CD47拮抗剂及其用途的制作方法

本发明涉及生物医学或生物制药
技术领域：
，更具体地涉及人抗cd47的抗体，及其编码序列、制备方法、组合物和应用。
背景技术：
：cd47也被称为整合素相关蛋白(integrinassociatedprotein，iap)，是免疫球蛋白超家族成员。cd47广泛的表达于细胞的表面，可与信号调节蛋白α(signalregulatoryproteinα,sirpα)、血小板反应蛋白(thrombospondin-1,tsp1)以及整合素(integrins)相互作用，介导凋亡、增殖、免疫等一系列的反应(maest,joosgf,brussellegg.amjrespircellmolbiol.2012；47(3):261-270)。人体需要20-30trillion的红细胞，以此保持氧气有效的运输到全身各处。红细胞的生命周期较短仅有120天，每小时有100亿的红细胞生成，也有无数衰老的红细胞被巨噬细胞吞噬清除。cd47是细胞表面一个重要的"self"标记，是调节巨噬细胞吞噬作用的一个重要信号。cd47可以与巨噬细胞表面sirpα结合，磷酸化其itim，随后招募shp-1蛋白，产生一系列的级联反应抑制巨噬细胞的吞噬作用。年轻的红细胞表达较高的cd47向巨噬细胞释放"自己人，别吃我"的信号，而衰老的红细胞cd47下调，最终被巨噬细胞所清除。肿瘤细胞有一系列躲避人体免疫系统追杀的方案，包括分泌免疫抑制因子、下调mhci表达，以及上调pd-l1抑制cd8+t细胞活性。聪明的肿瘤细胞当然不会放过cd47这个完美的掩体。不同的研究表明，几乎所有的肿瘤细胞和组织都高表达cd47，是对应正常细胞和组织的3倍。通过cd47这个"self"信号，肿瘤细胞有效的躲避了巨噬细胞的吞噬作用。肿瘤细胞上调cd47的表达，以此欺骗巨噬细胞。那么通过cd47抗体block这个"别吃我"的信号，使巨噬细胞发挥吞噬作用。cd47抗体治疗是通过dc细胞和cd8+t发挥肿瘤杀伤效应的。dc细胞通过cd47抗体和亲吞噬分子协同作用，吞噬肿瘤细胞，并提呈肿瘤相关抗原给cd8+t，进而发挥cd8+t对肿瘤的特异性杀伤作用。然而，目前在临床中或上市的cd47抗体，在抗体亲和力，免疫原性，副作用，抗肿瘤作用等方面仍存在不足，因此，亟待效果更佳的该靶点候选抗体开发。技术实现要素：本发明提供具有特异性结合cd47抗原的抗体及其制备方法和应用。为实现上述目的，本发明提供了结合人cd47的抗体或其抗原结合片段。本发明所述抗体或其抗原结合片段是指脱离人体或动物体的抗体或抗原结合片段，即分离的抗体或其抗原结合片段。在本发明的一个方面中，所述抗体或其抗原结合片段包括轻重链互补决定区(cdr)，所述cdr区选自以下任一组氨基酸序列：1)seqidnos:11-13所示的轻链互补决定区cdr1-cdr3和/或seqidnos:14-16所示的重链互补决定区cdr1-cdr3；2)seqidnos:19-21所示的轻链互补决定区cdr1-cdr3和/或seqidnos:22-24所示的重链互补决定区cdr1-cdr3；3)seqidnos:27-29所示的轻链互补决定区cdr1-cdr3和/或seqidnos:30-32所示的重链互补决定区cdr1-cdr3。在本发明的一个方面中，所述抗体或其抗原结合片段轻链包含轻链可变区(vl)，所述轻链包括seqidno:9或seqidno:16或seqidno:23所示的轻链可变区氨基酸序列或包括与上述轻链可变区氨基酸序列具有至少80％、85％或90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区；所述抗体或抗原结合片段重链包含重链可变区(vh)，所述重链可变区包括seqidno:10或seqidno:17或seqidno:24所示氨基酸序列或包括与上述重链可变区氨基酸序列具有至少80％、85％或90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区。优选地，所述抗体或抗原结合片段包含其包含选自以下任一组氨基酸序列：1)seqidno:9所示的氨基酸序列轻链可变区和/或包含与seqidno:10所示的氨基酸序列的重链可变区；2)seqidno:17所示的氨基酸序列轻链可变区和/或包含与seqidno:18所示的氨基酸序列的重链可变区；3)seqidno:25所示的氨基酸序列轻链可变区和/或包含与seqidno:26所示的氨基酸序列的重链可变区。本发明还提供了编码含有结合人cd47的抗体或其抗原结合片段的核酸序列。在本发明的一个方面中，所述编码含有结合人cd47的抗体或其抗原结合片段的核酸序列，是编码含有以下任一组氨基酸序列的抗体或抗原结合片段的核酸：1)seqidnos:11-13所示的轻链互补决定区cdr1-cdr3和/或seqidnos:14-16所示的重链互补决定区cdr1-cdr3；2)seqidnos:19-21所示的轻链互补决定区cdr1-cdr3和/或seqidnos:22-24所示的重链互补决定区cdr1-cdr3；3)seqidnos:27-29所示的轻链互补决定区cdr1-cdr3和/或seqidnos:30-32所示的重链互补决定区cdr1-cdr3。4)包含与seqidno:9或seqidno:17或seqidno:25所示的氨基酸序列具有至少80％、85％或90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区，和/或包含与seqidno:10或seqidno:18或seqidno:26所示的氨基酸序列具有至少80％、85％或90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区；5)seqidno:9所示的氨基酸序列轻链可变区和/或包含与seqidno:10所示的氨基酸序列的重链可变区；6)seqidno:17所示的氨基酸序列轻链可变区和/或包含与seqidno:18所示的氨基酸序列的重链可变区；7)seqidno:25所示的氨基酸序列轻链可变区和/或包含与seqidno:26所示的氨基酸序列的重链可变区。本发明还提供了含有编码特异性结合cd47的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的载体，优选地，所述载体是表达载体。本发明所述表达载体包括但不限于，病毒载体，如腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体等；非病毒载体，如质粒、转座子载体等。在本发明的一个方面中，所述有编码结合cd47的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的表达载体是质粒载体。优选地，所述含有编码特异性结合人cd47的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的质粒载体是pcdna3.4(lifetechnology)载体。本发明还提供了用于表达结合人cd47的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞，该宿主细胞含有编码特异性结合人cd47的抗体或其抗原结合片段的表达载体或编码特异性结合人cd47的抗体或其抗原结合片段的核酸。在本发明的一个方面中，表达结合人cd47的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、细菌细胞。优选地，本发明提供用于表达特异性结合人cd47的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞是hek293。本发明还涉及一种抗体检测试剂盒，所述抗体检测试剂盒包括以上任一所述结合cgrp抗原的抗体或其抗体片段。在本发明的一个方面中,所述检测试剂盒包括含有以下任一组氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段：1)seqidnos:11-13所示的轻链互补决定区cdr1-cdr3和/或seqidnos:14-16所示的重链互补决定区cdr1-cdr3；2)seqidnos:19-21所示的轻链互补决定区cdr1-cdr3和/或seqidnos:22-24所示的重链互补决定区cdr1-cdr3；3)seqidnos:27-29所示的轻链互补决定区cdr1-cdr3和/或seqidnos:30-32所示的重链互补决定区cdr1-cdr3。4)包含与seqidno:9或seqidno:17或seqidno:25所示的氨基酸序列具有至少80％、85％或90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区，和/或包含与seqidno:10或seqidno:18或seqidno:26所示的氨基酸序列具有至少80％、85％或90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区；5)seqidno:9所示的氨基酸序列轻链可变区和/或包含与seqidno:10所示的氨基酸序列的重链可变区；6)seqidno:17所示的氨基酸序列轻链可变区和/或包含与seqidno:18所示的氨基酸序列的重链可变区；7)seqidno:25所示的氨基酸序列轻链可变区和/或包含与seqidno:26所示的氨基酸序列的重链可变区。在本发明的一个方面中,所述抗体检测试剂盒还包括用于对cgrp抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。根据本发明的另一方面，还提供一种组合物，其包含上文所述结合人cd47的抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括以下中的一种或多种：药学上可接受的溶剂、分散剂、附加剂、塑形剂、药物辅料。根据本发明的另一方面，还提供上文所述的结合人cd47的抗体或其抗原结合片段在预防和/或治疗cd47相关疾病中的用途以及在制备预防和/或治疗cd47相关疾病药物中的用途。其中，所述cd47相关病症是癌症。本发明还提供了上文所述结合人cd47的抗体或其抗原结合片段在制备cd47相关病症诊断试剂中的应用。附图说明图1示出了六免后小鼠血清滴度。图2示出了流式细胞术检测anti-cd47抗体对raji细胞的结合灵敏度。图3示出了cd47抗体阻断cd47蛋白与sirp的结合。图4示出了cd47抗体对人rbc的血凝活性。图5示出了抗cd47抗体对巨噬细胞吞噬作用的影响图6示出了抗cd47抗体在b-hcd47/sirpα人源化小鼠mc38结肠癌动物模型中药效实验(给药后肿瘤体积变化)发明详情本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得一类抗cd47抗体，实验结果表明，本发明获得的cd47抗体能够有效阻断cd47与其受体之间的相互作用，令人意外的是，经本发明优化后的cd47抗体除能够有效阻断cd47与其受体之间的结合外，经鉴定，优化后抗体亲和力高，免疫原性低，且无凝血副作用，高诱导巨噬细胞肿瘤吞噬作用，高肿瘤的抑制活性等特点。在此基础上完成了本发明。本发明的抗体被设计为具有工程改造的cdr且具有人类来源的抗体的一些部分(框架、铰链区和恒定区的全部或部分)，所述部分与衍生自人类基因组序列的框架和恒定区相同或基本相同(基本是人类的)。全人类框架、铰链区和恒定区是那些人类种系序列以及具有天然存在的体细胞突变的序列和具有工程改造的突变的那些。本发明的抗体可包含框架、铰链或恒定区，其衍生自其中含有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加的全人类框架、铰链或恒定区。此外，本发明的抗体优选为在人类中基本上为非免疫原性的。本发明的抗体是igg类型抗体且具有经由链内和链间二硫键交联的“重”链和“轻”链。每一重链包含n-末端重链可变区hcvr(或vh)和重链恒定区(“hccr”)。每一轻链包含轻链可变区lcvr(或vl)和轻链恒定区(“lccr”)。hcvr和lcvr区可进一步细分为超变区(被称为互补决定区(“cdr”))，其散布于更保守的区域(被称为框架区(“fr”))。每一hcvr和lcvr由三个cdr和四个fr组成，其从氨基末端至羧基末端以下列顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。本文中，重链的三个cdr被称为“hcdr1、hcdr2和hcdr3”且轻链的三个cdr被称为“lcdr1、lcdr2和lcdr3”。cdr含有大多数与抗原形成特异性相互作用的残基。术语编码的“核酸”可以是包括编码的核酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的核酸。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的核酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述核酸可杂交的核酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc,0.1％sds,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的核酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos7、293细胞的动物细胞等。用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质中。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或肌肉注射等局部给药。本发明的抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与cd47相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对cd47的临床诊断和靶向治疗。具体实施方式参照以下实施例可以更好地理解本发明。但是，应理解，以下实施例仅用于举例说明目的，而不应被理解为以任何方式限制本发明的保护范围。实施例1.抗cd47单克隆抗体的产生1.1免疫方案用cd47-his(acrobiosystems，目录号cd7-h5227)或cd47-mfc(acrobiosystems，目录号cd7-h52a5)与弗氏佐剂乳化后免疫博安全人抗体转基因小鼠boan-hmab1。首次免疫使用弗氏完全佐剂，二免至六免使用弗氏不完全佐剂。本次共免疫20只小鼠，通过elisa检测血清滴度。以cbs包被液(ph9.6碳酸溶液)包被浓度为1ug/ml的蛋白cd47-his(acrobiosystems，目录号cd7-h5227)，100ul/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉37度封闭1h；用pbst将血清稀释至100x、500x、2500x、12500x，每孔加100ul。37度孵育1h；然后加入hrp-山羊抗人抗体(474-1006，kpl)，37度孵育1h，显色10min后，用2m浓硫酸终止，酶标仪上读取od450。选取9只血清滴度较高的小鼠加强免疫，3天后处死小鼠取出脾脏用于后续实验。鼠血清滴度如图1所示。1.2噬菌体库的建立取107个免疫小鼠的脾脏细胞，500g离心5min，去除培养基，加入50μlpbs重悬细胞，再加入1mltrizol，将细胞充分吹散，加入200μl氯仿，用力摇晃混匀1min，静置10-20min，4℃12000rpm离心20min，取上层水溶液于新的ep管中，每管可取出约550μl上清，然后加入等体积的异丙醇，混匀后-20℃放置20min，4℃12000rpm离心20min，这时可以看到有白色的沉淀在管底，倒掉溶液尽可能的将水溶液完全除去，加入1ml75％乙醇，4℃12000rpm离心5min，倒掉溶液，再加入1ml75％乙醇，4℃12000rpm离心5min，倒掉溶液并尽可能的将溶液去掉，如果还有溶液残留，可瞬时离心后用10微升的移液器将溶液吸走，室温放置1-2min，加入depc溶解。提取rna后通过试剂盒(transcriptorfirststrangcdnasynthesiskit货号：04897030001)反转录获得cdna，噬菌体库的建立步骤参照carlosf.barbasiii，phagedisplay：alaboratorymanual中记载的方法进行，用pcr的方法从cdna中获得重链和轻链的可变区，再将重链和轻链的可变区通过重叠延伸pcr的方法获得scfv，经凝胶纯化后的scfv用sfiⅰ(neb货号：#r0123l)50℃酶切反应5h后，再次溶液纯化，纯化后的50微升scfv片段与同是sfiⅰ线性化后的pcomb3x载体连接。将纯化后的连接产物1800v电压电转染至大肠杆菌tg1感受态细胞(lucigen货号：60502-2)中，用5mlrecoverymedium(lucigen货号：80026-1)重悬，将细胞悬液置于37℃，250rpm摇床中复苏1小时，取10微升用于计算库容，剩余溶液加入70ml2yt-ag(2yt培养基中加入终浓度2％葡萄糖水溶液与100ug/ml氨苄抗生素)培养基37℃，250rpm继续培养1.5h，取1ml测uv600，以每0.3od每ml菌体含有2.5*108个克隆计算，将vcsm13以20倍加入瓶内。37℃，静置30min,37℃，200rpm摇床中摇菌1小时。将摇好的菌液，转入离心管中，以4000rpm,10min离心，去上清，沉淀用100ml的2yt-ak(2yt培养基中加入终浓度100ug/ml氨苄抗生素与70ug/ml卡纳抗生素)培养基混匀，转入培养瓶内，30℃，250rpm摇床中过夜培养。将100ml2yt-ak培养基过夜表达的菌液转移到50ml离心管中10000rpm离心5min除去细菌沉淀，小心将上清转移至一新的离心管中，向上清中加入4％的peg8000，3％nacl混匀，冰上孵育1h。将孵育的上清13000rpm4℃离心35min，弃去上清并将离心管倒扣在吸水纸上。每个库加入3ml2yt培养基重悬噬菌体沉淀，混匀。将重悬的噬菌体6000g离心1min，除去细菌残片。上清通过0.2um滤器用注射器过滤至新的2ml离心管中，加入终浓度7％的dmso后混匀保存在-80℃。以编号为cd47q06的小鼠建立的噬菌体库cd47q06，库容6*108；以编号为cd47q19的小鼠建立的噬菌体库cd47q19，库容1.1*109。1.3噬菌体库筛选1.3.1平板筛选用cd47-his蛋白(acrobiosystems，cd7-h5227)以1μg/孔包被平板，4℃放置过夜，第二天通过2％bsa封闭平板1h，加入噬菌体库(2e12)孵育2h，洗涤4-10次后用elutionbuffer(ph2.2)洗脱cd47特异性结合的噬菌体。1.3.2磁珠筛选将cd47-mfc蛋白(acrobiosystems，cd7-h52a5)按照常规步骤进行生物素化(投入的cd47-mfc蛋白与生物素摩尔比1:2)，再与thermo的磁珠(invitrogendynabeadsm-280streptavidin，00355871)结合后与噬菌体库孵育，洗涤4-10次后用elutionbuffer(ph2.2)洗脱cd47特异性结合的噬菌体。将每一轮平板筛选和磁珠筛选洗脱得到的噬菌体混合在一起，扩增后继续下一轮淘洗，通过该方法获得cd47q1.2.9.12.19mix库。筛选后的克隆通过大肠杆菌表位scfv，elisa检测其与cd47的结合及对cd47/sirpα结合的阻断，保留结合并且有阻断活性的克隆。筛选获得的候选克隆及来源见下表表1候选cd47抗体来源表克隆来源库来源小鼠淘洗方法cd47qmix-136-igg4cd47q1.2.9.12.19mixcd47q1.2.9.12.19平板+磁珠筛选cd47qmix-189-igg4cd47q1.2.9.12.19mixcd47q1.2.9.12.19平板+磁珠筛选cd47q6-155-igg4cd47q6cd47q6平板+磁珠筛选cd47q19-210-igg4cd47q19cd47q19平板+磁珠筛选实施例2.阻断抗体的分子构建与生产将克隆cd47qmix-136\189、cd47q6-155、cd47q19-210(以下简称克隆“136/189/155/210”)送invitrogen生物技术有限公司测序，序列如表2所示。表2.候选克隆氨基酸序列经序列分析发现克隆155、克隆189与克隆210存在n糖基化位点，设计引物将其突变分别得到克隆155.1、189.1和210.1。克隆155.1经序列分析重链属于胚系基因ighv4-34家族，轻链属于胚系基因igkv4-1家族。各克隆氨基酸序列如下表3：表3.候选克隆氨基酸序列通过常规的分子生物学技术pcr(2*phantamaxmastermix厂家：vazyme货号：p515-aa批号：te211g8)扩增抗体可变区基因，借助重叠延伸pcr将信号肽与可变区基因连接，通过同源重组(clonexpressⅱonestepcloningkit厂家：vazyme货号：c112-01批号：te211l8)分别将抗体重链基因连接入带有抗体fc序列的载体pcdna3.4(lifetechnology)，将抗体轻链基因连接入带有抗体轻链恒定区序列的载体pcdna3.4。将测序后的阳性克隆提取质粒后共转染进入hek293细胞在37℃\8％co2\125rpm摇床中培养，瞬时表达7天后上清通过proteina亲和层析，纯化获得cd47抗体，并通过uv280结合理论消光系数确定抗体浓度。重链恒定区氨基酸序列：astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk-轻链恒定区氨基酸序列：rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec-对照抗体生产：通过imgt数据库及专利(wo2011/143624a3)确定fortyseven的cd47抗体hu5f9-g4的氨基酸序列，全基因合成后插入载体pcdna3.4通过hek293细胞表达，生产的抗体命名为cd47-fs-igg4。抗体序列如下：cd47-fs-igg4重链序列：qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftnynmhwvrqapgqrlewmgtiypgnddtsynqkfkdrvtitadtsastaymelsslrsedtavyycarggyramdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk-cd47-fs-igg4轻链序列：divmtqsplslpvtpgepasiscrssqsivysngntylgwylqkpgqspqlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycfqgshvpytfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec-实施例3.候选抗体的表征3.1fortebio检测候选抗体与cd47蛋白的亲和力抗体结合动力学使用基于生物膜干涉技术(biolayerinterferometrybli)octetred96仪器测量。将抗体(10μg/ml)偶联到proabiosensors上，loading高度为1nm，将cd47用pbst进行2倍连续稀释，25nm起始，并设置0浓度，association时间设置为300s，dissociation时间设置为300s。检测结束后使用1:1model的curvefitting计算结合常数(kon)、解离常数(kdis)，平衡解离常数(kd)以比率kd/ka计算。结果见表4，四个候选抗体的亲和力与对照抗体相比，除cd47q19-210.1-igg4的kd与对照抗体近似外，其他各候选抗体kd值均高于对照抗体。表4.cd47抗体亲和力检测loadingsampleidkd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)cd47-fs-igg48.86e-094.97e+054.40e-03cd47qmix-136-igg42.15e-096.31e+051.36e-03cd47q6-155.1-igg43.64e-096.99e+052.54e-03cd47qmix-189.1-igg45.30e-096.40e+053.40e-03cd47q19-210.1-igg48.81e-096.24e+055.50e-033.2流式检测候选抗体与cd47细胞的结合96孔圆底板中，加入50μlraji细胞，细胞数为5e4个/孔，用facsbuffer(无菌pbs，0.2％bsa)梯度稀释各抗体，按50μl/孔加入96孔圆底板中，4℃孵育1h。2000rpm离心3min后弃上清，用facsbuffer洗2次，加入100μl/孔荧光二抗(southernbiotech，2040-09)，终浓度1μg/ml，4℃孵育1h，2000rpm离心3min后弃上清，用facsbuffer洗2次后用100μl/孔facsbuffer重悬，用流式细胞仪(艾森，novocyte2060)进行检测。结果如图2所示，四个候选抗体与raji细胞的结合能力均强于对照抗体。3.3elisa检测抗体阻断cd47蛋白与sirp的结合用ph9.6cbs稀释sirp蛋白(sinobiological,目录号：11612-h08h)至0.4μg/ml，包被酶标版(苏州海狸，40301)，100μl/孔，4℃孵育过夜；洗板后用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；洗板后分别加入pbst(pbs+0.05％tween20)稀释不同浓度(9.52pm、4.76pm、2.38pm、1.19pm、0.595pm、0.2975pm、0.14875pm、0.074375pm)抗体，50μl/孔，然后加入标记有生物素(1:5)的cd47-fc蛋白(终浓度0.03μg/ml)，50μl/孔，37℃孵育1h；洗板后加入pbst稀释的strep/hrp(r&d，目录号：890803)，100μl/孔，37℃孵育1h。洗板后加入tmb(北京梅科万德生物，目录号：1001)显色，10min后每孔加入50μl2mh2so4终止显色，酶标仪上读取od450。如图3所示，四个候选抗体的阻断效果均明显好于对照抗体。3.4血凝实验检测抗体活性cd47的抗体在临床上的副作用是非常棘手的问题。将2％人rbc(红细胞，博尔西科技)1500rpm离心3min，用dpbs洗涤一遍，重新加入dpbs配置成8％rbc悬液，使用pbs缓冲液将待测抗体配置成不同浓度(0，0.01，0.03，0.08，0.23，0.7，2.1，6.2，18.5，55.6，166.7，500μg/ml)样品，并与人rbc以50μl+50μl体积混匀后置于96浅孔板中，4℃静置2h，取出观察凝集情况。如图4所示，cd47-fs在6.2、2.1、0.7、0.23、0.08μg/ml时可见明显血凝现象，136、155.1、189.1和210.1无明显血凝现象，4个候选抗体预期在人体临床上不会引起血凝，从而有相比cd47-fs更高的安全性。3.5facs检测巨噬细胞诱导的吞噬实验委托中美冠科完成的流式细胞仪检测巨噬细胞诱导的吞噬实验，每孔加入45μl的m1巨噬细胞和45μlcfse标记的肿瘤细胞(巨噬细胞：肿瘤细胞＝1:1)至96孔u型细胞培养板。分别加入10μl待测药物至对应的细胞孔，使得待测药物的工作浓度为20μg/ml、5μg/ml、1.25μg/ml、0.31μg/ml、0.08μg/ml、0.02μg/ml。每个药物浓度设计两个复孔，混匀后置于37℃、5％co2培养箱中孵育2小时。(阳性对照抗体只选用1个浓度进行实验)重悬细胞，加入100μlfacs缓冲液清洗细胞两次。每孔加入80μlfacs缓冲液重悬细胞，加入20μl的人fc封闭试剂。混匀后置于4℃避光孵育15分钟。每孔加入5μlapcanti-humancd206，轻轻混匀后置于4℃，避光孵育30分钟。将培养板置于离心机，1200rpm，4℃离心5分钟。弃掉上清，加入200μl预冷facs缓冲液至培养板并重悬细胞，1200rpm，4℃离心5分钟。重复一次。每管加入200μlfacs缓冲液重悬细胞，并加入10μl7-aad轻轻混匀后置于室温(25℃)避光孵育5分钟。用流式细胞仪分析样本。产生的电子数据用flowjo10或kaluza软件进行分析。根据流式散点图分析的数据，按下列公式计算各药物处理组的巨噬细胞吞噬指数。具体结果如图5所示，整体上，候选抗体cd47q6-155.1-igg4与对照抗体具有相近的吞噬指数，0.31μg/ml浓度下，其吞噬指数高于对照抗体。实施例4抗cd47抗体在b-hcd47/sirpα人源化小鼠mc38-hcd47结肠癌模型中的药效学研究通过北京百奥赛图的b-hcd47/sirp人源化小鼠接种小鼠结肠癌mc38细胞建立小鼠结肠癌动物模型进行anti-cd47抗体的体内药效研究。小鼠结直肠癌mc38细胞购自舜冉上海生物科技有限公司，细胞培养在37℃、5％co2的培养箱中，培养基成分为含有10％灭活胎牛血清的dulbecco'smodifiedeagle'smedium培养基。北京百奥赛图基因生物技术有限公司对mc38细胞进行了基因改造，使其过表达人源cd47，同时敲除鼠源cd47，该细胞被命名为mc38-hcd47细胞。将pbs重悬的mc38-hcd47肿瘤细胞以1×106个/0.1ml浓度，0.1ml/只体积接种于b-hsirpa/hcd47人源化小鼠的右侧皮下。当平均肿瘤体积达到大约100-150mm3时，挑选个体肿瘤体积适中的小鼠入组，将动物按肿瘤体积随机分配到8个实验组中，每组5只，分组当天开始给药。抗体对小鼠肿瘤体积增长的抑制结果如图6所示，候选抗体cd47q6-155.1-igg4对肿瘤的抑制作用要优于对照抗体。序列表<110>山东博安生物技术有限公司<120>cd47拮抗剂及其用途<130>1<160>32<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>113<212>prt<213>homosapiens<400>1aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly151015gluargalathrileasncyslysserserglnservalleutyrser202530serasnasnlysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln354045proprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval505560proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr65707580ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglngln859095tyrtyrserthrprotrpthrpheglyglnglythrlysvalgluile100105110lys<210>2<211>122<212>prt<213>homosapiens<400>2glnvalglnleuglnglntrpglyalaglyleuleulysproserglu151015thrleuserleuthrcysthrvalseraspgluserpheargglytyr202530tyrtrpsertrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile354045glyaspileleuhisserglyilethrasptyrasnproserleulys505560serargvalthrileservalaspserserlysasnglnpheserleu65707580lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala859095argserilethrlysvalargglyvalargglyleupheasntyrtrp100105110glyglnglythrleuvalthrvalserser115120<210>3<211>12<212>prt<213>homosapiens<400>3glnservalleutyrserserasnasnlysasntyr1510<210>4<211>3<212>prt<213>homosapiens<400>4trpalaser1<210>5<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>5glnglntyrtyrserthrprotrpthr15<210>6<211>8<212>prt<213>homosapiens<400>6aspgluserpheargglytyrtyr15<210>7<211>7<212>prt<213>homosapiens<400>7ileleuhisserglyilethr15<210>8<211>16<212>prt<213>homosapiens<400>8alaargserilethrlysvalargglyvalargglyleupheasntyr151015<210>9<211>107<212>prt<213>homosapiens<400>9aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglyasniletyrasntyr202530leualatrptyrglnglnlysglnglylysvalproglnleuleuile354045tyrasnalalysthrleualagluglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspvalalathrtyrtyrcysglnhisphetrpserserprotrp859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105<210>10<211>122<212>prt<213>homosapiens<400>10glnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyarg151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasntyr202530alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045thrleuilesertyraspglyserargglutyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleuargthrgluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasnargleuargtyrpheasptrpproleupheasptyrtrp100105110glyglnglythrleuvalthrvalserser115120<210>11<211>6<212>prt<213>homosapiens<400>11glyasniletyrasntyr15<210>12<211>3<212>prt<213>homosapiens<400>12asnalalys1<210>13<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>13glnhisphetrpserserprotrpthr15<210>14<211>8<212>prt<213>homosapiens<400>14glyphethrpheserasntyrala15<210>15<211>8<212>prt<213>homosapiens<400>15ilesertyraspglyserargglu15<210>16<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>16alaargasnargleuargtyrpheasptrpproleupheasptyr151015<210>17<211>113<212>prt<213>homosapiens<400>17aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly151015gluargalathrileasncyslysserserglnservalleutyrser202530serasnasnlysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln354045proprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval505560proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr65707580ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglngln859095tyrtyrserthrprophethrpheglyproglythrlysleugluile100105110lys<210>18<211>122<212>prt<213>homosapiens<400>18glnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyarg151015serleuargleusercysalaglyhisglyphethrpheserasnhis202530glyilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alavalileserproaspglyserasnlysasntyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasplysvalargtyrpheasntrpleupheproglyphetrp100105110glyglnglythrthrvalthrvalserser115120<210>19<211>12<212>prt<213>homosapiens<400>19glnservalleutyrserserasnasnlysasntyr1510<210>20<211>3<212>prt<213>homosapiens<400>20trpalaser1<210>21<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>21glnglntyrtyrserthrprophethr15<210>22<211>8<212>prt<213>homosapiens<400>22glyphethrpheserasnhisgly15<210>23<211>8<212>prt<213>homosapiens<400>23ileserproaspglyserasnlys15<210>24<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>24alaargasplysvalargtyrpheasntrpleupheproglyphe151015<210>25<211>114<212>prt<213>homosapiens<400>25aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly151015gluargalathrileasncyslysserserglnservalleuserser202530serasnasnlysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln354045proprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval505560proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthr65707580ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglngln859095tyrtyrserthrproprotrpthrpheglyglnglythrlysvalglu100105110ilelys<210>26<211>122<212>prt<213>homosapiens<400>26glnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyarg151015serleuargleusercysalaglyhisglyphethrpheserasntyr202530glyilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alavalileserproaspglyserasnlystyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasplysvalargtyrpheasntrpleupheproglyphetrp100105110glyglnglythrthrvalthrvalserser115120<210>27<211>12<212>prt<213>homosapiens<400>27glnservalleuserserserasnasnlysasntyr1510<210>28<211>3<212>prt<213>homosapiens<400>28trpalaser1<210>29<211>10<212>prt<213>homosapiens<400>29glnglntyrtyrserthrproprotrpthr1510<210>30<211>8<212>prt<213>homosapiens<400>30glyphethrpheserasntyrgly15<210>31<211>8<212>prt<213>homosapiens<400>31ileserproaspglyserasnlys15<210>32<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>32alaargasplysvalargtyrpheasntrpleupheproglyphe151015当前第1页12