一种抗RNF138单克隆抗体的制备方法及其应用与流程

本发明属于生物技术、免疫学领域，涉及一种抗rnf138单克隆抗体的制备方法及其应用。
背景技术：
：rnf138(ringfinger138)位于第18号染色体，由7个外显子组成(geneid：51444)，包含一个ring结构域，3个znf结构域和1个uim结构域。为含有ringfinger结构的蛋白家族成员，该家族蛋白与锌指蛋白家族类似，通过蛋白-蛋白、蛋白-dna相互作用，参与许多生理功能调节及肿瘤的发生，其作为e3泛素连接酶可通过诱导wnt信号通路中核内转录因子tcf/lef泛素化进而调节细胞的增殖、凋亡、信号传导等(nielseno,bjerrumj,csillagc,etal.influenceofsmokingoncolonicgeneexpressionprofileincrohn'sdisease[j].plosone.2009,4:6210.)。前期研究发现，其家族中的环指蛋白rnf13、rnf5分别与胰腺癌、乳腺癌等发病及病情进展相关(xianglanjin,hecheng,jiechen,dahaizhu.rnf13:anemergingringfingerubiquitinligaseimportantincellproliferation[j].thefebsjournal.2011,278:78-84.)。目前进行rnf138蛋白的检测多使用市售的抗体，但是市售的抗体多为多克隆抗体，检测时杂带多，特异性不强，不能用于免疫共沉淀的检测。本申请拟通过筛选杂交瘤细胞株获得抗rnf138的单克隆抗体，以期实现rnf138蛋白的特异性检测以及与rnf138蛋白相关的疾病的特异性诊断和治疗。技术实现要素：为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分泌抗rnf138蛋白的杂交瘤细胞株和抗rnf138蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明的第一方面提供了一种分泌抗rnf138蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株命名为sw308-1,9g12；生物保藏编号为cgmccno.19676。本发明的第二方面提供了本发明第一方面所述的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：1)通过原核表达得到rnf138的重组蛋白；2)将rnf138的重组蛋白作为免疫原免疫动物；3)收集免疫动物的脾脏细胞，与骨髓瘤细胞进行融合；4)通过有限稀释法进行亚克隆，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。进一步，所述重组蛋白具有如seqidno.1所示的序列。本发明的第三方面提供了一种源自rnf138的抗原，所述抗原具有如seqidno.1所示的序列。本发明的第四方面提供了一种特异性识别、靶向rnf138蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体由本发明第一方面所述的杂交瘤细胞株分泌得到。进一步，所述单克隆抗体的亚型为igg2a。本发明的第五方面提供了所述单克隆抗体的亚型为igg2a。1)本发明第三方面所述的抗原制备抗rnf138抗体和/或分泌抗rnf138蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株中的应用；2)本发明第三方面所述的抗原在制备检测抗rnf138抗体的产品中的应用；3)本发明第三方面所述的抗原在制备疫苗和/或监控疫苗质量中的应用；4)本发明第四方面所述的单克隆抗体在制备检测rnf138蛋白的试剂中的应用；5)本发明第四方面所述的单克隆抗体在制备诊断与rnf138相关的疾病的试剂中的应用；6)本发明第四方面所述的单克隆抗体在制备治疗与rnf138相关的疾病的产品中的应用。进一步，4)或5)中所述的试剂通过免疫印迹法、免疫组化法、免疫荧光法、免疫沉淀法检测样本中rnf138蛋白的表达。进一步，免疫印迹法检测样本中rnf138蛋白的表达的单克隆抗体的使用浓度为1:500-1:2000。进一步，免疫组化法检测样本中rnf138蛋白的表达的单克隆抗体的使用浓度为1:100-1:500。进一步，免疫荧光法检测样本中rnf138蛋白的表达的单克隆抗体的使用浓度为1:100-1:200。进一步，免疫沉淀法检测样本中rnf138蛋白的表达的单克隆抗体的使用浓度为1:50。本发明的第六方面提供了一种检测rnf138蛋白的产品，所述产品包括本发明第四方面所述的单克隆抗体。本发明的第七方面提供了一种治疗与rnf138蛋白相关的疾病的药物组合物，所述药物组合物包括本发明第四方面所述的单克隆抗体。本发明的优点和有益效果：本发明提供了一种分离的多肽或者抗原，其对应着人rnf138蛋白全长序列的第60-245位的氨基酸残基，具有如seqidno.1所示的氨基酸序列，该多肽较小，免疫动物不会干扰抗体对抗原表位的识别，且采用该抗原制备的抗体具有较高的特异性。本发明提供了一种抗rnf138的单克隆抗体，该抗体相对于市售的抗体，能够有效的识别目的条带，可以应用于ihc、if、wb以及现有抗体很难实现的ip的检测。生物材料保藏说明名称：人源杂交瘤细胞株sw308-1,9g12；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏单位简称：cgmcc；保藏编号：cgmccno.19676；保藏日期：2020年4月15日保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号附图说明图1是重组蛋白的检测结果图；其中ui表示未诱导，i表示iptg诱导，s表示诱导菌液裂解上清，p表示诱导菌液裂解沉淀，每个样品重复上样两次。图2是rnf138-pet-28a的表达纯化图，其中，1表示上清，2表示沉淀，3表示包涵体裂解液上清，4表示包涵体裂解液沉淀，5表示溶胶液，6、7、8表示透析液，9表示蛋白浓缩液。图3是不同细胞的免疫荧光检测结果图，其中图a是hct116细胞，图b是293t细胞。图4是不同来源的组织的免疫组化图，其中h表示人类，m表示鼠。图5是不同抗体的wb图，其中，图a是兔源多克隆抗体rnf138(abcam)的wb图，wt表示野生型，ko表示rnf138基因敲除；图b是兔源多克隆抗体rnf138(bethyl和santa)检测hct116细胞系的wb图，+表示野生型，+/-表示rnf138dna单链敲除，-/-表示rnf138dna双链敲除；图c是兔源多克隆抗体rnf138(bethyl和santa)检测小鼠组织的wb图，ra1表示rnf138基因敲除，ral2表示野生型；图d是本申请的单克隆抗体的检测hct116细胞系和小鼠睾丸组织的wb图，wt表示野生型，ko表示rnf138基因敲除。图6是细胞总蛋白和核蛋白进行免疫共沉淀实验图；其中，图a是细胞总蛋白的免疫共沉淀图；图b是细胞核蛋白的免疫共沉淀图。具体的实施方式为了制备特异性强，中和效价高的抗rnf138蛋白的抗体，本发明通过制备rnf138重组蛋白来免疫动物，从而获得分泌阳性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，进而纯化得到特异性高的单克隆抗体。术语“单克隆抗体”是指具有单一分子组成的抗体分子，获自一群基本相同的抗体。该单克隆抗体显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。典型地，免疫球蛋白具有重链和轻链。各重链和轻链包含恒定区和可变区(区域也称为"域")。轻链和重链可变区包含四个框架区，被三个超变区打断，也称为"互补决定区"(cdr)。cdr主要负责结合到抗原的表位。各链的cdr通常为cdr1、cdr2和cdr3，从n末端开始连续编号，通常也用特定cdr所处的链标识。本发明的单克隆抗体还包括该抗体的功能性变异体，所述功能性变异体可结合至rnf138蛋白，且具有抗所述亚型或片段的中和活性。具体地，如果功能性变异体包括(但并不限于)：在一级结构序列中基本类似、但包含本发明的亲本单克隆抗体中没有的例如体外或体内的化学和/或生物化学的改性的衍生物。这些改性包括例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化等。可选择地，功能性变异体可为如下的单克隆抗体：与亲本单克隆抗体的氨基酸序列相比，包括含有一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失或其组合的氨基酸序列。进一步地，功能性变异体可在氨基末端或羧基末端的其中一端或两端包括氨基酸序列的截短。与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体可能具有相同或不同、较高或较低的结合亲和力，但仍能够键合至rnf138蛋白。例如，与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体对rnf138蛋白可具有升高或降低的结合亲和力。优选地，包括但并不限于构架区域、高可变区域、尤其是cdr3区域的可变区域的氨基酸序列被改性。通常，轻链或重链区域包括三个高可变区域(包括三个cdr)和更保守的区域(所谓的构架区域(fr))。高可变区域包括来自cdr的氨基酸残基和来自高可变环的氨基酸残基。可将本领域技术人员已知的计算机算法诸如gap或bestfit用于最优化地比对要对比的氨基酸序列，且定义相似或相同的氨基酸残基。可通过本领域已知的通用的分子生物学方法(包括pcr、寡核苷酸定点诱变(oligonucleotide-directedmutagenesis)和定点诱变(site-directedmutagenesis))改变亲本单克隆抗体或其部分，或通过有机合成方法获得功能性变异体。本领域技术人员还将理解的是，本发明涵盖所述rnf138蛋白抗体的氨基酸序列修饰。举例而言，可需要改良抗体之结合亲和力及/或其它生物学特性。rnf138蛋白抗体之氨基酸序列变体是由向rnf138蛋白抗体核酸中引入适当核苷酸变化或由肽合成制备。该等修饰包括(例如)rnf138蛋白抗体氨基酸序列内之残基缺失及/或插入及/或取代。进行缺失、插入及取代之任何组合以达成最终构建体，其限制条件为该最终构建体具有所要特征。氨基酸变化亦可改变rnf138蛋白抗体之转译后过程，诸如改变糖基化位点之数目或位置。本发明对表达载体没有特别的限制，但可以是能在包括哺乳动物细胞(例如，人、猴、兔、大鼠、仓鼠或小鼠细胞)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞(如大肠杆菌(e.coli))在内的真核或原核细胞内复制和/或表达多核苷酸的载体。较佳地，它可以是载体，包括至少一选择性标记，可操作地连接到合适的启动子，以致可以在宿主细胞内表达多核苷酸。例如，载体可以包括导入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或反转录病毒载体的多核苷酸。本发明中的用于导入载体的细胞包括原核细胞和真核细胞，上述细胞包含(但并不限于)细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌；酵母细胞；真菌细胞如毕赤酵母；昆虫细胞如果蝇或夜蛾sf9细胞；动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞，sp2/0，人淋巴样母细胞，cos，nso，293t，bowes黑素瘤细胞，ht-1080，bhk(幼仓鼠肾细胞)，hek(人胚肾细胞)，perc.6(人视网膜细胞)等；和植物细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。术语“导入”是指将包括编码单克隆抗体的多核苷酸的载体递送入宿主细胞。此导入可以通过本领域中已知的各种方法，包括磷酸钙-dna共沉淀，deae-葡聚糖介导的转染，聚凝胺介导的转染，电穿孔，显微注射，脂质体介导的转染，脂质体融合，脂转染和原生质体融合进行。此外，转染是指用病毒颗粒通过感染将期望材料递送入细胞。此外，该载体可以通过基因轰击导入宿主细胞。在本发明中，导入与转染可以互换使用。本发明的重组细胞接着可以用于表达以及培养目的，用于大量药物生产的抗体表达。还可以用作药物组合物的活性成分。可以使用任何适当的培养技术，包括但是不局限于静置培养、转瓶培养、腹水流体、中空纤维型生物反应盒、模块化小型发酵罐、搅拌槽、微载体培养、陶瓷芯灌注等等。本发明的抗体识别的表位可以有多种用途。纯化或合成形式的表位和其模拟表位(mimotope)可以用于提高免疫应答(即，作为疫苗，或用于其他用途的抗体的生产)或用于患者血清抗体的筛选，该抗体可以与表位或其模拟表位发生免疫反应。在一实施方式中，这样的表位或模拟表位，或含有这样的表位或模拟表位的抗原可以用作引起免疫应答的疫苗。本发明的抗体和其抗原结合片段也可以用在监控疫苗质量的方法中。特别地，该抗体可以用于检查疫苗中抗原是否含有正确构象的正确免疫原性表位。表位在筛选与所述表位结合的配体时也是非常有用的。此类配体，包括但是不局限于那些来自于骆驼、鲨鱼和其他物种的抗体、抗体片段、肽、噬菌体展示技术产物、适体、其他病毒或细胞蛋白adnectin或片段，它们可以封闭表位并因此防止感染。此类配体包含在本发明的范围之类。作为一种可选择的实施方式，本发明中的产品包括本发明所制备的抗体或其抗原结合片段。作为另外一种可选择的实施方式，本发明的产品包括诊断组合物，所述诊断组合物包括至少一种可检测的标签，诸如可检测的部分/试剂。标签可非共价地缀合至本发明的单克隆抗体。标签还可通过共价键直接缀合至单克隆抗体。可选择地，标签可利用一种或多种连接化合物缀合至上述单克隆抗体。用于将标签缀合至单克隆抗体的技术对本领域的技术人员是公知的。作为标签的可检测的部分/试剂优选为选自由(但并不限于)酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射材料和非放射性的顺磁金属离子组成的组中的一种。本发明中的药物组合物包括本发明的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。载体本身不应该诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体，且不应该是毒性的。适当的载体可以是大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒颗粒。也可以是药学上可接受的盐，例如，无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。药学上可接受的载体可以还包含液体，例如水、生理盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质(例如润湿剂或乳化剂或ph缓冲液物质)可以出现在此组合物中。这些载体使药物组合物能被制成片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、浆料和悬浮液，用于患者摄取。本发明的药物组合物可以通过任意多种途径给药，其包括但不局限于：口服、静脉注射、肌肉内注射、动脉内注射、髓内注射、腹腔内注射、鞘内注射、心脑内、透皮、经皮肤、外用、皮下、鼻内、肠内、舌下、阴道内或直肠途经。无针注射器(hypospray)也可以用于施用本发明药物组分。典型地，治疗组合物可以制备成可注射的液体溶液或悬浮液。也可以制备成适于溶于液体载体中的溶液或悬浮液的注射前固体形式。组合物的直接输送通常是通过注射、皮下注射、腹膜内注射、静脉注射或肌肉内注射完成，或输送到组织的胞间系。组合物还可以在损伤处施用。治疗剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。已知的基于抗体的药物提供关于给药频率的说明，例如药物是否需要每天、每周、每月等给药。频率和剂量也同样视症状的严重程度而定。本发明的药物组合物可以制备成不同的类型。例如，组合物可以制备成可注射的溶液溶液或悬浮液。也可以制备成适于溶于液体载体中的溶液或悬浮液的注射前固体形式(例如冻干组合物，用于重配含防腐剂的无菌水)。组合物可以制备用于局部给药，例如作为软膏、乳膏或粉末。组合物可以制备用于口服给药，例如作为片剂或胶囊，作为喷雾，或作为糖浆(可选有味道的)。组合物可以制备用于经肺给药，例如作为吸入物，采用精细粉末或喷雾。组合物可以制备作为栓剂或子宫托。组合物可以制备用于经鼻、耳或眼给药，例如作为滴液。组合物可以是试剂盒的形式，设计成在向患者给药前重配混合的组合物。例如，可以提供试剂盒形式的冻干抗体，以及无菌水或无菌缓冲液。可以理解，组合物的活性成分将是抗体分子、抗原结合片段或突变体和其衍生物。因此，其容易在消化道降解。因此，如果组合物是通过消化道途径给药，组合物将需要包含保护抗体降解的试剂，但是一旦抗体释放就能从消化道吸收。下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1免疫原的制备1、重组表达质粒的构建以rnf138全长cdna为模板，pcr获得对应于rnf138第60-245位的片段，氨基酸序列如seqidno.1所示，将上述片段插入pet-28a(含his标签)的表达载体中，测序验证序列正确。2、重组表达质粒蛋白表达将表达质粒转化到大肠杆菌并扩增，用iptg诱导蛋白表达，并用sds-page检测诱导前后目的蛋白的表达情况，结果如图1所示，显示rnf138(60-245aa)成功表达。3、纯化切胶回收，首先将蛋白进行8％sds-page凝胶电泳，考马斯亮蓝染色后，切下目标条带，常温中研磨成粉末，加入8m尿素溶解液，混合均匀在37℃温浴1个小时后12,000rpm离心5min，然后取上清，加入复性液，进行透析复性后浓缩。蛋白表达纯化结果如图2所示，从图中可以看出，浓缩后得到单一的目的条带。实施例2动物免疫以及杂交瘤细胞的制备将实施例1获得的浓缩后的蛋白免疫5只大鼠，一段时间后，处死大鼠取出脾脏，制备脾脏悬液，与骨髓瘤细胞在促融剂乙二醇的作用下融合，在hat培养基中筛选培养，获得杂交瘤细胞株；通过有限稀释方式，获得单克隆细胞株，扩大培养，获得细胞上清，筛选阳性细胞株。将鉴定成功的细胞株注入balb/c小鼠腹腔中，收集腹水后纯化获得单克隆抗体，可直接使用，也可加入甘油，在-20℃长期保存。阳性杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的亚型以及纯化浓度如表1所示。该阳性杂交瘤细胞株进行了保藏，杂交瘤细胞株命名为：sw308-1,9g12。保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.19676；保藏日期为：2020年4月15日。表1单克隆抗体的浓度及亚型实施例3单克隆抗体的功能检测采用本申请的单克隆抗体，进行人源、小鼠源的wb、ihc、人源if，以及人源ip实验，研究该单克隆抗体的检测效能。1、细胞免疫荧光实验(if)1.1实验试剂①1×pbs(ph7.4)：高压灭菌，4℃保存备用，下述实验涉及pbs未另加说明则均同此法。②4％多聚甲醛固定液：60mlpbs中加入4g多聚甲醛，60-80℃水浴中加入1mol/l的naoh至溶解透明，待溶液冷却至55℃时，用hcl将ph值调至7.0，最后用pbs定容至100ml。③透化液：0.5％triton/pbs④封闭液：10％bsa/pbs⑤含dapi的封片剂1.2实验步骤①固定：pbs清洗细胞2次，4％多聚甲醛室温固定10min；②pbs漂洗：pbs漂洗3次，每次5min；③细胞透化：室温下用透化液处理10min；④细胞洗涤：pbs漂洗3次，每次5min；⑤封闭：室温封闭30min；。⑥一抗孵育：在parafilm膜上滴加50μl以pbs按一定倍数稀释的一抗(一般1：50-200稀释)(双免疫荧光同时加两种抗体)，将盖玻片有细胞的一侧朝下孵于一抗上，密封于湿盒中，4℃过夜；⑦洗涤：pbs漂洗3次，每次5min；⑧二抗孵育：在parafilm膜上滴加50μl以pbs按一定比例稀释的荧光标记的二抗(双免疫则同时加两种抗体)(一般以1：500稀释)，密封于湿盒中，室温1h；⑨洗涤：pbs漂洗3次，每次5min；⑩封片：取一滴含dapi封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，反应15-20min后，四周用指甲油封住；用荧光显微镜观察，并尽快用confocal激光共聚焦显微镜照相。注：从二抗开始所有操作均需避光；封片过程中不要产生气泡。1.3结果免疫荧光结果如图3所示，在人源结直肠癌细胞系hct116和293t细胞中进行免疫荧光，igg组作为阴性对照，没有出现荧光信号；rnf138组出现荧光信号，且定位于细胞核中，其他地方没有背景信号干扰，抗体特异性强。红色表示抗体阳性信号，蓝色表示dapi，洋红色表示红色信号和蓝色信号merge。2、免疫组化实验(ihc)2.1实验试剂①tris-edta抗原修复液(ph9.0)：取tris3.027g、edta0.146g溶于450ml去离子水中，用hcl调节ph至9.0，定容至500ml，现用现配；②柠檬酸抗原修复液(ph6.0)：柠檬酸0.4g，柠檬酸钠或者柠檬酸三钠3g，加蒸馏水至1000ml，现用现配；③二抗和dab显色液均购自中杉金桥公司2.2实验步骤①将切片置于60℃烤箱中烤片1h，然后在二甲苯i、二甲苯ii中各脱蜡30min；②将脱蜡后的切片依次放入梯度酒精中：100％、95％、90％、80％、70％、50％，每个梯度各5min，最后浸于pbs中；③将切片放入96℃预热的抗原修复液中(抗原修复液根据检测蛋白的特性选择，一般tris-edta抗原修复液检测核蛋白比较好，柠檬酸抗原修复液检测胞浆蛋白较好)，放入后开始计时10min。加热过程中，采用不锈钢杯子装抗原修复液并在电磁炉上加热，待温度达到96℃后，调节电磁炉火力，使抗原修复液温度维持在94-96℃。10min后将不锈钢杯子从电磁炉上拿下，冷却至室温。注意：在该过程中，切片不能从不锈钢杯子中取出；④修复液冷却后，将片子取出，放在tbs中洗5min，再转入tbst中洗5min；⑤在湿盒中用3％h2o2处理15-30min，充分除去组织内源性过氧化物酶活性；⑥pbs中洗三次，每次5min；⑦滴加封闭液(10％羊或兔血清)，室温封闭30min；⑧弃去封闭液，加适量一抗(封闭液配置)，用量以覆盖标本为准；⑨将玻片放入湿盒内，4℃冰箱孵育过夜；⑩第二天取出玻片，tbst洗三次，每次10min；滴加适量试剂1(透化剂，试剂盒所带)于组织位置，放入湿盒内，室温反应20min；tbst洗涤三次，每次5min；滴加相应抗性的二抗，放入湿盒内，室温孵育20-30min；tbst洗涤三次，每次5min；新鲜配置dab,用吸水纸吸干片子上多余的tbst，滴加适量dab显色反应液，一般为20-30μl，在显微镜下控制显色时间；pbs中泡洗玻片两次，每次5min；苏木素复染：在苏木素中染色1-2min，然后在自来水中反蓝5min，在显微镜下观察，如果染色过深，可在1％盐酸酒精中分色至满意为止，如果过浅，则继续蓝化；脱水：片子依次经50％-70％-80％-90％-95％-100％-100％梯度酒精脱水，每个梯度3-5min；二甲苯中浸泡透化20min；中性树脂封片，注意不能让二甲苯干涸后再封片，否则会有非特异性着色。2.3结果ihc结果如图4所示，在人源(h)和小鼠源(m)结直肠癌组织中进行免疫组化，igg组作为阴性对照，没有出现棕色阳性信号；rnf138抗体组，出现较强的棕色阳性信号，且没有背景信号干扰，抗体特异性强。100*和400*分别表示100倍和400倍镜下观察，拍照。3、免疫印迹实验(wb)3.1蛋白抽提收取细胞，离心，弃上清，取适量1×sds裂解液加入细胞样品沉淀中，剧烈振荡或用枪头吹打直至细胞彻底破裂变成粘稠透明液体，100℃煮样10min，4℃12,000rpm离心10min，吸取上清，注意根据不同的蛋白特性加入不同的抑制剂，比如检测磷酸化蛋白应加入磷酸酶抑制剂，易降解的蛋白则应加入蛋白酶抑制剂等，然后进行蛋白质定量。3.2蛋白定量①按试剂盒说明，将bsa(2mg/ml)进行稀释，得到一系列浓度梯度(0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2mg/ml)；②取待测样品2μl，加入18μl无菌ddh2o中进行10倍稀释；③取20μl梯度标准品与待测样品分别加入96孔板中；④按50倍体积试剂a和1倍体积试剂b的比例配制工作液，以每孔200μl工作液计算，上下颠倒充分混匀；⑤将200μl工作液加入96孔板中，温和振摇30s；⑥将96孔板置于55℃烘箱中反应7min，或者37℃反应30min，用酶标仪检测570nm/630nm波长对应各孔的吸光度；⑦将得到的标准曲线依据excel表格中的forecast函数进行求值，得到每个样品光吸收值相对应的蛋白浓度，还原稀释比例的倍数之后，即得到原始的蛋白浓度(单位：μg/μl)。3.3蛋白电泳，转膜与免疫印迹实验①电泳根据分子量大小选择合适浓度的sds-page胶，一般常用浓度为10％、12％与15％。将蛋白样品加至加样孔中之后，用恒压80v进行电泳，待样品进入分离胶后可以将电压调节至120-160v。对于易降解的样品，可以在电泳过程中采用冰水浴降低温度，减少电渗现象。②转膜电泳结束后，将凝胶在转膜缓冲液中平衡10～15min，然后采用湿法电转。准备好滤纸和pvdf膜(无水乙醇中激活)；打开转移盒并放置浅盘，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，在海绵上铺2层滤纸，然后将膜铺放在靠近电源正极的滤纸上，然后将胶小心的移动到膜上，然后加两层滤纸和海绵，形成“海绵-滤纸-凝胶-pvdf膜-滤纸-海绵”的模式，注意每层之间都不能有气泡；将冰盒装入缓冲液槽中，注满4℃预冷的转膜缓冲液；将整个装置放在冰浴中，电流为300ma，电转时间根据目的蛋白的大小和凝胶浓度确定。③封闭与杂交a.封闭：转膜结束后，将做好标记的转印膜用tbst漂洗两次，每次2min，然后加入适量封闭液，室温轻摇1～2h或4℃过夜，一般蛋白使用5％脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用5％bsa。封闭是为了用脱脂牛奶或bsa占据非特异性蛋白位点，增加抗体的特异性，降低背景；b.孵育一抗：将转印膜放入杂交袋内，按照0.1ml/cm2加入最适稀释度稀释的一抗，除尽气泡，封口，于4℃轻摇过夜或室温1～2h；c.洗涤：取出转印膜，用tbst漂洗3次，每次10min。洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅；d.孵育二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，按相应比例稀释，一般为1:10000，室温轻摇一小时；e.洗涤：用tbst漂洗3次，每次10min。④发光显色本实验室一般使用辣根过氧化物酶hrp-ecl发光法，实验操作过程如下：a.配制发光工作液：将两种显色底物1：1等体积混合(一般各1ml/membrane)；b.将工作液覆盖在膜表面避光反应1min；c.将膜固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒；d.根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果；e.将片子放入洗片机中依次通过显影液-定影液-h2o；f.收集片子，记录结果3.4结果western结果如图5所示，图5a-c显示了市售的兔源多克隆了抗体的wb图，从图中可以看出市售的针对rnf138的抗体的检测杂带多、特异性较差，而本申请的抗体无杂带，特异性强。4、免疫共沉淀实验(co-ip)4.1蛋白抽提：取出培养细胞的两个直径100mm培养皿，吸弃细胞培养液，用预冷的pbs洗涤3次，然后加入400μl～1ml预冷的netn(含cocktail和1mpmsf)，重悬细胞。4℃摇床放置30～40min裂解细胞；裂解结束后，4℃13,500rpm离心15～20min。轻柔地将上清溶液(总蛋白)移入预冷好的1.5mlep管中，做好标记，置于冰上，同时，取适量上清溶液制备input样品。核蛋白提取方法见inventtm胞质胞核分离试剂盒，目录号sc-003。4.2抗原-抗体结合①将剩余上清溶液平均分成2份，分别加入约1-4μg抗体或与抗体同源的igg，4℃摇床过夜孵育；②向抗原抗体复合物中加入预处理过的proteina/gbeads，4℃摇床继续孵育3h。③沉淀复合物的洗涤：孵育结束后，3000rpm离心30～60s收集沉淀复合物；吸去上清，在每个样品中轻柔地加入1ml预冷的netn，4℃摇床孵育10min；4℃3000rpm离心30s～1min收集沉淀复合物，小心吸去洗涤液；再重复3次上述洗涤过程，4℃3000rpm离心1～2min收集沉淀复合物，并尽可能地吸去残留洗涤液。4.3样品的制备：①在收集的沉淀物中加入30～50μl1×sds-pageloadingbuffer，震荡重悬沉淀；②100℃加热5min，使蛋白样品充分变性；③震荡重悬沉淀，室温12,000rpm离心5～10min，小心将上清移入新的1.5mlep管中(注意不要吸到beads)，直接上样检测或分装放-20℃待用。4.4上样检测：共沉淀样品上样量为15～25μl，input样品的上样量为总蛋白1/100左右。电泳、转膜和免疫印迹，方法见3.3。4.5结果细胞总蛋白进行免疫共沉淀，igg作为阴性对照进行co-ip，没有出现阳性条带；rnf138进行co-ip，出现较强的阳性条带，rnf138与trappc9相互作用，而与trappc3没有相互作用(图6a)。细胞核蛋白进行免疫共沉淀，igg作为阴性对照进行co-ip，没有出现阳性条带；rnf138进行co-ip，出现较强的阳性条带，h3为核蛋白marker，表示核蛋白提取成功，rnf138与trappc9相互作用，而与trappc3没有相互作用(图6b)。gapdh为蛋白内参，表示蛋白提取正常。实施例4单克隆抗体的应用根据实施例3的检测可知，单克隆抗体在wb、ihc、if、ip中具有较好的检测效果，同时对该单克隆抗体的检测浓度进行摸索，结果如表2所示。表2单克隆抗体的应用领域及推荐使用浓度应用领域推荐使用浓度检测样本源性wb1:500-1:2000human,mouseihc1:100-1:500human,mouseif1:100-1:200humanip1:50human上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>一种抗rnf138单克隆抗体的制备方法及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>186<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1asnvalthrargarggluargalacysprogluargalaleuaspleu151015gluasnilemetarglyspheserglysercysargcyscysalalys202530glnilelysphetyrargmetarghishistyrlyssercyslyslys354045tyrglnaspglutyrglyvalserserileileproasnpheglnile505560serglnaspservalglyasnserasnargsergluthrserthrser65707580aspasnthrgluthrtyrglngluasnthrserserserglyhispro859095thrphelyscysproleucysglngluserasnphethrargglnarg100105110leuleuasphiscysasnserasnhisleupheglnilevalproval115120125thrcysproilecysvalserleuprotrpglyaspproserglnile130135140thrargasnphevalserhisleuasnglnarghisglnpheasptyr145150155160glygluphevalasnleuglnleuaspglugluthrglntyrglnthr165170175alavalglugluserpheglnvalasnile180185当前第1页12