ANGPTL3结合片段及其用途的制作方法

本发明涉及一种结合血管生成素样蛋白3(angptl3)的抗体或其抗原结合片段，以及其制备方法和用于制备疾病诊断组合物、药物组合物、治疗疾病的用途。
背景技术：
：高脂血症是涵盖特征为血液中脂质水平和/或脂蛋白水平升高或与之相关的疾病和障碍的一般术语。高脂血症包括高胆固醇血症、高甘油三酯血症、合并高脂血症和脂蛋白(a)(lp(a))升高。在许多群体中，特定的高脂血症普遍形式是高胆固醇血症。高胆固醇血症，特别是低密度脂蛋白(ldl)胆固醇(ldl-c)水平升高，构成形成动脉粥样硬化和冠心病(chd)的主要风险(sharrett等人,2001,circulation104:1108-1113)。低密度脂蛋白胆固醇经鉴定为胆固醇降低疗法的主要靶标并且被公认为有效的代用治疗终点。血管生成素样蛋白3基因(angptl3)中的功能失活变异与三酸甘油酯、低密度脂蛋白(ldl)胆固醇和高密度脂蛋白(hdl)胆固醇的血浆水平降低有关。研究发现，angptl3功能突变的杂合参与者其血清甘油三酯，高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平显著降低。小鼠模型中，evinacumab抑制angptl3可显著降低动脉粥样硬化病变面积和坏死含量。人体中，相比于安慰剂。evinacumab显示剂量依赖的甘油三酯和ldl胆固醇降低作用，最大降幅分别为76％和23％。研究表明angptl3基因突变或抑制与人体主要脂质组分减少和动脉粥样硬化性心血管疾病发病率降低相关(dewey等人，(2017)，thenewenglandjournalofmedicine，1-11)。技术实现要素：本发明全文中关于vl结构域、vh结构域、lcdr1、lcdr2、lcdr3、hcdr1、hcdr2和hcdr3的各个实施方式可以各自单独实施，也可以任意组合实施。在本发明的一个方面中，提供一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含如下(1)-(2)中vl结构域和vh结构域的任意一种组合：(1)含有seqidno:5所示lcdr1氨基酸序列、seqidno:6所示lcdr2氨基酸序列和seqidno:7所示l-cdr3氨基酸序列的vl结构域，以及含有seqidno:8所示hcdr1氨基酸序列、seqidno:9所示hcdr2氨基酸序列、和seqidno:10所示hcdr3氨基酸序列的vh结构域；(2)含有seqidno:5所示lcdr1氨基酸序列、seqidno:6所示lcdr2氨基酸序列和seqidno:7所示l-cdr3氨基酸序列的vl结构域，以及含有seqidno:11所示hcdr1氨基酸序列、seqidno:12所示hcdr2氨基酸序列、和seqidno:10所示hcdr3氨基酸序列的vh结构域；在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含如下(1)-(2)中vl结构域和vh结构域的任意一种组合：(1)seqidno:1所示氨基酸序列的vl结构域，以及seqidno:2所示氨基酸序列的vh结构域；(2)seqidno:3所示氨基酸序列的vl结构域，以及seqidno:4所示氨基酸序列的vh结构域。在本发明的一个方面中，所述抗体或其抗原结合片段包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv或dsfv片段。根据本发明的一方面，本发明的抗体或其抗原结合片段结合血管生成素样蛋白3(angptl3)，并抑制或干扰其至少一种活性。优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段结合人angptl3。在本发明的一个方面中，所述抗体或其抗原结合片段包含seqidno:13所示氨基酸序列的重链恒定区。在本发明的一个方面中，所述抗体或其抗原结合片段包含seqidno:16所示氨基酸序列的轻链恒定区。在本发明的一个方面中，本发明涉及一种核酸，其包含编码本发明所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。在本发明的一个方面中，本发明涉及一种载体，其表达本发明所述的抗体或其抗原结合片段。在本发明的一个方面中，本发明涉及一种细胞，其表达本发明所述的抗体或其抗原结合片段。在本发明的一个方面中，本发明涉及使用本发明的抗体或其抗原结合片段诊断疾病的方法，包括将本发明的抗体或其抗原结合片段与来自受试者的样品接触，并且确定所述抗体与angptl3的结合情况，由此确定受试者样品的angptl3表达水平，从而诊断受试者中的疾病。优选地，所述疾病选自高脂血症、高脂蛋白血症、血脂异常、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、糖尿病和肥胖症。在本发明的一个方面中，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段用于诊断疾病或制备诊断疾病的试剂的用途。优选地，所述疾病选自高脂血症、高脂蛋白血症、血脂异常、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、糖尿病和肥胖症。在本发明的一个方面中，本发明涉及使用本发明的抗体或其抗原结合片段预防、治疗疾病的方法，包括将本发明的抗体或抗原结合片段给予有需要的受试者。优选地，所述疾病选自高脂血症、高脂蛋白血症、血脂异常、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、糖尿病和肥胖症。在本发明的一个方面中，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段用于预防、治疗疾病或制备预防、治疗疾病的药物组合物的用途。优选地，所述疾病选自高脂血症、高脂蛋白血症、血脂异常、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、糖尿病和肥胖症。根据本发明的另一方面，还提供一种组合物，其包含本发明所述的特异性结合血管生成素样蛋白3(angptl3)的抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括以下中的一种或多种：药学上可接受的溶剂、分散剂、附加剂、塑形剂、药物辅料。在一些实施方式中，所述组合物还可以包含其他治疗剂。在一些实施方式中，其他治疗剂包括免疫治疗剂或激素治疗剂等。所述抗体或其抗原结合片段与其他治疗剂的联合施用能够增强治疗效果。在一些实施方式中，所述受试者是哺乳动物，例如人类。在另一些实施方式中，所述受试者是分离的细胞、组织或器官，例如离体培养的细胞、血液。在一些实施方式中，所述“增强治疗效果”是指增强其他治疗剂或疗法的治疗效果。本发明提供的所述抗体或其抗原结合片段可以单独施用，也可以与其他治疗剂或疗法联合施用。在一些实施方式中，其他治疗剂或疗法包括化疗剂、免疫治疗剂、激素治疗剂、放射治疗、手术治疗。本发明提供的抗体或其抗原结合片段具有以下中的一种或多种功效：增强的angptl3蛋白结合能力、增强的angptl3蛋白亲和力、增强的降ldl能力，增强的降non-ldl能力、更长的半衰期、更大的药物动力学曲线下面积。上述表现是本发明所述抗体或抗原结合片段与对照抗体在同等条件下相比较而体现出的增强。在一些实施方式中，所述对照抗体为现有技术中存在的特异性结合angptl3蛋白的抗体，例如可以通过数据库寻找这样的抗体。在一些实施方式中，所述对照抗体为ap-regn-igg4抗体。附图说明图1示出了balb/c小鼠四免后抗angptl3的抗体的血清滴度。图2示出了利用elisa测定检测抗体与angptl3之间的结合活性。图3示出了利用elisa检测人源化抗体与angptl3的结合灵敏度。图4a示出了ca129人源化抗体酶活检测。图4b示出了ca136人源化抗体酶活检测。图4c示出了ca168人源化抗体酶活检测。图4d示出了ca63人源化抗体酶活检测。图5示出了elisa检测候选抗体与angptl3的结合灵敏度。图6a示出了srp检测ap-regn-igg4亲和力。图6b示出了srp检测apm1-ca63.17-igg4亲和力。图6c示出了srp检测apm2-ca129.14-igg4亲和力。图6d示出了srp检测apm2-ca136.18-igg4亲和力。图6e示出了srp检测apm1-ca168.12-igg4亲和力。图7示出了angptl3候选抗体体外功能活性检测。图8a示出了候选抗体对食蟹猴tg水平的影响。图8b示出了候选抗体对食蟹猴tc水平的影响。图8c示出了候选抗体对食蟹猴hdl水平的影响。图8d示出了候选抗体对食蟹猴ldl水平的影响。图8e示出了候选抗体对食蟹猴non-hdl水平的影响。图9示出了食蟹猴体内不同单抗平均药时曲线对比图。图10a示出了129.14在食蟹猴体内的免疫原性检测结果。图10b示出了regn在食蟹猴体内的免疫原性检测结果。图10c示出了136.18在食蟹猴体内的免疫原性检测结果。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，举出以下实施例是为了向本发明所属
技术领域：
的一般专业人员就如何利用本发明之方法和组合物提供一个完整的公开和说明，并非用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1.抗angptl3单克隆抗体的产生1.1免疫用angptl3(sinobiological，目录号10770-h08b)或angptl3(sinobiological，目录号10770-h08h1)与弗氏佐剂乳化后免疫balb/c小鼠。首免使用弗氏完全佐剂，二免至四免使用弗氏不完全佐剂，本次共免疫4只小鼠。把4只小鼠加强免疫3天后处死，取出脾脏用于后续实验。通过elisa检测的血清滴度参见图1。1.2噬菌体库的建立取免疫小鼠的脾脏细胞，提取rna后获得cdna，噬菌体库的建立步骤参照carlosf.barbasiii，phagedisplay：alaboratorymanual中记载的方法进行，用pcr的方法从cdna中获得重链和轻链的可变区，再将重链和轻链的可变区通过重叠延伸pcr的方法获得scfv，scfv酶切后与质粒pcomb3x连接，然后将连接产物电转染至大肠杆菌tg1感受态细胞中，tg1经培养后加入噬菌体侵染，然后回收培养物上清，以编号为apm01的小鼠建立的噬菌体库apm01，库容7.3x108；以编号为apm02的小鼠建立的噬菌体库apm02，库容8x108；以编号为aph1m01的小鼠建立的噬菌体库aph1m01，库容5.78x108；以编号为aph1m02小鼠建立的噬菌体库aph1m02库容6.3x108。1.3以两种方法进行筛选平板筛选：angptl3蛋白(义翘神州，10770-h08h1)以1μg/孔包被平板，4℃放置过夜，第二天通过2％bsa封闭平板1h，加入噬菌体库(2x1012)孵育2h，洗涤4-10次后用elutionbuffer(ph2.2)洗脱angptl3特异性结合的噬菌体。磁珠筛选：angptl3蛋白(义翘神州，10770-h08h1)按照常规步骤进行生物素化(投入的angptl3蛋白与生物素摩尔比1:2)，再与thermo的磁珠(invitrogendynabeadsm-280streptavidin，00355871)结合后与噬菌体库孵育，洗涤4-10次后用elutionbuffer(ph2.2)洗脱angptl3特异性结合的噬菌体。1.4抗体分子的构建与生产将克隆apm1-ca63\ca168、apm2-ca129\ca136送invitrogen生物技术有限公司测序。各克隆氨基酸序列如表1。表1.具有阻断活性克隆氨基酸序列通过常规的分子生物学技术pcr(2*phantamaxmastermix厂家：vazyme货号：p515-aa批号：te211gb)、信号肽与可变区重叠延伸、同源重组(clonexpressⅱonestepcloningkit厂家：vazyme货号：c112-01批号：te211l8)等方法，把编码vh结构域的核苷酸序列片段插入带有编码抗体重链恒定区氨基酸序列(seqidno:13)的核苷酸序列的载体pcdna3.4(lifetechnology)，把编码vl结构域的核苷酸序列片段插入带有编码抗体轻链恒定区氨基酸序列(seqidno:16)的核苷酸序列的载体pcdna3.4(lifetechnology)，转染进入hek293细胞在37℃\8％co2\125rpm摇床中培养，瞬时表达6-7天后上清通过proteina亲和层析，纯化获得angptl3抗体，并通过uv280结合消光系数确定抗体浓度。对照抗体选择再生元(regeneronpharmaceuticals)公司靶向创新靶点血管生成素样蛋白3(angptl3)的evinacumab，该抗体在关键性3期临床试验获得积极结果。试验数据表明，与已有降脂疗法相比，evinacumab可使纯合家族性高胆固醇血症(hofh)患者的ldl胆固醇水平降低49％，且具有良好的耐受性。对照抗体生产：通过imgt数据及专利us20170312359确定再生元angptl3抗体evinacumab的氨基酸序列(vh如seqidno:14所示、vl如seqidno:15所示)，全基因合成后插入载体pcdna3.4通过hek293细胞表达，生产的抗体命名为ap-regn-igg4。1.5利用elisa检测抗体与angptl3的结合活性包被不同浓度(0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.025μg/ml、0.0125μg/ml、0.00625μg/ml、0.003125μg/ml、0μg/ml)的angptl3蛋白(10770-h08b，义翘神州)，100μl/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入1μg/ml候选抗体各100μl，37度孵育1h；然后加入山羊抗人igg/hrp，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取od450。结果参见图2。如图2所示，候选抗体apm2-ca129-igg4与apm2-ca136-igg4与angptl3蛋白结合能力优于对照组ap-regn-igg4。预示候选抗体apm2-ca129-igg4、apm2-ca136-igg4相较对照组ap-regn-igg4对angptl3蛋白有更强的靶向性和结合性，能达到更好的药学效果。实施例2.人源化抗体的获得2.1抗体人源化借助discoverystudio软件对抗体进行三维结构模拟，结合cdrgraft对鼠源序列进行人源化改造，通过回复突变分析确定回复突变位点，构建并生产携带不同回复突变位点的人源化突变体，通过亲和力及体外活性检测筛选的候选人源化抗体，各克隆氨基酸序列如表2。表2.人源化抗体氨基酸序列将抗体基因与编码重链恒定区序列seqno:13的基因融合后，通过常规的分子生物学技术进行可变区基因扩增(2*easypfupcrsupermix厂家：transgen货号：as211批号：#l11228)、信号肽与可变区重叠延伸、同源重组(clonexpressⅱonestepcloningkit厂家：vazyme货号：c112-01批号：te222b8)连接入载体pcdna3.4(lifetechnology)，转染进入hek293细胞在37℃\8％co2\125rpm摇床中培养，6-7天后的瞬时表达上清通过proteina亲和层析，纯化获得angptl3人源化抗体，并通过uv280结合消光系数确定抗体浓度。2.2利用elisa检测人源化抗体与angptl3的结合灵敏度包被不同浓度(0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.025μg/ml、0.0125μg/ml、0.00625μg/ml、0.003125μg/ml、0μg/ml)的抗原angptl3(10770-h08b，义翘神州)，100ul/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入1μg/ml候选抗体各100μl，37℃孵育1h；然后加入山羊抗人igg/hrp，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取od450。结果参见图3和表3。如表3所示，候选抗体apm2-ca129.14-igg4与angptl3蛋白结合ec50值为0.016，显著低于对照组ap-regn-igg4的ec50值0.162，说明候选抗体的抗原结合能力优于对照组ap-regn-igg4。如表3所示，候选抗体apm2-ca136.18-igg4与angptl3蛋白结合ec50值为0.040，显著低于对照组ap-regn-igg4的ec50值0.162，说明候选抗体的抗原结合能力优于对照组ap-regn-igg4。预示候选抗体apm2-ca129.14-igg4、apm2-ca136.18-igg4相较对照组ap-regn-igg4对angptl3蛋白有更强的靶向性和结合性，能达到更好的药学效果。表3.利用elisa检测人源化抗体与angptl3的结合灵敏度ec50抗体idec50(μg/ml)抗体idec50(μg/ml)apm1-ca63.1-igg4～0.741apm1-ca168.1-igg40.017apm2-ca129.12-igg40.027apm1-ca168.2-igg40.023apm2-ca129.14-igg40.016apm1-ca168.9-igg40.022apm2-ca129.17-igg40.025apm1-ca168.11-igg40.017apm2-ca136.13-igg40.026apm1-ca168.12-igg40.023apm2-ca136.18-igg40.040ap-regn-igg40.1622.3基于酶活性方法的抗体体外活性检测用na3po4buffer蛋白angptl3稀释至350μg/ml，2倍梯度稀释，每孔5ul加入96孔黑板中。再用na3po4buffer将抗体稀释至500μg/ml，然后以2倍浓度梯度稀释共8个点，以每孔15ul加入96孔板，与angptl3蛋白混合。将lpl(r&d，9888-ll)放置在冰上，将r&d原液(lpl343μg/ml)，用buffer稀释为3μg/ml，每孔10ul加入96孔板中与anptl3及抗体混合，在25度条件下避光静置30min。取dggr底物(1639μg/ml)加入buffer，配制为浓度25μg/ml，以每孔25ul加入96孔板中，与三种蛋白混合液混合。37度静置孵育40-60min，535nm激发光、612nm发射光，检测荧光值。结果参见图4a-图4d和表4-表5。如表4、表5所示，候选抗体apm2-ca129.14-igg4的ec50值为93.69，候选抗体apm2-ca136.18-igg4的ec50值为104.3，对照组ap-regn-igg4的ec50值为95.09，说明候选抗体与对照抗体效果相当。表4.ca129、ca168人源化抗体酶活检测ec50抗体idec50(μg/ml)抗体idec50(μg/ml)apm2-ca129.12-igg4195.6apm1-ca168.1-igg466.93apm2-ca129.14-igg493.69apm1-ca168.2-igg487.68apm2-ca129.17-igg496.89apm1-ca168.9-igg487.83ap-regn-igg495.09apm1-ca168.11-igg4100.2//apm1-ca168.12-igg479.21表5.ca136、ca63人源化抗体酶活检测ec50抗体idec50(μg/ml)抗体idec50(μg/ml)apm2-ca136.13-igg4151.8apm1-ca63.17-igg473.10apm2-ca136.18-igg4104.3ap-regn-igg495.09实施例3.候选抗体的表征3.1elisa检测候选抗体与angptl3蛋白的结合包被不同浓度(0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.025μg/ml、0.0125μg/ml、0.00625μg/ml、0.003125μg/ml、0μg/ml)的angptl3蛋白(10770-h08b，义翘神州)，100ul/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入1μg/ml候选抗体各100μl，37度孵育1h；然后加入山羊抗人igg/hrp，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取od450。结果参见图5。如图5所示，候选抗体apm2-ca129.14-igg4与apm2-ca136.18-igg4与angptl3蛋白结合能力优于对照组ap-regn-igg4。预示候选抗体apm2-ca129.14-igg4、apm2-ca136.18-igg4相较对照组ap-regn-igg4对angptl3蛋白有更强的靶向性和结合性，能达到更好的药学效果。3.2biacore检测候选抗体与angptl3蛋白的结合抗体结合动力学使用基于表面等离振子共振(surfaceplasmonresonance，srp)技术的biacore8k仪器测量。通过geantihumaniggfc氨基偶联试剂盒(ge，cat#br-1008-39)，将anti-humanigg抗体氨基偶联到cm5生物传感器芯片上以获得大约1000应答单位(responseunits，ru)。对于动力学测量，将angptl3蛋白(义翘神州，10770-h08b)用hbs-ep+1×(ge，br-1008-26)缓冲液2倍连续稀释，50nm起始，2倍稀释4个浓度梯度，并设置0浓度。抗体：2μg/ml，进样时间70s，流速5μl/min，稳定5s；angptl3蛋白：结合60s，流速30μl/min，解离450s；再生：用3mmgcl2buffer再生30s，startup3次。使用简单一对一languir结合模型(biacoreevaluationsoftwareversion3.2)计算结合常数(ka)和解离常数(kd)，平衡解离常数(kd)以比率kd/ka计算。结果参见图6a-6e和表6。表6.biacore检测候选抗体结合动力学抗体idka(1/ms)kd(1/s)kd(m)ap-regn-igg46.09e+052.75e-044.52e-10apm1-ca63.17-igg42.28e+065.46e-042.39e-10apm2-ca129.14-igg45.73e+051.93e-043.36e-10apm2-ca136.18-igg45.83e+052.58e-044.43e-10apm1-ca168.12-igg46.55e+052.00e-043.05e-103.3angptl3候选抗体体外功能活性检测用na3po4buffer蛋白angptl3稀释至350μg/ml，2倍梯度稀释，每孔5μl加入96孔黑板中。再用na3po4buffer将抗体稀释至500μg/ml，然后以2倍浓度梯度稀释共8个点，以每孔15μl加入96孔板，与angptl3蛋白混合。将lpl(r&d，9888-ll)放置在冰上，将lpl原液(r&d343μg/ml)，用buffer稀释为3μg/ml，每孔10ul加入96孔板中与anptl3及抗体混合，在25℃条件下避光静置30min。取dggr底物(1639μg/ml)加入buffer，配制为浓度25μg/ml，以每孔25μl加入96孔板中，与三种蛋白混合液混合。37℃静置孵育40-60min,535nm激发光、612nm发射光，检测荧光值。结果见图7。如图7所示，候选抗体apm2-ca129.14-igg4与apm2-ca136.18-igg4在体外功能活性检测中与对照组ap-regn-igg4效果相当。实施例4.候选抗体体内实验4.1候选抗体对nhp血液脂质浓度的体内效应选择自发性肥胖食蟹猴，根据甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、高密度脂蛋白(hdl)、低密度脂蛋白(ldl)和非高密度脂蛋白(non-hdl)水平筛选出用于实验的食蟹猴，并对实验动物进行分组，分组后通过适当的座椅训练让实验动物适应实验环境，采用静脉注射的方式按照15mg/kg剂量给药，于给药前，给药后1天、2天、4天、7天、10天、12天、16天和20天采血，采血时，实验猴保定在猴椅后，从头静脉或隐静脉采集适量体积的全血至真空采集管内(促凝血清分离管(bdsst管))。采集后的血液常温放置至少30分钟以便血液凝结，然后在常温下离心，3500转/分钟，离心10分钟，分离的血清用于tg,tc,hdl,ldl,non-hdl的检测。检测结果参见图8a-图8e和表7-表11。如图8d所示，候选抗体apm2-ca136.18-igg4在食蟹猴体内使ldl下降的速率与比例均高于对照组ap-regn-igg4，说明候选抗体较对照组ap-regn-igg4可以有更优秀的降ldl能力。预示候选抗体apm2-ca136.18-igg4相较对照组ap-regn-igg4，能达到更好的药学效果。如图8e所示，候选抗体apm2-ca136.18-igg4在食蟹猴体内使non-hdl下降的速率与比例均高于对照组ap-regn-igg4，说明候选抗体较对照组ap-regn-igg4可以有更优秀的降non-hdl能力。预示候选抗体apm2-ca136.18-igg4相较对照组ap-regn-igg4，能达到更好的药学效果。表7.候选抗体对食蟹猴tg水平的影响值表8.候选抗体对食蟹猴tc水平的影响数值表9.候选抗体对食蟹猴hdl水平的影响数值表10.候选抗体对食蟹猴ldl水平的影响数值表11.候选抗体对食蟹猴non-hdl水平的影响数值4.2候选抗体在食蟹猴体内的pk活性食蟹猴静脉注射不同候选抗体后，并于给药前(0h)及给药后1min，30min，3h，6h，1d，2d，4d，7d，10d，14d经静脉取出全血样品，置血样收集管中，冰盒内让其自然凝固，于血样取出后8h内置离心机中，1000～3000g离心10min，分离血清，置样本保存管中，第14天再次静脉注射不同候选抗体，并于给药前(0h)及给药后1min(14d+1m)，30min(14d+30m)，3h(14d+3h)，6h(14d+6h)，1d(15d)，2d(16d)，4d(18d)，7d(21d)，10d(24d)，14d(28d)，21d(35d)，28d(42d)，经静脉取出全血样品，置血样收集管中，冰盒内让其自然凝固，于血样取出后8h内置离心机中，1000～3000g离心10min，分离血清，置样本保存管中，用elisa的方法检测抗体在食蟹猴体内的代谢情况，结果参见图9和表12。如图9所示，在食蟹猴体内，候选抗体apm2-ca136.18-igg4首次注射半衰期2.37天，优于对照组ap-regn-igg4的1.09天；候选抗体apm2-ca136.18-igg4末次注射半衰期7.16天，优于对照组ap-regn-igg4的1.11天；候选抗体apm2-ca136.18-igg4末次注射曲线下面积128.0μg/ml*d，优于对照组ap-regn-igg4的65.1μg/ml*d。说明候选抗体较对照组ap-regn-igg4有更优秀药代动力学表现。预示候选抗体apm2-ca136.18-igg4相较对照组ap-regn-igg4，能达到更好的药学效果。表12.食蟹猴静脉给予不同单抗后体内的动力学参数4.3候选抗体在食蟹猴体内的免疫原性检测以cbs包被液(ph9.6碳酸溶液)包被ap-ca129-14、ap-regn、ap-136-18抗体分别为0.25μg/ml，100ul/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入100x血清，100ul，37度孵育1h；然后加入ap-ca129-14-biotin、ap-regn-biotin、ap-136-18-biotin分别为0.25μg/ml，37℃孵育1h。洗掉，继而加入链霉素/hrp，37℃孵育1h；显色10min后，酶标仪上读取od450。结果参见图10。如图10所示，候选抗体apm2-ca136.18-igg4在食蟹猴体内未产生免疫原性，优于对照组ap-regn-igg4。说明候选抗体apm2-ca136.18-igg4较对照组ap-regn-igg4可以更少的引起免疫反应，减少对机体的毒性，也有利于保持血药浓度以达到更好的药学效果。序列表<110>山东博安生物技术有限公司<120>angptl3结合片段及其用途<150>201910495410.0<151>2019-06-10<150>201910495428.0<151>2019-06-10<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>107<212>prt<213>homosapiens<400>1aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysglnalaserglnaspileasnasntyr202530leuasntrptyrglnglnlysproglyglyalavallysleuleuile354045histyrthrserargleuhisthrglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrphethrileserserleuglnpro65707580gluaspilealathrtyrtyrcysglnglnalaasnthrleuprophe859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>2<211>114<212>prt<213>homosapiens<400>2glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu151015thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrasptyr202530glyilehistrpileargglnproproglylysglyleuglutrpleu354045valvaliletrpseraspglyserlysasntyrasnproserleulys505560serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu65707580lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala859095argasntyralametasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrval100105110serser<210>3<211>107<212>prt<213>homosapiens<400>3aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspileasnasntyr202530leuasntrptyrglnglnlysproglylysthrvallysleuleuile354045histyrthrserargleuhisthrglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrphethrileserserleuglnpro65707580gluaspilealathrtyrtyrcysglnglnalaasnthrleuprophe859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>4<211>114<212>prt<213>homosapiens<400>4glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu151015thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrasntyr202530glyvalhistrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile354045valalailetrpseraspglyserthrthrtyrasnproserleulys505560serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu65707580lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala859095argasntyralametasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrval100105110serser<210>5<211>6<212>prt<213>musmusculus<400>5glnaspileasnasntyr15<210>6<211>3<212>prt<213>musmusculus<400>6tyrthrser1<210>7<211>9<212>prt<213>musmusculus<400>7glnglnalaasnthrleuprophethr15<210>8<211>8<212>prt<213>musmusculus<400>8glypheserleuthrasptyrgly15<210>9<211>7<212>prt<213>musmusculus<400>9iletrpseraspglyserlys15<210>10<211>8<212>prt<213>musmusculus<400>10alaargasntyralametasptyr15<210>11<211>8<212>prt<213>musmusculus<400>11glypheserleuthrasntyrgly15<210>12<211>7<212>prt<213>musmusculus<400>12iletrpseraspglyserthr15<210>13<211>327<212>prt<213>homosapiens<400>13alaserthrlysglyproservalpheproleualaprocysserarg151015serthrsergluserthralaalaleuglycysleuvallysasptyr202530pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser354045glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser505560leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrlysthr65707580tyrthrcysasnvalasphislysproserasnthrlysvalasplys859095argvalgluserlystyrglyproprocysproprocysproalapro100105110glupheleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolys115120125aspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalval130135140aspvalserglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalasp145150155160glyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnphe165170175asnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasp180185190trpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleu195200205proserserileglulysthrileserlysalalysglyglnproarg210215220gluproglnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthrlys225230235240asnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproserasp245250255ilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlys260265270thrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrser275280285argleuthrvalasplysserargtrpglngluglyasnvalpheser290295300cysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysser305310315320leuserleuserleuglylys325<210>14<211>126<212>prt<213>homosapiens<400>14gluvalglnleuvalgluserglyglyglyvalileglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspasptyr202530alametasntrpvalargglnglyproglylysglyleuglutrpval354045seralaileserglyaspglyglyserthrtyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralaphephetyrcys859095alalysaspleuargasnthrilepheglyvalvalileproaspala100105110pheaspiletrpglyglnglythrmetvalthrvalserser115120125<210>15<211>107<212>prt<213>homosapiens<400>15aspileglnmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnserileargsertrp202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrlysalaserserleugluserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnpro65707580aspaspphealathrtyrtyrcysglnglntyrasnsertyrsertyr859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>16<211>107<212>prt<213>homosapiens<400>16argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu151015glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe202530tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln354045serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser505560thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu65707580lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser859095provalthrlysserpheasnargglyglucys100105当前第1页12