发出一种不需依赖贵重设备和医护人员的智能诊断设备显得非常重要，尤其对于病毒感染经常肆意横行的发展中国家。常规的hiv感染检测方法是通过酶联免疫检测(elisa)来检测人血清或血浆中是否存在抗病毒抗体；因为机体需要一定的时间才能产生特异性免疫反应，因此在病毒感染的前1～3个月(“窗口期”)中，可能根本检测不到抗体；而检测病毒的核酸可以大大缩短检测的窗口期。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于人类免疫缺陷病毒hivdna进行定性检测的引物、探针以及检测试剂盒，通过提取待检样品基因组dna，并结合等温核酸扩增技术和crispr技术，可准确定性待检样品中hivdna。本发明所提供的引物、探针和检测试剂盒不仅可用于对hiv的临床检测，还可以用于对被hiv感染的患者中hivdna的定性分析，将在我国hiv/aids的防控工作中发挥重要作用。上述目的通过以下技术方案实现，一种人类免疫缺陷病毒hiv-1的检测试剂盒，包括dna的等温扩增-crispr技术检测引物和探针：所述hiv体外等温核酸扩增-crispr的特异性引物，包括上游引物hiv-raa_f和下游引物hiv-raa_r；上游引物hiv-raa_f：tacttcaagaactgctgacatcgagcttgctac；(seqidno.1)。下游引物hiv-raa_r：cgccactgctagagattttccacactgact；(seqidno.2)。所述探针核苷酸序列为：tttccacactgactaaaagggtct(seqidno.3)。本发明还提供与上述引物配合使用的ssdna-fq报告基因探针，所述的探针核苷酸序列为：fam-ttatt-bhq1(seqidno.4)。进一步，优选的，本发明所述人类免疫缺陷病毒hiv-1的检测试剂盒还包括阴性对照模板、阳性对照模板、raa等温核酸扩增试剂、10xnebbuffer2.1、40u/μl的rnase抑制剂、2m的dtt及2μm的engenlbacpf1核酸酶。所述的阴性对照模板为ribozyme-free水和puc57-hbv质粒；所述的阳性对照模板为puc57-hivltr质粒。当体外等温核酸扩增-crispr检测体系以阴性对照模板进行反应时，所述的模板为ribozyme-free水和已知浓度的puc57-hbv质粒；当体外等温核酸扩增-crispr检测体系以阳性对照模板进行反应时，所述的模板为puc57-hivltr质粒；体外等温核酸扩增-crispr检测体系以待检样品模板进行反应时，所述的模板为从疑似hiv感染者的血液中抽提的病毒基因组dna。利用本发明提供的引物和探针对阴性对照模板、阳性对照模板以及待检样品模板进行体外等温核酸扩增-crispr检测，终止反应后在victornivo酶标仪上，激发波长535nm，发射波长575nm，收集荧光值，待检样品模板荧光值减去空白孔荧光值得到最终荧光值，待检样品的最终荧光值小于等于0的时候判读为没有检测到病毒(检测结果为阴性)。进一步，优选的，本发明所述的raa等温核酸扩增试剂包括基础反应液、装有冻干粉的基础反应单元及乙酸镁溶液。进一步，优选的，本发明所述试剂盒的raa等温核酸扩增体系为：基础缓冲液，25.0μl；上游引物hiv-raa_f(10μmol/l)，2.0μl；下游引物hiv-raa_r(10μmol/l)，2.0μl；模板dna，1.0μl；纯化水，17.5μl；乙酸镁溶液，2.5μl；总计50.0μl。进一步，优选的是，本发明所述试剂盒的核酸扩增程序：37℃反应40分钟；反应结束后，每个反应管中加入50μl酚/氯仿(1:1)，用涡旋震荡仪充分振荡均匀，12000rpm离心1分钟。进一步，优选的是，本发明所述试剂盒的crisprdna检测体系为：10xnebbuffer2.1，2.0μl；engenlbacpf1核酸酶，2.0μl；ltr-crrna探针(10μmol/l)，1.0μl；raa扩增产物，4.0μl；ssdna-fq报告基因探针(100μmol/l)，0.2μl；rnase抑制剂，0.25μl；dtt，0.1μl；ribozyme-free水，10.45μl；总计20.0μl。进一步，优选的是，所述试剂盒的检测程序：37℃反应40分钟，98℃加热5分钟终止反应。本发明提供用于对hivdna进行检测的ssdna-fq报告基因探针的5’端以报告荧光基团标记，3’端以淬灭荧光基团标记。其中fam为6-羧基荧光素报告荧光基团，bhq1为黑洞淬灭荧光基团。本发明的具体原理是，crispr-cas12a(cpf1)系统在剪切靶向的双链dna时，cpf1的dna酶活性会被激活，该酶能非特异性反式切割单链ssdna；因此，同时向细胞内递送靶向该dna的crispr-cpf1系统和非特异性的ssdna荧光报告基团，一旦检测到目的dna，crispr-cpf1系统将启动，荧光报告基团会被降解，释放出荧光信号。通过等温扩增方法(如重组酶聚合酶扩增raa)来扩增dna或rna样品；然后，在特定的guiderna帮助下，crispr相关蛋白cpf1结合扩增的靶序列，通过报告分子的旁路核酸切割活性来检测所产生的结果。针对hivltrdna序列，设计用于等温核酸扩增的特异性引物和用于crispr检测的ltr-crrna探针与ssdna-fq报告基因探针，使用fam基团作为ssdna-fq报告基因的报告荧光基团，bhq1作为ssdna-fq报告基因的淬灭荧光基团；在昆明擎科生物合成puc57-hbv质粒和puc57-hivltr质粒；在上海生工合成探针；在江苏奇天基因公司购买raa等温核酸扩增试剂盒；最终构建出适用于检测hivdna的等温核酸扩增-crispr联用的检测引物、探针和检测试剂盒。本发明与现有技术相比，其有益效果为：(1)本发明设计了特异性强的体外等温核酸扩增引物和crispr检测探针，并在此基础上构建一种能够检出hivdna的检测试剂盒，该试剂盒具有特异、敏感、快速和高效等优势。(2)本发明的crispr检测技术在37℃反应40分钟，就能检测到最高荧光值(附图1)，比利用传统的rt-qpcr方法检测时间更快。(3)人体感染hiv早期，其血液内病毒含量较低，而本发明开发的体外核酸等温扩增-crispr技术检测试剂盒具有良好的检测灵敏度，适用于早期临床样本的检测。灵敏度试验结果显示，本发明开发的体外核酸等温扩增-crispr技术检测试剂盒的检出下限为10拷贝的hiv病毒dna(附图2)，而rt-qpcr的检出下限一般为50拷贝，表明本发明的检测灵敏度比普通rt-qpcr高5倍。(4)本发明开发的体外核酸等温扩增-crispr技术检测试剂盒特异性强。如附图3所示，本发明涉及的引物和探针只能在hivdna样本中产生荧光值，而未与hbvdna发生交叉反应。(5)本发明开发的体外核酸等温扩增-crispr技术检测试剂盒反应速度快，整个检测过程不到2小时即可完成，而且无需琼脂糖凝胶电泳即可直接通过检测荧光值判断待检样品是否有hivdna的存在，比传统的电泳检测方法用时短，大大提高了工作效率。(6)由于hivltr序列具有高度保守性，通常被用作hiv病毒特异性检测的靶基因，本发明针对hivltr序列进行引物设计，之后应用实例中利用本发明开发的体外核酸等温扩增-crispr技术检测试剂盒对大理市第二人民医院采集的hiv/aids患者血液样本进行检测，其检测结果表明本发明开发的检测试剂盒可有效地检测hiv/aids患者血液样本中的hivdna，检测符合率为100％。附图说明图1本发明的时间反应曲线；x轴为检测hivdna的反应时间，y轴为荧光值。图2本发明开发的体外核酸等温扩增-crispr技术试剂盒灵敏度试验；其中，1ng模板hivdna等于108am。图3本发明开发的体外核酸等温扩增-crispr技术试剂盒特异性试验。具体实施方式本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。(1)实验材料hiv/aids患者血液样本来自在大理市第二人民医院开展的科研项目《全营养配方食品营养补充对艾滋病患者营养治疗效果的研究临床试验》，未感染hiv的戒毒人员血液样品采集自云南省第六强制戒毒所陇川分所。血液样本分装成200μl/管，保存在-80℃冰箱。(2)试剂与仪器10xnebbuffer2.1和engenlbacas12a(cpf1)核酸酶购自neb公司；质粒小提试剂盒、大肠杆菌dh5α感受态细胞、血液基因组dna提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；酚/氯仿(1:1)购自索莱宝公司；raa核酸检测试剂盒(货号：b00000)购自江苏奇天基因公司。puc57-hivltr质粒和puc57-hbv质粒由昆明擎科生物公司合成，保存在-20℃冰箱。384孔板；victornivo酶标仪；干式恒温金属浴ose-96(天根生化科技有限公司)；台式离心机1-14(sigma)。(3)设计引物和探针针对hivltr序列，设计用于体外等温核酸扩增的特异性引物和ltr-crrna探针，同时设计ssdna-fq报告基因探针，报告基因探针分别使用fam和bhq1作为报告荧光基团和淬灭荧光基团。引物和探针序列如表1所示。表1palvqrt-pcr检测所用引物和探针序列信息(4)模板质粒的合成根据hivhxb2株的ltr序列(806bp)和合成的hbv序列(989bp)，在昆明擎科生物公司分别合成puc57-hivltr质粒和puc57-hbv质粒。把合成的质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞(天根生化科技有限公司)，筛选阳性克隆菌进行质粒提取。按照“质粒小提试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书提取模板质粒。(5)优化crispr检测体系(6)通过反复试验，优化crispr检测的反应体系，确定采用的反应总体系为20μl，所需各组分及相应浓度、相应用量见表2。以10ng终浓度的puc57-hivltr质粒作为模板，分别对ltrcrrna探针浓度(0.25、0.5、0.75和1.0μmol/l)和ssdna-fq报告基因探针浓度(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μmol/l)进行优化，以20μl反应体系进行hivdna检测，最佳结果对应ltrcrrna探针和ssdna-fq报告基因探针终浓度分别为0.5μmol/l和1μmol/l。如调整反应体系，应保证体系内ltrcrrna探针和ssdna-fq报告基因探针的终浓度为0.5μmol/l和1μmol/l，即能得到较好的检测结果。表2crispr检测hivdna反应体系反应体系组分用量(μl)终浓度10×nebbuffer2.12.0engenlbacas12a(2μmol/l)2.0dtt(2mol/l)0.1rnaseinhibitors(40u/μl)0.25ltr-crrnaprobe(10μmol/l)1.00.5μmol/lssdna-fq报告基因探针(100μmol/l)0.21μmol/l模板(100ng/μl)0.1ribozyme-free水14.35总计20.0(6)优化体外核酸等温扩增反应条件按照raa体外核酸等温扩增试剂盒的操作说明书进行体外核酸等温扩增；为了获得最多量的目的扩增产物，raa等温核酸扩增最佳反应条件确定为：37℃反应40分钟。(7)优化体外核酸等温扩增-crispr技术检测试剂盒反应体系中所用raa扩增产物体积：通过反复试验，优化体外核酸等温扩增-crispr技术检测试剂盒检测的反应体系，确定采用的反应总体系为20μl，所需各组分和相应用量见表3。以raa扩增产物作为模板，对其使用体积(1.0、2.0、3.0、4.0和5.0μl)进行优化，以20μl反应体系进行hivdna检测，在4.0μl的raa扩增产物时能获得最优的检测结果。表2体外核酸等温扩增-crispr技术检测试剂盒反应体系(8)本发明的时间反应曲线以10nghivdna为模板，分别检测反应时间为10、20、30、40、50及60分钟时的荧光值，建立本发明的时间反应曲线。以检测hivdna的反应时间为x轴，以最终荧光值为y轴，得到时间反应曲线如图1所示，由图可以看出crispr-cpf1、ltrcrrna-1及10nghivdna联用，37℃反应40分钟，能检测最高荧光值。(9)灵敏性分析利用本发明所涉及的hivdna检测引物、探针和检测试剂盒，按优化的反应体系和反应条件，以拷贝数分别为106am、105am、104am、103am、102am、101am及100am的模板hivltr经体外核酸等温扩增后，取4μl扩增产物进行灵敏性分析，本发明涉及的检测引物、探针和试剂盒的检出下限为10拷贝(见图2)。由图可以看出raa等温核酸扩增技术与crispr-cpf联用，能检测到10拷贝的hiv病毒dna(对于模板dna，1ng等于108am)。(10)特异性分析利用本发明所涉及的hivdna检测引物、探针和检测试剂盒，按优化的反应体系和反应条件，取4μl经体外核酸等温扩增的产物进行特异性分析，本发明涉及的hivdna检测引物、探针和检测试剂盒的能够特异性检出hivdna，而与hbvdna没有交叉反应，如图3所示，由图可以看出raa等温核酸扩增技术与crispr-cpf联用是特异性良好的检测方法。应用实例利用本发明开发的检测试剂盒对hiv/aids患者进行检测利用本发明所涉及的hivdna检测引物、探针和检测试剂盒，按优化的反应体系和反应条件，对采集的30份hiv/aids患者血液样本和30份未感染hiv的戒毒人员血液样品进行检测。各取100μl血液提取基因组dna，实施操作过程中，阴性对照模板、阳性对照模板以及待检样品模板在不同的反应孔中同时进行体外核酸等温扩增和crispr检测过程。本发明涉及的引物、探针和检测试剂盒能够有效地检出所有阳性样本，同时未感染hiv的戒毒人员的检测结果都是阴性，符合率为100％。本发明开发的hivdna检测试剂盒对病原核酸进行检测，因此，在宿主被感染但还未产生抗体时，本发明开发的hivdna体外核酸等温扩增引物、crispr相关探针和检测试剂盒具有良好的敏感性和可靠性。由本发明引物对衍生的引物序列也属于本发明的保护范围；所述衍生序列是指在seqidno.1至seqidno.4的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表<110>昆明医科大学第一附属医院<120>一种人类免疫缺陷病毒hiv-1的检测试剂盒<130>20200521<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>806<212>dna<213>hivhxb2株的ltr(hiv)<400>1tggaagggctaattcactcccaaagaagacaagatatccttgatctgtggatctaccaca60cacaaggctacttccctgattagcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccac120tgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataagatagaagaggcca180ataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccgg240agagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgag300agctgcatccggagtacttcaagaactgctgacatcgagcttgctacaagggactttccg360ctggggactttccagggaggcgtggcctgggcgggactggggagtggcgagccctcagat420cctgcatataagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctga480gcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgcct540tgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctc600agacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaag660cgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacgg720caagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctaga780aggagagagatgggtgcgagagcgtc806<210>1<211>989<212>dna<213>合成的hbv(hiv)<400>1ggattggggaccctgcgctgaacatggagaacatcacatcaggattcctaggacccctgc60tcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcctcacaataccgcagagtctag120actcgtggtggacttctctcaattttctaggggggaccaccgtgtgtcttggccaaaatt180cgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcctgtcctccaacttgtcctggttatc240gctggatgtgtctgcggcgttttatcatcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatct300tcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggat360cttcgaccaccagcgtgggaccatgcagaacctgcacgactactgttcaaggaacctcta420tgtatccctcatgttgctgtaccaaaccttcggacggaaattgcacctgtattcccatcc480catcatcctgggctttcggaaaattcctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggc540tcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtttggcttt600cagttatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgcacagcatcttgagtccctttt660taccgctgttaccaattttcttttatctttgggtatacatttaaaccctaacaaaactaa720aagatggggttactctttaaatttcatgggctatgtcattggatgttatgggtcattgcc780acaagatcacatcagacagaaaatcaaagaatgttttagaaaacttcctgttaacaggcc840tattgattggaaagtctgtcaacgtattgtgggtcttttgggttttgctgccccttttac900acaatgtggttatcctgctttaatgcccttgtatgcctgtattcaatctaagcaggcttt960cactttctcgccaacctacaaggcctttc989当前第1页12