合成2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用与流程

文档序号：21995696发布日期：2020-08-25 19:37阅读：1095来源：国知局

本发明涉及一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术：

人乳低聚糖(humanmilkoligosaccharides,hmos)是一类构成母乳特有的复合碳水化合物，通过刺激新生儿中有益肠道细菌如双歧杆菌和乳酸杆菌的生长，平衡肠道菌群的发育可能对调节新生儿出生后免疫系统起重要作用，作为先进婴儿配方食品的功能性成分非常重要。此外，hmos可以抑制病原体与上皮细胞表面聚糖的粘附，从而限制一些病原体的毒力。根据组成hmos的单糖结构单元，hmos可分为中性岩藻糖基乳糖，酸性唾液酸乳糖和中性非岩藻糖基化乳糖三种。在多种hmos寡糖结构类别中，大约50％的hmos是岩藻糖基化的，而2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose,2'-fl)是目前最具有潜力的一种岩藻糖基乳糖，已被美国食品和药物管理局(fda)批准为安全的食品添加剂，可作为高档婴幼儿配方食品中的营养添加剂。岩藻糖基化的2'-fl可通过α-1,2-岩藻糖基转移酶，以gdp-l-岩藻糖(gdp-l-fucose,gdp-l-fuc)为供体、乳糖为底物催化合成。

目前，2'-fl的生产方法主要有化学合成法、酶合成法和生物合成法。在化学合成法中，由于使用高浓度的有毒试剂，会对环境造成一定的污染。在酶法合成中，2'-fl的催化合成需要昂贵的gdp-l-fuc前体试剂，这大幅增加了生产成本。而生物合成法是利用细菌合成gdp-l-fuc前体，并在α-1,2-岩藻糖基转移酶的作用下，以环境友好的方式自身代谢合成2'-fl。因此，生物合成法具有更好的工业应用前景，并受到越来越多研究者的青睐。例如，研究者利用岩藻糖补救途径可以实现在酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)中合成2'-fl，但由于酿酒酵母的发酵周期较长，限制了其在工业生产的广泛应用。

大肠杆菌mg1655能够内源性地合成2'-fl的前体物质gdp-l-fuc，在外源α-1,2-岩藻糖基转移酶和底物乳糖的催化作用下合成岩藻糖基化的2'-fl(如图1所示)。然而，在以葡萄糖或甘油为碳源的内源性从头合成途径中，gdp-l-fuc同时也是合成荚膜异多糖酸的中间体。因此，2'-fl的合成前体gdp-l-fuc容易被其他竞争途径所消耗，导致大肠杆菌mg1655合成2'-fl所需的前体gdp-l-fuc的含量非常有限。虽然在目前研究中，多种策略包括过表达与辅因子相关酶的基因、删除代谢竞争途径上的相关基因等，被用来提高2'-fl的产量，但这些方法构建的质粒容易对菌体造成一定的代谢负担，从而使细胞在生产过程中容易出现质粒丢失的情况。因此，为在发酵过程中产生更稳定的工程菌株，可以将与2'-fl和gdp-l-fuc合成相关的基因敲入到大肠杆菌的基因组上，以构建生产2'-fl的无质粒重组大肠杆菌。但是目前整合到基因组上构建的菌株合成2'-fl的产量较低，不能适用于工业化生产。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种合成2'-岩藻糖基乳糖的无质粒重组大肠杆菌，通过在大肠杆菌mg1655的鞭毛驱动蛋白基因flir位点整合外源α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，进一步将岩藻糖激酶的基因敲入至大肠杆菌mg1655基因组l-墨角藻糖激酶基因fuck位点，并敲除大肠杆菌mg1655上乳糖操纵子中的转录阻遏物基因laci，获得了可高效合成2'-fl的无质粒工程菌株，其胞内胞外积累总量达到806.2mg/l。

本发明的第一个目的是提供一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌的鞭毛驱动蛋白基因flir位点整合α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，在l-墨角藻糖激酶基因fuck位点整合岩藻糖激酶的基因，并敲除大肠杆菌上乳糖操纵子中的转录阻遏物基因laci。

进一步地，所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶的整合片段核苷酸序列如seqidno.1所示。

进一步地，所述的岩藻糖激酶的整合片段核苷酸序列如seqidno.2所示。

进一步地，所述的转录阻遏物基因laci的敲除片段核苷酸序列如seqidno.3所示。

进一步地，所述的大肠杆菌为大肠杆菌mg1655。

本发明的第二个目的是提供所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

s1、构建包含鞭毛驱动蛋白基因flir位点的上下游同源臂、p11启动子和α-1,2-岩藻糖基转移酶基因组成的整合片段，与包含ptarget质粒共同转入带有pcas9质粒的大肠杆菌mg1655感受态中，构建重组大肠杆菌mg1655△flir::futc；所述的ptarget质粒包含鞭毛驱动蛋白基因flir的n20序列的sgrna，所述的pcas9质粒用于表达cas9蛋白；

s2、构建包含由l-墨角藻糖激酶基因fuck位点的上下游同源臂、p11启动子和岩藻糖激酶基因组成的整合片段，与包含ptarget质粒共同转入到带有pcas9质粒的重组大肠杆菌mg1655△flir::futc感受态中，构建重组大肠杆菌mg1655△flir::futc,△fuck::fkp；所述的ptarget质粒包含l-墨角藻糖激酶基因fuck的n20序列的sgrna，所述的pcas9质粒用于表达cas9蛋白；

s3、构建包含由乳糖操纵子转录阻遏物基因laci位点的上下游同源臂组成的敲除片段，与包含ptarget质粒共同转入到带有pcas9质粒的重组大肠杆菌mg1655△flir::futc,△fuck::fkp感受态中，构建重组大肠杆菌mg1655△flir::futc,△fuck::fkp,△laci；所述的ptarget质粒包含乳糖操纵子转录阻遏物基因laci的n20序列的sgrna，所述的pcas9质粒用于表达cas9蛋白。

本发明的第三个目的是提供所述的重组大肠杆菌发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的方法。

进一步地，所述的方法包括如下步骤：

s1、将重组大肠杆菌单菌落接种在种子培养基中培养8～12h，制备成种子液；

s2、将种子液以0.5～2％的接种量接种至发酵培养基中，于35～38℃、200～250r/min条件下培养5～10h后，添加l-岩藻糖1～5g/l、乳糖1～5g/l，继续发酵至60～80h，分离发酵液得到2'-岩藻糖基乳糖。

进一步地，所述的种子培养基包括胰蛋白胨8～12g/l、酵母粉4～6g/l、nacl8～12g/l。

进一步地，所述的发酵培养基包括甘油3～5g/l、胰蛋白胨10～15g/l、酵母粉20～30g/l、磷酸氢二钾12～13g/l、磷酸二氢钾2～2.5g/l。

本发明的有益效果：

通过在大肠杆菌mg1655的鞭毛驱动蛋白基因flir位点整合外源α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，进一步将岩藻糖激酶的基因敲入至大肠杆菌mg1655基因组l-墨角藻糖激酶基因fuck位点，并敲除大肠杆菌mg1655上乳糖操纵子中的转录阻遏物基因laci，获得了可高效合成2'-fl的无质粒工程菌株，其胞内胞外总量达到806.2mg/l。

附图说明

图1为2'-fl的重组大肠杆菌合成代谢途径图；

图2为本发明通过融合pcr得到的用于基因敲入和基因敲除片段的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例1通过lc-ms定性检测2'-fl的结果图；

图4为本发明实施例4通过hplc检测2'-fl和底物乳糖的结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

涉及的检测方法：

为检测本发明所述的无质粒重组大肠杆菌合成的2'-fl，实施例1中采用液相色谱-质谱联用仪(lc-ms)定性检测重组大肠杆菌发酵液中2'-fl的合成，通过质谱扫描质荷比m/z为487的离子碎片来确定发酵液中2'-fl的合成。实施例4中采用高效液相色谱(hplc)系统(agilenttechnologies1260系列)定量检测重组大肠杆菌发酵液中2'-fl的合成，通过rezexroa有机酸柱(phenomenex,torrance,ca,usa)测定发酵液中2'-fl和底物乳糖的浓度。hplc检测器为示差检测器，色谱柱的检测温度设置为55℃，流动相通过0.01n稀h2so4洗脱，检测流速为0.6ml/min。

实施例1：整合外源α-1,2-岩藻糖基转移酶

(1)制备带有pcas9质粒的大肠杆菌mg1655感受态

首先将pcas9质粒转化至大肠杆菌mg1655中，涂布在50μg/ml的卡那霉素平板上，30℃培养12h后挑取平板上的单菌落，接种于新鲜lb培养基，添加终浓度为50μg/ml的卡那霉素抗生素，30℃、220r/min过夜培养；将过夜培养的菌液按1％的接种量转接至含有50mllb培养基的250ml锥形瓶中，待菌体od600达到0.2时，添加终浓度为20-30mmol/l的阿拉伯糖诱导pcas9质粒表达重组酶；继续培养至od600为0.6-0.7时，将菌液冰浴20min后，于5000r/min离心收集菌体细胞；用预冷的灭菌水洗涤细胞2次，倒掉上清液，用400-500μl预冷的10％甘油悬浮菌体，制备带有pcas9质粒的大肠杆菌mg1655感受态备用。

(2)制备用于基因敲入的整合片段

根据ncbi上公布的幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori，atccno.26695)的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futc序列，利用融合pcr技术获得由鞭毛驱动蛋白基因flir位点上下游同源臂、p11启动子和α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futc组成的整合片段haflir-p11-futc，并通过dna凝胶电泳验证融合片段的长度(图2)；然后利用网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计flir基因的n20序列，从而构建包含flir基因的sgrna的ptarget-flir质粒。

将上述获得的整合片段haflir-p11-futc与ptarget-flir质粒共同电转到带有pcas9质粒的大肠杆菌mg1655感受态中，加入800μl的lb培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行pcr验证及dna测序验证，确认外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因成功整合至大肠杆菌基因组鞭毛运动蛋白基因flir位点，得到无质粒的重组大肠杆菌mg1655△flir::futc。

(3)整合片段与ptarget质粒的共转化

将上述获得的整合片段haflir-p11-futc与ptarget-flir质粒按照2:1的质量共同电转到带有pcas9质粒的大肠杆菌mg1655感受态中，立即加入800μl的lb培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h后，涂布在含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)抗生素的平板上，于30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行pcr验证及dna测序验证，确认外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futc成功整合至大肠杆菌基因组鞭毛运动蛋白基因flir位点上，得到无质粒的重组大肠杆菌mg1655△flir::futc。

对比例1：

制备带有pcas9质粒的大肠杆菌mg1655感受态，步骤同实施例1。

通过融合pcr技术获得由鞭毛驱动蛋白基因flhd位点上下游同源臂、p11启动子和α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futc组成的整合片段haflhd-p11-futc；利用网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计flhd基因的n20序列，从而构建包含flhd靶基因的sgrna的ptarget-flhd质粒。

将上述获得的整合片段haflhd-p11-futc与ptarget-flhd质粒共同电转到带有pcas9质粒的大肠杆菌mg1655感受态中，加入800μl的lb培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布在含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行pcr验证及dna测序验证，确认外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futc成功整合至大肠杆菌基因组鞭毛运动蛋白基因flhd位点，得到无质粒的重组大肠杆菌mg1655△flhd::futc。

对比例2：

制备带有pcas9质粒的大肠杆菌mg1655感受态，步骤同实施例1。

通过融合pcr技术获得由鞭毛驱动蛋白基因mota位点上下游同源臂、p11启动子和α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futc组成的整合片段hamota-p11-futc，并通过dna凝胶电泳验证融合片段的长度(图2)；然后利用网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计mota基因的n20序列，从而构建包含mota靶基因的sgrna的ptarget-mota质粒。

将上述获得的整合片段hamota-p11-futc与ptarget-mota质粒共同电转到带有pcas9质粒的大肠杆菌mg1655感受态中，加入800μl的lb培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行pcr验证及dna测序验证，确认外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因成功整合至大肠杆菌基因组鞭毛运动蛋白基因mota位点，得到无质粒的重组大肠杆菌mg1655△mota::futc。

上述实施例1、对比例1和对比例2中构建的重组大肠杆菌均采用液相色谱-质谱联用仪(lc-ms)来定性检测发酵液中2'-fl的合成，在发酵液中检测到与2'-fl标准品(500mg/l)具有相同的保留时间，保留时间为3.3min，并且在该保留时间下的质荷比m/z为487，如图3所示。因此，可以确定该保留时间对应的化合物是2'-fl。结果显示应该在鞭毛运动蛋白基因flir位点插入α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futc。

实施例2：整合外源岩藻糖激酶

制备带有pcas9质粒的大肠杆菌mg1655△flir::futc感受态，步骤同实施例1。

根据ncbi上公布的脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis，atccno.25285)的岩藻糖激酶基因fkp序列，通过融合pcr技术获得由l-墨角藻糖激酶基因fuck位点上下游同源臂、p11启动子和岩藻糖激酶基因组成的整合片段hafuck-p11-fkp，并通过dna凝胶电泳验证融合片段的长度(图2)；然后利用网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计fuck基因的n20序列，从而构建包含fuck靶基因的sgrna的ptarget-fuck质粒。

将上述获得的整合片段hafuck-p11-fkp与ptarget-fuck质粒共同电转到带有pcas9质粒的大肠杆菌mg1655感受态中，加入800μl的lb培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行pcr验证及dna测序验证，确认外源岩藻糖激酶基因成功整合至l-墨角藻糖激酶基因fuck位点，得到无质粒的重组大肠杆菌mg1655△flir::futc,△fuck::fkp。

实施例3：基因敲除抑制乳糖通透酶的转录阻遏物基因

制备带有pcas9质粒的大肠杆菌mg1655△flir::futc,△fuck::fkp感受态，步骤同实施例1。

利用融合pcr获得抑制乳糖通透酶的转录阻遏物基因laci的上下游同源臂组成的敲除片段halaci，并通过dna凝胶电泳验证融合片段的长度(图2)；然后利用网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计laci基因的n20序列，从而构建包含靶基因laci的sgrna的ptarget-laci质粒。

将上述获得的敲除片段halaci与ptarget-laci质粒共同电转到带有pcas9质粒的大肠杆菌mg1655感受态中，加入800μl的lb培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行pcr验证及dna测序验证，确认敲除抑制乳糖通透酶的转录阻遏物基因laci，得到无质粒的重组大肠杆菌mg1655△flir::futc,△fuck::fkp,△laci。

实施例4：摇瓶发酵生产2'-fl

将上述大肠杆菌mg1655△flir::futc,△fuck::fkp,△laci制成种子液，种子液培养基为lb培养基(胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养10h。然后将种子液按1％的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基为tb培养基，其配方是：甘油4g/l、胰蛋白胨12g/l、酵母粉24g/l、磷酸氢二钾12.54g/l、磷酸二氢钾2.31g/l，于37℃、220r/min条件下培养7h后，添加l-岩藻糖2g/l、乳糖2g/l至摇瓶，继续摇瓶发酵至72h。

发酵结束时，采用高效液相色谱仪(hplc)测定菌体胞外和胞内的2'-fl总量以及发酵液中乳糖的剩余量。首先将2ml发酵液在12000rpm下离心15min后，收集上清液，通过hplc检测细胞外2'-fl和乳糖的浓度。为了确定细胞内2'-fl的浓度，用去离子水悬浮沉淀，随后在100℃下煮沸2min，于12000rpm下离心15min取上清液，最后采用hplc检测细胞内2'-fl的浓度。2'-fl和乳糖的hplc检测结果如图4所示，最终测定重组大肠杆菌mg1655△flir::futc,△fuck::fkp,△laci胞外和胞内的2'-fl总量达到806.2mg/l，而目前外源整合岩藻糖基转移酶合成2'-fl的产量仅为387mg/l，此外，乳糖的消耗达到0.93g/l。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>江南大学

<120>合成2'-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<213>（人工序列）

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