一种提升微藻甘油三酯(TAG)产量的培养方法及其应用

一种提升微藻甘油三酯(tag)产量的培养方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种影响甘油三酯(tag)合成的功能基因和一种可高效提升微藻tag产量的培养方法，及其在高效提升微藻tag产量中的结合应用。


背景技术：

2.在当今“节能减排”理念的引导下，开发可再生能源成为热门的研究方向。生物燃料在可再生能源的发展中占据着重要地位，其中生物柴油更适合目前的内燃机，此外还拥有许多优于石油的特点，如降低一氧化碳排放以及提高燃烧效率等等。不同于生物乙醇和天然气，生物柴油可以利用目前成熟的石油运输系统进行高效配送，这为其大规模推广创造了有利条件。生物柴油主要来源于植物中的甘油三酯(tag)。理论上，如果大规模生产油料作物，必定能够满足当前的能源需求，然而这一举措也会产生诸多问题，包括与人争粮争地，以及提高净碳排放等等。在这种情况下，产油微藻成为生物柴油行业的重要关注对象。大多数微藻的tag单位产率高于陆生植物，据报道，某些微藻的tag含量占干重的75％以上，此外，微藻培养不占用耕地，且具有水上培养的潜在可能，海生藻更避免了与人争夺淡水的隐患，因此微藻产油具有十分乐观的前景。
3.然而，即便是产油微藻，其在培养条件良好时也不会积累tag，需要对其进行胁迫培养。目前最常用的胁迫方法是缺氮培养，分为自然缺氮和两步法缺氮两种，然而，自然缺氮需要长期培养，时间成本较高，两步法需要进行人为缺氮，虽可显著降低时间成本，但人力物力成本较高。综上所述，亟需开发一种低成本的、高效提升微藻tag产量的技术，以促进微藻生物柴油产业的发展。目前常用的方法有过程调控法和代谢工程法，其中过程调控法注重外因，具有盲目但见效快的特征；代谢工程法注重内因，具有理性但效果不够明显的特征，近年来用转录因子替代关键酶，很大程度上解决了效果问题，因此利用转录因子来高效提升微藻tag产量，已成为业界的发展方向。
4.微拟球藻作为工业产油微藻中的杰出代表，具有光合效率高、固碳能力强、tag含量高等诸多优点，因而是应用该方法的理想物种。前期研究发现，通过红光和蓝光照射10天，分别可使微拟球藻的脂含量较对照组提高26.9％和39.4％(sung，2018)，表明光质有可能成为高效提升微拟球藻tag产量的环境因素。此外，微拟球藻的转录因子预测及改造均已有报道(hu，2014；kang，2015)，为本技术的开发奠定了客观基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于发明一种具有甘油三酯(tag)合成调控功能的基因和一种可高效提升微藻tag产量的培养方法，及其在高效提升微藻tag产量的应用。
6.为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
7.一种影响甘油三酯(tag)合成的基因nobzip77，
8.1)具有seq id no 1所示的碱基序列；
9.或，
10.2)与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的dna序列。
11.所述基因所编码的蛋白，所述基因所编码的蛋白为具有下列情况之一的氨基酸序列：
12.1)具有seq id no 2所示的氨基酸序列；
13.2)通过将seq id no 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与seq id no 2的蛋白具有相同的生物学功能。
14.一种提升微藻甘油三酯(tag)产量的载体，所述载体中含导致nobzip77基因沉默的碱基序列。
15.所述载体以具有bspqi黏性末端的载体为骨架与由具有核酶基因和nobzip77 grna目标序列的单链引物退火形成的具有bspqi黏性末端的双链片段相结合，即为载体。
16.所述载体中具有seq id no 3所示的碱基序列。
17.一种微拟球藻基因工程株，该工程株基因组中含所述载体的nobzip77基因已沉默。所述宿主菌为微拟球藻工业藻株imet1。
18.一种可提高微藻tag产量的培养方法，将所述工程菌培养至培养液中，并施加30-50μmol photons m-2
s-1
的蓝光(445nm)，培养3-4天。
19.或；
20.1)使用所述的微拟球藻基因工程株；
21.且，
22.2)培养方法为：将工程菌株培养至含nano3浓度为2-4g/l的培养液中，施加30-50μmol photons m-2
s-1
的白光，培养9-12天，随后施加30-50μmol photons m-2
s-1
的蓝光(445nm)，培养3-4天。
23.上述培养液为f/2液体培养基。
附图说明
24.图1为本发明所用nobzip77的基因结构。
25.图2为本发明所用的含有nobzip77部分序列的敲除载体。
26.图3为本发明获得的敲除株nobzip77ko-1与野生imet1基因组序列比对结果。
27.图4为本发明中蓝光与白光照射下，野生imet1的tag产量在人工缺氮条件下的比较结果，星号表明t-test中p≤0.05。
28.图5为本发明中白光照射下，敲除株nobzip77ko-1与野生imet1的tag产量在正常培养条件下的比较结果，星号表明t-test中p≤0.05。
29.图6为本发明中人工缺氮条件下，白光处理野生imet1与蓝光处理敲除株nobzip77ko-1的tag产量比较结果，星号表明t-test中p≤0.05。
30.图7为本发明中正常条件下，白、蓝光理性处理敲除株nobzip77ko-1与白光处理野生imet1的tag产量比较结果，星号表明t-test中p≤0.05。
31.具体实施方法
32.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而
不用于限制本发明的范围。
33.本发明通过敲除位于微拟球藻工业藻株imet1(即，海洋微拟球藻(nannochloropsis oceanica)imet1由美国马里兰大学馈赠获得，并可向公众用于研究方向发放该菌株)核基因组的负调控转录因子的编码基因nobzip77，该基因及氨基酸序列为微藻中的首次报道，敲除上述基因，同时结合蓝光照射，能够实现高效、显著提升微拟球藻tag产量之目的。本发明分离出nobzip77基因的全长cdna序列，并利用微拟球藻的基因转化系统对其进行内源敲除，实验证明，敲除nobzip77能显著提高微拟球藻的tag产量。所公开的全长基因及氨基酸序列为微拟球藻中的首次报道，敲除上述基因能够显著提高微拟球藻合成tag的能力，证明了其在利用基因工程手段提高生物体生产tag方面的应用价值；本发明涉及的光质调控方法为微藻中的首次报道，能够高效提升微拟球藻的tag产量，证明了其在工业化产油微藻培养工艺改进方面的应用价值；此外，通过理性结合上述基因工程与培养方法进行微拟球藻的tag生产，可以取得较上述两种方法单独使用时显著加快的tag产量提升，因此该方法在生物能源及保健品行业均具有应用潜力。
34.下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(molecular cloning:a laboratory manual,3
rd ed.)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
35.实施例1：nobzip77基因的克隆与分析
36.利用pcr技术从微拟球藻imet1的cdna中克隆nobzip77基因，设计所用引物，交由上海生工合成：
37.1)nobzip77-for：
[0038]5’
atggaagggctaggacagc 3’；
[0039]
2)nobzip77-rev:
[0040]5’
ctatcccttcaaatgcatcc 3’。
[0041]
所用pcr仪为eppendorf公司的mastercycler，反应体系50μl，包括4μl dntp(2.5mm each，takara)，正反向引物各2μl(10μm)，5μl 10
×
buffer(mg
2+
plus，takara)，0.4μl rtaq酶(5u/μl，takara)，1μl野生imet1cdna模板(50ng/μl)，以及超纯水35.6μl。反应体系如下：起始94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃反应7min。
[0042]
反应结束后，取5μl pcr产物与1μl 6
×
loading buffer(takara)混匀，点入1％(w/v)的琼脂糖(biowest)凝胶中，在北京六一仪器厂生产的电泳系统上以120v电泳25min后，使用uvp公司的uv凝胶成像仪biochemihr进行观察、拍照。用omega公司的cycle-pure kit或gel extraction kit从pcr产物中纯化并回收目的片段，其操作完全按照说明书进行。
[0043]
将得到的纯化片段连入takara公司的pmd18-t载体中，并使用热激转化的方式将其转入全式金公司的大肠杆菌感受态细胞trans 5α中，阳性克隆送至invitrogen公司测序，最终得到nobzip77基因的全长编码区序列，参见序列表seq id no 1所示序列。此外，通过与基因组序列的比对，得到了nobzip77的基因结构，参见图1，该基因5’端和3’端各有一段侧翼序列，基因内部存在1个内含子。
[0044]
实施例2：nobzip77在海洋微拟球藻imet1中的敲除(一)敲除载体的构建
[0045]
参见图2。构建载体参考poliner等人的方法，具体如下：设计含有核酶基因和nobzip77 grna目标序列的单链引物，序列如下：
[0046]
1)g77-cas9-for：
[0047]5’
cgacaccgtctgatgagtccgtgaggacgaaacgagta agctcgtcacggtggtgaacaatggaggg 3’；
[0048]
2)g77-cas9-rev:
[0049]5’
aaaccctccattgttcaccaccgtgacgagcttactcgt ttcgtcctcacggactcatcagacggtg 3’。
[0050]
将上述两条引物通过梯度降落退火(95℃至25℃，每个循环降落0.1℃，保持1秒)，结合为具有bspqi黏性末端的双链片段，并连接到由美国密歇根州立大学poliner赠予的、同样具有bspqi黏性末端的pnoc-ars-crispr-v2载体骨架上，得到重组载体pxj630。
[0051]
(二)电穿孔法将载体pxj630导入微拟球藻
[0052]
在转化前1h，取浓度约为1-3
×
107cells/ml的对数生长期的微拟球藻藻液，4000g离心5min，弃上清，375mm山梨醇漂洗2次，用山梨醇调整细胞浓度到2
×
108cells/ml。将浓缩藻体分装为200μl的小份，同时选取pxj015空载体作为对照组，每份加入3μg pxj630载体,以及1μl 95℃变性处理1min的鲑鱼精dna(15μg/ml)，混匀后冰置10min。将混合物转移入2mm电击杯，以2200v(hv)，50μf进行电击，电击后立即将藻体转移入5ml新鲜f/2培养基。25℃摇床中100rpm，弱光复苏48h后，涂在含有5μg/ml zeocin的f/2平板上，以25℃，50μmol m-2
s-1
光照培养直至克隆长出。
[0053]
(三)微拟球藻nobzip77敲除株的分子鉴定
[0054]
将上述转化克隆挑至含有5μg/ml zeocin的f/2培养基中进行活化并提取其总dna进行pcr鉴定，所用引物序列如下：
[0055]
1)g77-cas9-dna-for：
[0056]5’
acgatgatgatgcctacggg 3’；
[0057]
2)g77-cas9
–
dna-rev:
[0058]5’
gaacttcttcctcacacggga 3’。
[0059]
所用pcr仪为eppendorf公司的mastercycler，反应体系50μl，包括4μl dntp(2.5mm each，takara)，正反向引物各2μl(10μm)，5μl 10
×
buffer(mg
2+
plus，takara)，0.4μl rtaq酶(5u/μl，takara)，1μl转化株的cdna模板(50ng/μl)，以及超纯水35.6μl。反应体系如下：起始94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃反应7min。
[0060]
反应结束后，取5μl pcr产物与1μl 6
×
loading buffer(takara)混匀，点入1％(w/v)的琼脂糖(biowest)凝胶中，在北京六一仪器厂生产的电泳系统上以120v电泳25min后，使用uvp公司的uv凝胶成像仪biochemihr进行观察、拍照。用omega公司的cycle-pure kit或gel extraction kit从pcr产物中纯化并回收目的片段，其操作完全按照说明书进行。回收产物送至invitrogen公司测序，并将测序结果与nobzip77基因组序列的比对，最终筛选到1株nobzip77ko-1，其与野生imet1测序结果的比对结果见图3，筛选株与微拟球藻工业藻株imet1野生型中nobzip77基因的501-521bp处序列acggtggtgaacaatggagg突变为acggtggtgaacaatg-agg，因此造成后续序列的移码突变，致使藻株中nobzip77基因沉默。
[0061]
(四)微拟球藻藻株的光质培养及tag产量测定
[0062]
1)微拟球藻藻株的光质培养及tag产量测定：
[0063]
微拟球藻野生imet1与敲除株nobzip77ko-1首先分别在25℃，光强为50μmol photons m-2
s-1
的白光下通无菌空气于f/2液体培养基中培养至od
750
＝3.0，常温3500g离心5min，弃上清后，将沉淀分别采用150ml的含氮或不含氮的f/2液体培养基重悬(所述含氮或不含氮的f/2液体培养基为将nano3添加至f/2液体培养基中，其中含氮量为2g/l)，经重悬后分别在光强为50μmol photons m-2
s-1
的白光或蓝光(445nm)照射下，25℃通无菌空气培养，在不同时间点取样，用于后续检测。
[0064]
tag产量测量采用拉曼光谱法(he，2017)，取上述缺氮-光质培养的微拟球藻样品各1ml，每个藻株设置3个生物学重复。常温3000g离心5min以收集藻体，用200μl去离子水洗3遍并重悬细胞，吸入石英毛细管(长50mm
×
宽1mm
×
高0.1mm,camlab,uk)后先进行漂白以去除色素，每个样品随机选取20个细胞，以532nm激光光源照射每个细胞1秒，获取393.8cm-3341.3cm之间的拉曼光谱，随后用labspec 5(horiba jobinyvon ltd.,uk)进行基线归一，进而用plsr模型(almeida，2010)将拉曼原始数据转化为tag产量。
[0065]
根据图4至图6所示的结果分析，得到如下结论：首先，在人工缺氮6h到264h之间，蓝光照射的tag产量比白光提高了3.6％-48.3％(图4)，表明蓝光较白光具有更好的tag产量促进作用；其次，在白光正常培养24h到264h之间，的tag产量比野生型提高了60.9％-184.5％，并在第9天(216h)到达峰值184.5％(图5)，表明敲除株较野生型具有更好的tag产量促进作用；再次，在人工缺氮72h和96h，蓝光处理敲除株的tag产量比白光处理野生型分别提高了35.3％和21.1％，并在第3天(72h)到达峰值35.3％(图6)，表明蓝光处理敲除株较白光处理野生型具有更好的tag产量促进作用。
[0066]
2)微拟球藻藻株的光质培养及tag产量测定：
[0067]
根据上述研究结果，设计实验：微拟球藻野生imet1与敲除株nobzip77ko-1首先分别在25℃，光强为50μmol photons m-2
s-1
的白光下通无菌空气于f/2液体培养基中培养至od
750
＝3.0，常温3500g离心5min，弃上清后，将沉淀分别采用150ml的含氮的f/2液体培养基重悬(所述含氮或不含氮的f/2液体培养基为将nano3添加至f/2液体培养基中，其中含氮量为2g/l)，经重悬后分别在光强为50μmol photons m-2
s-1
的白光照射下，25℃通无菌空气培养9天，随后在光强为50μmol photons m-2
s-1
的蓝光照射下，25℃通无菌空气培养3天，在不同时间点取样，用于后续检测(参见图7)。
[0068]
由图7可见，与白光培养12天的野生型相比，敲除株的tag产量提高了62.9％。综上所述，本发明提供了一种可高效提升微藻tag产量的技术方法，对工业化产油微藻培养工艺的改进提供了切实可行的思路。
[0069]
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
[0070]
seq id no1
[0071]
1401
[0072]
dna
[0073]
微拟球藻(nannochloropsis oceanica imet1)
[0074][0075]
seq id no：2
[0076]
466
[0077]
prt
[0078]
微拟球藻(nannochloropsis oceanica imet1)
[0079][0080][0081]
seq id no3
[0082]
12282
[0083]
dna
[0084]
pxj630
[0085]
[0086]
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091]
[0092]
[0093]
[0094]