大鲵硫酸软骨素肽的制作方法

本发明涉及一种大鲵制品，尤其是一种从大鲵软骨中提取的具有降低高尿酸血症血清尿酸及保护线粒体作用的大鲵硫酸软骨素肽。

技术背景

硫酸软骨素（chondroitinsulfate,cs）广泛存在于动物（大鲵）的软骨及结缔组织中。硫酸软骨素是一种结构与分子量不均一的混合物，与核心蛋白通过共价键相连，以蛋白聚糖的形式存在。蛋白聚糖包括大分子聚集型胞外基质蛋白聚糖、小分子富含亮氨酸胞外基质蛋白聚糖以及夸膜胞内蛋白聚糖，这些蛋白聚糖均含有硫酸软骨素及核心蛋白。因此，制备硫酸软骨素肽时需要使用特异性的酶解工艺，使含有硫酸软骨素及核心蛋白的部分从软骨等基质组织中释放出来。目前多采用naoh对样品进行前处理、利用特异性或非特异性酶解、除蛋白、乙醇沉淀等步骤，可获得比较纯的硫酸软骨素，而一些未降解的肽与硫酸软骨素链相连就形成了硫酸软骨素肽。从结构上分析，硫酸软骨素肽具有多糖和肽，不同的多糖和肽形成不同分子结构的硫酸软骨素肽，而不同分子结构的硫酸软骨素肽具有不同的生物活性。

现有用于酶解制备硫酸软骨素肽的酶有胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及从微生物acinetobactersp.c26中制备的硫酸软骨素酶等多种，从不同的原料中得到的硫酸软骨素亦有多样：纯度为95%的葡萄糖醛酸含量40%（中国发明专利公开号cn103467621b）；相对分子量为75174da的硫酸软骨素肽（熊双丽，金征宇.硫酸软骨素肽的分离纯化和鉴定.食品科学，2006,27（4）：67-70）；硫酸软骨素寡糖（张静，张京良，朱常亮，等.酶法制备硫酸软骨素寡糖及其抗氧化活性.食品工业科技，2017,38（13）：48-52）。

近年来，随着大鲵人工养殖与繁殖技术的不断进步，在湖南、浙江、广州、江西、陕西、河南、湖北、辽宁、福建等地都形成了具有相当规模的大鲵人工养殖基地，对大鲵肉、皮、黏液的深加工都已经展开，但以大鲵骨为原料进行的深加工不多。中国发明专利公开号cn107964055a公开一种“大鲵软骨硫酸软骨素及其提取方法”，其制备方法包括取大鲵软骨样品，添加纯水、氢氧化钠和氯化钠溶液搅拌均匀，进行碱解过夜，并且需要盐酸调节经过碱解过夜的溶液ph至7.5～8.5，然后加入胰酶进行酶解，酶解过程中控制ph值在7.0～8.5、温度为40～45℃。所制备的硫酸软骨素中硫酸软骨素a/硫酸软骨素c为0.4-0.6，硫酸软骨素o在硫酸软骨素中的含量为15%质量比，重均分子量60kda-80kda，具有预防或治疗骨关节炎、调节血脂、预防或治疗血栓、预防或治疗心血管疾病、保护角膜胶原纤维、增强人体体质、或改善肌肤干燥等作用。所述大鲵软骨硫酸软骨素的制备过程需要使用对环境造成污染的强碱、强酸，加大废液处理的成本，通篇未涉及大鲵硫酸软骨素肽，更未见关于具有降低高尿酸及保护线粒体作用的大鲵硫酸软骨素肽的记载。

技术实现要素：

本发明为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种从大鲵软骨中提取的具有降低高尿酸血症血清尿酸及保护线粒体作用的大鲵硫酸软骨素肽。

本发明的技术解决方案是：一种大鲵硫酸软骨素肽，其特征在于依次按照如下步骤制备：

a.收集新鲜的大鲵软骨，在0～10℃条件下进行匀浆，得大鲵软骨匀浆；

b.向大鲵软骨匀浆中加入1～3倍体积ph7～8的0.01～0.1m磷酸缓冲液及与匀浆质量比为0.1～1％的脂酶，在30～40℃条件下，酶解12～48h；在9000rpm条件下离心20min，分离去除油脂层，得滤液；

c.向滤液中加入与滤液质量比为0.1～1％的bacilluscreus胞外胶原蛋白酶，在30～40℃条件下，酶解2～4h；在9000rpm条件下离心20min，得上清液；

d.将海洋低温碱性蛋白酶固定在截留分子量100000da聚砜膜反应器上，对所得到的上清液进行酶解，所得酶解液经过膜分离获得截留分子量小于100000da分子量的产物；

e.将所得产物进入截留分子量10000da的膜分离装置，收集截留分子量大于10000da的液体；

f.调节液体ph为3～5，室温静置12h，在9000rpm条件下离心20min，得上清液；

g.将所收集的上清液通过大孔吸附树脂及活性炭后冷冻干燥，制得大鲵硫酸软骨素肽。

本发明是以大鲵软骨为原料，通过脂酶酶解去除油脂，顺序利用bacilluscreus胞外胶原蛋白酶、固定在截留分子量100000da聚砜膜反应器上的海洋低温碱性蛋白酶，收集截留分子量大于10000da的未透过超滤膜的液体，离心、冷冻干燥，得到大鲵硫酸软骨素肽。无需使用强碱碱解及强酸调节ph，避免环境污染及降低废液处理的成本，所获得的大鲵硫酸软骨素肽具有降低高尿酸血症血清尿酸含量及保护线粒体的作用。

附图说明

图1是本发明实施例大鲵硫酸软骨素肽红外图谱。

具体实施方式

本发明的大鲵硫酸软骨素肽，其特征在于依次按照如下步骤制备：

a.收集新鲜的大鲵软骨，在5℃条件下进行匀浆，得大鲵软骨匀浆；

b.向大鲵软骨匀浆中加入2倍体积ph7的0.05m磷酸缓冲液及与匀浆质量比为0.5％的脂酶，所述脂酶的酶活力为20000u/g，在35℃条件下，酶解30h；在9000rpm条件下离心20min，分离去除表面油脂层，得滤液；

c.向滤液中加入与滤液质量比为0.5％的bacilluscreus胞外胶原蛋白酶，所述bacilluscreus胞外胶原蛋白酶的酶活力为2000u/mg，在35℃条件下，酶解3h；在9000rpm条件下离心20min，得上清液；

d.将酶活力为5000u/mg的海洋低温碱性蛋白酶固定在截留分子量100000da聚砜膜反应器上，对所得到的上清液进行酶解，所得酶解液经过膜分离获得截留分子量小于100000da分子量的产物；

e.将所得产物进入截留分子量10000da的膜分离装置，收集截留分子量大于10000da（未透过超滤膜）的液体；

f.用乙酸调节液体ph为4，室温静置12h，在9000rpm条件下离心20min，得上清液；

g.将所收集的上清液通过大孔吸附树脂及活性炭后冷冻干燥，制得大鲵硫酸软骨素肽，其红外图谱如图1所示。

实验：

一.降低高尿酸血症大鼠血清尿酸作用

取雄性wistar大鼠70只，随机分为空白组、模型组、苯溴马隆（benzbromarone）组、痛风定胶囊组、本发明实施例1大鲵硫酸软骨素肽高、中、低剂量组共7组。除空白组外，其余各组以腺嘌呤100mg/kg及乙胺丁醇250mg/kg灌胃，连续10d。同时分别给予苯溴马隆（benzbromarone）组、痛风定胶囊组、本发明实施例1大鲵硫酸软骨素肽高、中、低剂量组：苯溴马隆10mg/kg·d，痛风定胶囊0.56g/kg•d，本发明实施例1大鲵硫酸软骨素肽10g/kg、5g/kg、2g/kg，空白组、模型组给予等体积的蒸馏水，连续10d。末次给药后2h，各组大鼠采用水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血，分离血清。利用试剂盒测定大鼠血清尿酸（ua）、尿素氮（bun）以及黄嘌呤氧化酶（xod）含量。结果如表1。

表1

结果表明，大鲵硫酸软骨素肽高、中、低剂量组大鼠血清中的ua含量、xod活性以及bun较模型组均降低，说明本发明的大鲵硫酸软骨素肽具有降低高尿酸血症大鼠血清尿酸含量的作用，其降尿酸机理与抑制xod活性有关。

二.保护线粒体作用

新鲜牛心，于预冷的生理盐水中洗去血迹，用预冷的线粒体分离介质（0.25mol/l蔗糖，0.5mmol/ledta，3mmol/lhepes，ph7.4）匀浆，在1000g，4℃离心10min。取上清于12000g，4℃离心10min，得沉淀，再次溶于预冷的线粒体分离介质中，于12000g，4℃离心10min，得沉淀即为线粒体，悬于一定的预冷的线粒体分离介质中，冰浴中保存备用。bradford法测定线粒体蛋白质含量。

建立心肌线粒体的h2o2/fe²⁺自由基损伤模型。不同浓度的大鲵硫酸软骨素肽（高、中、低剂量）与0.5mg线粒体蛋白预先在37℃温育5min，然后加入50μmol/lfeso4和0.2mmol/l的l-cys，用ph7.4、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液(pbs)补充体积至1ml（空白参比管不加线粒体和药物），37℃温育30min后，加入20%三氯乙酸(tca)0.5ml终止反应，9000g离心10min，取1ml上清，加入1ml0.67%硫代巴比妥酸(tba)，100℃煮沸10min，以空白参比管调零，于532nm处测吸光度a，以1,1,3,3-四乙氧基丙烷为外标，经线性回归分析计算mda含量。结果如表2。

表2

表2的结果表明，大鲵硫酸软骨素肽高、中、低剂量组均对fe²⁺-l-半胱氨酸诱发的心肌线粒体mda生成有抑制作用。